Dako Autostainer/Autostainer

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
CD45, Leucocyte Common Antigen
Clones 2B11 + PD7/26
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Codice IS751
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human CD45, Leucocyte Common Antigen, Clones 2B11 + PD7/26, Ready-to-Use,
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) è destinato per essere utilizzato nell’immunocitochimica congiuntamente a
strumenti Dako Autostainer/Autostainer Plus. Questo anticorpo marca CD45 sia in cellule normali che in cellule
neoplastiche ed è utile per identificare cellule di origine linfoide (1–3). L’interpretazione clinica di un’eventuale
colorazione o della sua assenza deve essere integrata mediante studi morfologici avvalendosi di controlli adeguati e
deve essere valutata nell’ambito dell’anamnesi del paziente e di altri test diagnostici da parte di un patologo
qualificato.
Sinonimi per l'antigene
T200 (4), Ly-5 (5).
Cenni e spiegazioni
La glicoproteina transmembrana CD45 è espressa nella maggioranza delle cellule nucleate di origine ematopoietica.
La proteina CD45, codificata da un unico gene mappato sul cromosoma 1, è presente in varie isoforme che si
distinguono per il diverso splicing degli essoni 4, 5 e 6. Nei leucociti umani sono state identificate ben cinque
isoforme diverse della proteina CD45, denominate ABC, AB, BC, B e 0. Queste isoforme vengono riconosciute dagli
anticorpi anti-CD45RA, anti-CD45RB, anti-CD45RC e anti-CD45R0. Le isoforme variano in Mr da 180.000
a 220.000. Tutte le isoforme CD45 condividono lo stesso segmento intracellulare, in cui è stata dimostrata l’attività
di tirosina fosfatasi. Vari leucociti esprimo le isoforme CD45, pertanto i linfociti T esprimono le isoforme CD45
che corrispondono al loro stadio di sviluppo e attivazione, i linfociti B esprimono prevalentemente l'isoforma ABC
e i monociti e le cellule dendritiche esprimono prevalentemente le isoforme B e 0. I granulociti esprimono
principalmente le isoforme B e 0 (4).
Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining della Dako o alle istruzioni sul sistema
di rilevazione per le procedure IHC per: (1) Principio della procedura, (2) Materiali necessari ma non forniti,
(3) Conservazione, (4) Preparazione dei campioni, (5) Procedura per la colorazione, (6) Controllo della qualità,
(7) Risoluzione dei problemi, (8) Interpretazione della colorazione, (9) Limiti generali.
Reagente fornito
Anticorpo di topo monoclonale pronto per l’uso fornito in forma liquida in un tampone contenente la proteina
stabilizzante e 0,015 mol/L sodio azide.
Clone: 2B11 (1) e PD7/26 (1). Isotipo: IgG1, kappa
Immunogeno
2B11: Cellule neoplastiche isolate da un caso di linfoma/leucemia dei linfociti T (1).
PD7/26: I linfociti del sangue umano periferico si mantenevano nel fattore di crescita dei linfociti T (1).
Specificità
Anti-CD45 è un misto di due anticorpi monoclonali, i cloni 2B11 e PD7/26, diretto contro epitopi diversi. Il clone 2B11
è stato classificato nel cluster come anti-CD45 al Third International Workshop and Conference on Human
Leucocyte Differentiation Antigens (Terzo gruppo di lavoro internazionale e conferenza sugli antigeni di
differenziazione dei leucociti umani) e reagisce con tutti gli isotopi noti della famiglia CD45 (6). Il clone PD7/26
è stato classificato come anti-CD45RB al Fifth International Workshop and Conference on Human Leucocyte
Differentiation Antigens (5° gruppo di lavoro e con ferenza internazionale sugli antigeni di differenziazione dei
leucociti umani) (7).
Precauzioni
1. Per uso professionale.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene
alle concentrazioni indicate non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN3 può reagire con il
rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento,
sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l'eventuale accumulo di azide metallica.
3. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservazione
(116943-004)
Dako Denmark A/S
Conservare a 2–8° C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati in
condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall'utente. Non sono stati
osservati segni evidenti che suggeriscano l’instabilità di questo prodotto. pertanto, è opportuno analizzare un
controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione
imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un
probabile problema dell'anticorpo, contattare l’Assistenza Tecnica di Dako.
IS751/IT/MNI/2009.12.04 p. 1/3
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Preparazione dei
campioni compresi
i materiali necessari
ma non forniti
L’anticorpo può essere utilizzato per marcare sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina. I campioni di
tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm.
È necessario pretrattare con smascheramento termoindotto dell'epitopo (HIER, Heat-Induced Epitope Retrieval)
utilizzando Dako PT Link (Codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Si ottengono ottimi
risultati pretrattando i tessuti con EnVisionTM FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (codice K8010/K8004).
Sezioni incluse in paraffina: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina,
utilizzando la procedura di preparazione dei campioni 3 in 1 Dako PT Link. Attenersi alla procedura di pretrattamento
delineata nel foglietto illustrativo di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (Codice K8010/K8004).
Nota: Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono essere disidratate, diafanizzate e montate
utilizzando un mezzo di montaggio permanente.
Sezioni deparaffinate: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto deparaffinate fissate in formalina, incluse in
paraffina, utilizzando Dako PT Link e seguendo la stessa procedura descritta per le sezioni incluse in paraffina.
Dopo la colorazione dei vetrini montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o non acquoso.
Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante il trattamento o nella successiva fase di colorazione
immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si consiglia di utilizzare FLEX
IHC Microscope Slides (codice K8020).
Procedura per la
colorazione compresi
i materiali necessari
ma non forniti
Il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision FLEX High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Codice
K8010). Il ciclo di colorazione e i tempi di incubazione sono preimpostati nel software degli strumenti Dako
Autostainer/Autostainer Plus facendo uso dei seguenti protocolli:
Protocollo modello: FLEXRTU2 (volume di dispensazione 200 µL) o FLEXRTU3 (volume di dispensazione 300 µL)
Programma ad esecuzione automatica: CD45LCA (senza controcolorazione) o CD45LCAH (con controcolorazione)
La fase Extra deve essere impostata su “tampone di lavaggio” nei cicli di colorazione con ≤10 vetrini. Per cicli di
colorazione con più di 10 vetrini, la fase Extra deve essere impostata su “none”. Ciò garantisce dei tempi di lavaggio
paragonabili.
Tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Per dettagli, fare riferimento al manuale
dell'operatore relativo allo strumento dedicato. Se i protocolli non sono disponibili sullo strumento Dako Autostainer
utilizzato, rivolgersi ai Servizi Tecnici Dako.
Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato,
pertanto dovranno essere definite autonomamente da ogni laboratorio. Se il patologo che effettua la valutazione
desidera una diversa intensità di colorazione, è possibile contattare un Esperto delle Applicazioni/Esperto dei Servizi
Tecnici di Dako per ricevere informazioni su come riprogrammare il protocollo. Verificare che l’esecuzione del
protocollo ritoccato sia ancora valida valutando che lo schema di colorazione sia identico allo schema di colorazione
descritto in “Caratteristiche prestazionali”.
Si consiglia la colorazione di contrasto in ematossilina utilizzando EnVision FLEX Hematoxylin
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Codice K8018). Si consiglia di usare un mezzo di montaggio permanente e non
acquoso.
I controlli positivi e negativi devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo stesso protocollo dei
campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve comprendere cellule delle tonsille e del cervello e le
cellule/strutture devono evidenziare gli schemi di reazione descritti per i tessuti in questione in “Caratteristiche
prestazionali” in tutti i campioni positivi. Il controllo negativo consigliato è FLEX Negative Control, Mouse
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Codice IS750).
Interpretazione
dei risultati della
colorazione
Nelle cellule marcate dall'anticorpo è visibile una colorazione della membrana, ma può avere luogo anche la
colorazione citoplasmatica.
Caratteristiche
prestazionali
Tessuti normali: nelle tonsille, l’anticorpo marca i centri germinali, le zone di mantello follicolare e le regioni
interfollicolari (1). Nella milza, nella polpa bianca e nelle cellule linfoidi della polpa rossa sono positivi, così come
i linfociti timici, le cellule linfoidi del midollo osseo, i mastociti, le cellule di probabile derivazione monocitica ed
occasionali cellule di plasma. È stata documentata la marcatura variabile degli immunoblasti, degli istiociti epitelioidi,
degli istiociti dei seni e delle plasmacellule. Le cellule mieloidi, le cellule eritroidi, i megacariociti, le cellule di
Langerhans nella cute, nell’epitelio e nel tessuto connettivo non sono marcate dall’anticorpo (2). I linfociti B e T nelle
tonsille mostrano una reazione alla colorazione da moderata a forte, mentre le cellule microgliali nel cervello
mostrano una reazione alla colorazione da debole a moderata.
Tessuti patologici: nel linfoma non Hodgkin, le cellule neoplastiche sono state marcate dall’anticorpo in 40 casi su 40
(100%) (1). In un altro studio (2) la cifra è risultata essere di 74 casi su 80 (93%). Un terzo studio (8) ha dimostrato
che 52 linfomi dei linfociti B piccoli su 52 (100%), 99 linfomi di linfociti B grandi su 108 (92%) e 41 linfomi di linfociti T
su 44 (93%) erano positivi con l’anticorpo. Nel complesso, 162 neoplasmi non linfoidi su 162 (100%) erano negativi
con l’anticorpo, compresi carcinomi anaplastici a piccole cellule, melanomi amelanotici, rabdomiosarcomi alveolari,
sarcoma di Ewing e tumori delle cellule germinali (1, 2). Per l’anticorpo è stata segnalata la marcatura della
membrana superficiale delle cellule duttali mammarie in campioni di mastopatia fibrocistica e di fibroadenoma.
Tuttavia, al momento questa espressione non viene considerata un problema diagnostico differenziale che possa
portare ad un’identificazione erronea (9).
(116943-004)
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