0843
Monoclonal Mouse
Anti-Cytomegalovirus
Cloni CCH2 + DDG9
Codice N. M0854
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro
Monoclonal Mouse Anti-Cytomegalovirus, cloni CCH2 + DDG9, è destinato per l’uso in immunoistochimica.
L’anticorpo marca le cellule infettate dal citomegalovirus umano (HCMV) ed è un aiuto efficace
nell’identificazione dell’infezione da HCMV nei tessuti umani (1, 2). L’interpretazione clinica di un’eventuale
colorazione o della sua assenza deve essere integrata mediante studi morfologici avvalendosi di controlli adeguati
e deve essere valutata nell’ambito dell’anamnesi del paziente e di altri test diagnostici da parte di un patologo
qualificato.
Cenni e spiegazioni
Il citomegalovirus umano è un herpes virus ubiquitario. L’infezione primaria si verifica generalmente
nell’infanzia ed è per lo più asintomatica. Dopo la prima esposizione il virus determina un’infezione che dura
tutta la vita. Nei neonati e in individui immunocompromessi, quali i pazienti affetti da AIDS e riceventi trapianti,
il HCMV può determinare gravi infezioni, che comportano il rischio di vita, ed è la causa più comune di difetti
virali congeniti (5, 6). Il virus impedisce la capacità di riattivazione che può verificarsi in seguito a trasfusioni, a
gravidanza, a trapianto di organi solidi o di midollo osseo, a terapia immunosoppressiva o ad altre infezioni
virali (3, 5). Il HCMV è responsabile dell’infezione di leucociti, cellule endoteliali, cellule del tessuto connettivo e
cellule epiteliali e viene trasmesso attraverso la maggior parte dei liquidi corporei (5).
I membri della famiglia dell’herpes virus sono implicati nell’eziologia di numerosi tumori nell’uomo. Il HCMV è
stato associato al carcinoma cervicale, agli adenocarcinomi della prostata e del colon e al sarcoma di Kaposi.
È stato dimostrato che le infezioni da HCMV modulano l’espressione di diverse proteine coinvolte nella
regolazione del ciclo cellulare e dell’ apoptosi (5).
Reagente fornito
Una miscela di due anticorpi monoclonali di topo fornita in forma liquida come supernatante di coltura cellulare
dializzata contro Tris/HCl 0,05 mol/L, pH 7,2 e contenente 15 mmol/L NaN3.
Cloni: CCH2 e DDG9 (3). Isotipi: IgG1, kappa (CCH2) e IgG2a, kappa (DDG9).
Concentrazione di IgG di topo: vedere l’etichetta sulla fiala.
Immunogeno
Lisati di cellule grezze da fibroblasti embrionali umani infettati da virus del ceppo del citomegalovirus Ad169 (3).
Specificità
L’anticorpo CCH2 reagisce con una proteina nucleare precoce identica alla proteina p52 non strutturale con
caratteristiche DNA binding (7). Più di 200 isolati di CMV umano sono stati tipizzati con successo da questo
anticorpo che, pertanto, sembra riconoscere un epitopo conservato molto bene tra i ceppi di HCMV (3, 4).
L’anticorpo DDG9 reagisce con una nucleoproteina precoce di circa 76 kDa (3).
Per gli anticorpi, la reattività continua dunque a livelli avanzati durante l’infezione da HCMV, in cui la
localizzazione è meno distintamente nucleare e pare essere nel citoplasma. Il microscopio laser confocale
mostra, tuttavia, che la reazione è limitata alla membrana nucleare (3).
Gli anticorpi non sono responsabili di una reazione crociata con l’adenovirus, l’herpes simplex virus e il virus
della varicella zoster (3).
Precauzioni
1. Per operatori specializzati.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), sostanza chimica altamente tossica allo stato puro. Alle
concentrazioni indicate, il prodotto non è classificato come pericoloso, ma la sodio azide potrebbe reagire con
le tubature in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Per lo smaltimento del prodotto è
consigliabile sciacquare abbondantemente per prevenire la formazione di azidi metalliche nelle tubature.
3. Come per ogni prodotto di derivazione biologica, utilizzare procedure di manipolazione adeguate.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia
Conservazione
Conservare a 2-8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti non sono
conservati secondo le condizioni prescritte, è necessario che l’operatore ne verifichi le condizioni. Non vi sono
segni inequivocabili che indicano l’instabilità di questo prodotto. È pertanto necessario eseguire
contemporaneamente controlli positivi e controlli negativi sui campioni dei pazienti. Se si osserva una
colorazione inattesa, non riconducibile all’applicazione di procedure di laboratorio diverse, e se si sospetta un
problema con gli anticorpi, contattare il nostro Servizio Technico.
Preparazione dei campioni
Sezioni di tessuto incluse in paraffina: l’anticorpo può essere usato per marcare sezioni di tessuto incluse in
paraffina o di pellet cellulari fissate in formalina. Si consiglia di effettuare il pretrattamento dei tessuti con la
tripsina (1) o lo smascheramento termoindotto dell’epitopo. Per lo smascheramento termoindotto dell’epitopo
(103059-003)
M0854/IT/KRM/07.08.08 p 1/3
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sono stati ottenuti ottimi risultati con la Soluzione di riconoscimento bersaglio Dako, pH elevato, codice nr.
S3308. Risultati meno ottimali sono stati ottenuti con la Soluzione di riconoscimento bersaglio Dako, codice nr.
S 1700, il tampone citrato 10 mmol/L, pH 6,0 o il tampone Tris 10 mmol/L, EDTA 1 mmol/L, pH 9,0 e
pretrattamento di tessuti con proteinasi K. Le sezioni di tessuto non devono seccare durante il trattamento o
durante la successiva procedura di colorazione immunoistochimica.
Sezioni congelate e preparazioni cellulari: l’anticorpo può essere usato per marcare le preparazioni di cellule
infettate fissate per 10 minuti in metanolo freddo (3, 4).
Procedura di colorazione
Diluizione: Il Monoclonal Mouse Anti-Cytomegalovirus, codice nr. M0854, può essere usato a un range di
diluizione di 1:50-1:100, se applicato a sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina di fibroblasti cutanei
umani infettati da HCMV e usando per 20 minuti lo smascheramento termoindotto dell’epitopo nella soluzione
di riconoscimento bersaglio Dako, pH elevato, codice nr. S3308 e incubando per 30 minuti a temperatura
ambiente con l’anticorpo primario. Le condizioni ottimali variano sulla base del campione e del metodo di
preparazione e devono essere determinate da ogni singolo laboratorio. Il controllo negativo consigliato è una
miscela di 2 parti di IgG1 di topo Dako, codice nr. X 0931, 1 parte di IgG2a di topo Dako, codice nr. X0943 e
una parte di diluente, diluita alla stessa concentrazione di IgG di topo come l’anticorpo primario. Se non sono
stati determinati la stabilità dell’anticorpo diluito e del controllo negativo nella procedura di colorazione in corso,
si consiglia di diluire questi reagenti immediatamente prima dell’uso o di diluirli nel diluente per anticorpi, codice
nr. S0809. I controlli positivi e negativi devono essere effettuati contemporaneamente sui campioni dei pazienti.
Visualizzazione: Si consigliano il kit Dako LSAB™+/HRP, codice nr. K0679, e i kit Dako EnVision™+/HRP,
codice nr. K4004 e K4006. Per le sezioni congelate e le preparazioni cellulari, il kit Dako APAAP, codice nr.
K0670, è una valida alternativa, se si verificano problemi con la colorazione specifica della perossidasi
endogena. Seguire la procedura allegata al kit di visualizzazione selezionato.
Caratteristiche Specifiche
della Performce
Le cellule marcate dall’anticorpo mostrano un pattern di colorazione nucleare all’inizio dell’infezione da HCMV.
A livelli successivi è possibile osservare un evidente pattern di colorazione citoplasmatica (3).
Tessuto normale: screening di tessuti umani normali da donatori non affetti da HCMV con l’anticorpo CCH2
non mostravano alcuna reazione con cuore, polmoni, fegato, rene, milza, linfonodi, tonsille, midollo osseo,
muscolo scheletrico, cervello, tiroide, paratiroide, pancreas e ghiandola surrenale (1).
Tessuti anomali: in tessuti infettati da HCMV, l’anticorpo CCH2 marcava le cellule nei polmoni, fegato, reni,
linfonodi, cervello, tiroide e paratiroide (1).
Gli anticorpi CCH2 e DDG9 marcavano i tessuti infettati da HCMV dell’esofago, dello stomaco, dell’intestino tenue,
del colon, della cistifellea, dei polmoni, della ghiandola surrenale, delle ovaia e dei tessuti neurali (2).
L’anticorpo CCH2 mostrava una sensibilità alla rilevazione dell’infezione da HCMV pari al 85% e una specificità
pari al 96% se applicato a colture cellulari 24 ore dopo l’inoculazione con campioni di urina di 160 pazienti
sottoposti a trapianto di reni. La sensibilità era comparabile a quella ottenuta mediante isolamento del virus (4).
La sensibilità di rilevazione dell’antigene precoce del HCMV in coltura cellulare in seguito a breve incubazione
aumenta, se l’anticorpo CCH2 e l’anticorpo DDG9 sono usati insieme (3).
Riferimenti bibliografici
1. Niedobitek G, Finn T, Herbst H, Gerdes J, Grillner L, Landqvist M, et al. Detection of cytomegalovirus by in
situ hybridisation and immunohistochemistry using new monoclonal antibody CCH2: a comparison of
methods. J Clin Pathol 1988;41:1005-9.
2. Saiz E, Lubin J, Robinson MJ. The modified Steiner stain: a new use for an old stain? Staining
cytomegalovirus-infected cells in gastrointestinal biopsies. Histochem J 1998;30:549-52.
3. Wirgart BZ. Development of rapid methods for early diagnosis of cytomegalovirus infections [dissertation].
Stockholm:Karolinska Hospital; 1991.
4. Wirgart BZ, Landqvist M, Hökeberg I, Eriksson B-M, Olding-Stenkvist E, Grillner L. Early detection of
cytomegalovirus in cell culture by a new monoclonal antibody, CCH2. J Virol Methods 1990;27:211-20.
5. Doniger J, Muralidhar S, Rosenthal LJ. Human cytomegalovirus and human herpesvirus 6 genes that
transform and transactivate. Clin Microbiol Rev 1999;12:367-82.
6. Jarvis MA, Nelson JA. Human cytomegalovirus persistence and latency in endothelial cells and
macrophages. Curr Opin Microbiol 2002;5:403-7.
7. Plachter B, Nordin M, Wirgart BZ, Mach M, Stein H, Grillner L, et al. The DNA-binding protein P52 of
human cytomegalovirus reacts with monoclonal antibody CCH2 and associates with the nuclear membrane
at late times after infection. Virus Res 1992;24:265-76.
(103059-003)
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