Dako Autostainer/Autostainer Plus

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human CD68
Clone PG-M1
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Codice IS613
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human CD68, Clone PG-M1, Ready-to-Use, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) è
destinato per essere utilizzato nell’immunocitochimica congiuntamente a strumenti Dako Autostainer/Autostainer
Plus. Questo anticorpo marca i macrofagi ed è utile per l'identificazione di due tipi di leucemia mieloide acuta (LMA),
rispettivamente M4 (mielomonocitica) e M5 (monocitica), oltre che del sarcoma istiocitico (1). L’interpretazione
clinica di un’eventuale colorazione o della sua assenza deve essere integrata mediante studi morfologici avvalendosi
di controlli adeguati e deve essere valutata nell’ambito dell’anamnesi del paziente e di altri test diagnostici da parte
di un patologo qualificato.
Cenni e spiegazioni
La proteina CD68 è una proteina della membrana lisosomiale altamente glicosilata (Mr = 110.000), appartenente alla
famiglia LGP delle proteine lisosomiali/plasmatiche trasportatrici di membrana, le quali svolgono un ruolo importante
nella endocitosi e/o nella funzione lisosomiale.
La proteina CD68 è espressa in maniera intensa nei granuli citoplasmatici e in maniera debole sulla superficie di
macrofagi, monociti, neutrofili, basofili e cellule NK. Va aggiunto che la proteina CD68 è espressa in circa il 40% dei
linfociti B nel sangue periferico ed è espressa in maniera debole nel 50% delle leucemie linfoblastiche acute a cellule B
(B-LLA). La proteina CD68 è inoltre presente nel citoplasma dei tessuti non ematopoietici, specialmente nel fegato,
e nei glomeruli e nei tubuli renali (2). A differenza di molti altri antigeni dei leucociti CD, la molecola CD68
è estremamente eterogenea da un punto di vista antigenico e i diversi anticorpi anti-CD68 hanno reattività cellulari
diverse (3).
Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining della Dako o alle istruzioni sul sistema
di rilevazione per le procedure IHC per: (1) Principio della procedura, (2) Materiali necessari ma non forniti,
(3) Conservazione, (4) Preparazione dei campioni, (5) Procedura per la colorazione, (6) Controllo della qualità,
(7) Risoluzione dei problemi, (8) Interpretazione della colorazione, (9) Limiti generali.
Reagente fornito
Anticorpo di topo monoclonale pronto per l’uso fornito in forma liquida in un tampone contenente la proteina
stabilizzante e 0,015 mol/L sodio azide.
Clone: PG-M1 (3). Isotipo: IgG3, kappa.
Immunogeno
Preparato cellulare mononucleare da milza umana, contenente oltre l'80% di cellule di Gaucher (3).
Specificità
L'anti-CD68 umano, Clone PG-M1, è stato inserito in un cluster come anti-CD68 al 5th International Workshop and
Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (4).
L’anticorpo marca le cellule COS-1 e WOP transfettate con cDNA CD68. A differenza di altri anticorpi anti-CD68,
i quali marcano sia i macrofagi che le cellule mieloidi, l'anticorpo PG-M1 identifica un epitopo resistente ai fissativi
che è presente sulla proteina CD68 in forma limitata ai macrofagi (3).
Precauzioni
1. Per uso professionale.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene
alle concentrazioni indicate non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN3 può reagire con il
rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento,
sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l'eventuale accumulo di azide metallica.
3. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservazione
(116860-002)
Dako Denmark A/S
Conservare a 2–8° C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati in
condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall'utente. Non sono stati
osservati segni evidenti che suggeriscano l’instabilità di questo prodotto. pertanto, è opportuno analizzare un
controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione
imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un
probabile problema dell'anticorpo, contattare l’Assistenza Tecnica di Dako.
IS613/IT/MNI/2009.12.04 p. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Preparazione dei
campioni compresi
i materiali necessari
ma non forniti
L’anticorpo può essere utilizzato per marcare sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina. I campioni di
tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm.
È necessario pretrattare con smascheramento termoindotto dell'epitopo (HIER, Heat-Induced Epitope Retrieval)
utilizzando Dako PT Link (Codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Si ottengono ottimi
risultati pretrattando i tessuti con EnVisionTM FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (codice K8010/K8004).
Sezioni incluse in paraffina: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina,
utilizzando la procedura di preparazione dei campioni 3 in 1 Dako PT Link. Attenersi alla procedura di pretrattamento
delineata nel foglietto illustrativo di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (Codice K8010/K8004).
Nota: Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono essere disidratate, diafanizzate e montate
utilizzando un mezzo di montaggio permanente.
Sezioni deparaffinate: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto deparaffinate fissate in formalina, incluse in
paraffina, utilizzando Dako PT Link e seguendo la stessa procedura descritta per le sezioni incluse in paraffina.
Dopo la colorazione dei vetrini montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o non acquoso.
Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante il trattamento o nella successiva fase di colorazione
immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si consiglia di utilizzare FLEX
IHC Microscope Slides (codice K8020).
Procedura per la
colorazione compresi
i materiali necessari
ma non forniti
Il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision FLEX High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus)
(Codice K8010). Il ciclo di colorazione e i tempi di incubazione sono preimpostati nel software degli strumenti Dako
Autostainer/Autostainer Plus facendo uso dei seguenti protocolli:
Protocollo modello: FLEXRTU2 (volume di dispensazione 200 µL) o FLEXRTU3 (volume di dispensazione 300 µL)
Programma ad esecuzione automatica: CD68PG (senza controcolorazione) o CD68PGH (con controcolorazione)
La fase Extra deve essere impostata su “tampone di lavaggio” nei cicli di colorazione con ≤10 vetrini. Per cicli di
colorazione con più di 10 vetrini, la fase Extra deve essere impostata su “none”. Ciò garantisce dei tempi di lavaggio
paragonabili.
Tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Per dettagli, fare riferimento al manuale
dell'operatore relativo allo strumento dedicato. Se i protocolli non sono disponibili sullo strumento Dako Autostainer
utilizzato, rivolgersi ai Servizi Tecnici Dako.
Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato,
pertanto dovranno essere definite autonomamente da ogni laboratorio. Se il patologo che effettua la valutazione
desidera una diversa intensità di colorazione, è possibile contattare un Esperto delle Applicazioni/Esperto dei Servizi
Tecnici di Dako per ricevere informazioni su come riprogrammare il protocollo. Verificare che l’esecuzione del
protocollo ritoccato sia ancora valida valutando che lo schema di colorazione sia identico allo schema di colorazione
descritto in “Caratteristiche prestazionali”.
Si consiglia la colorazione di contrasto in ematossilina utilizzando EnVision FLEX Hematoxylin
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Codice K8018). Si consiglia di usare un mezzo di montaggio permanente e non
acquoso.
I controlli positivi e negativi devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo stesso protocollo dei
campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve comprendere cellule delle tonsille e del cervello e le
cellule/strutture devono evidenziare gli schemi di reazione descritti per i tessuti in questione in “Caratteristiche
prestazionali” in tutti i campioni positivi. Il controllo negativo consigliato è FLEX Negative Control, Mouse
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Codice IS750).
Interpretazione
dei risultati della
colorazione
Nelle cellule del ceppo monociti/macrofagi che sono marcate dall'anticorpo è visibile un pattern di colorazione
(diffusa o granulare) a livello di citoplasma.
Caratteristiche
prestazionali
Tessuti normali: nel sangue periferico normale vengono marcati dall'anticorpo soltanto i monociti. Nei molteplici
campioni di tessuti analizzati sono stati marcati tutti i macrofagi. Nel midollo osseo sono risultati positivi anche gli
osteoclasti, mentre i precursori mieloidi e i granulociti sono risultati sempre negativi. In circa il 20% dei casi è stata
osservata una debole reattività dei megacariociti. Le cellule di Kupffer nel fegato, i mastociti e le cellule sinoviali sono
le sole altre cellule normali che sono state marcate dall'anticorpo (3). I macrofagi nei centri germinali mostrano una
reazione di colorazione da moderata a forte, mentre le cellule microgliali nel cervello mostrano una reazione di
colorazione da debole a moderata.
Tessuti patologici: su 431 neoplasie del sistema linfoemopoietico che sono state analizzate, la reattività all'anticorpo
è stata accertata solo limitatamente alle leucemie mieloidi acute di tipo M4 e M5, ai sarcomi istiocitici e alla
mastocitosi. Hanno prodotto risultati sempre negativi le leucemie mieloblastiche acute di tipo M1, M2 e M3, i linfomi
non Hodgkin maligni dei linfociti B e T, il linfoma di Hodgkin, le leucemie linfoblastiche acute e la leucemia mieloide
cronica. Nella maggioranza dei casi, i 370 tumori di origine non ematopoietica analizzati sono risultati negativi
all'anticorpo, con l'eccezione di 15 casi su 15 di mioblastoma a cellule granulari, 6 casi su 13 di carcinoma renale
a cellule chiare, 4 casi su 10 di glioblastoma, 10 casi su 18 di meningioma e 5 casi su 50 di melanoma e, com'era
prevedibile, 2 casi su 2 di tumore osseo gigantocellulare e 7 casi su 7 di xantogranuloma (3). L'anticorpo PG-M1
marca alcune neoplasie di origine non ematopoietica, in particolare il 10% circa dei melanomi (3), pertanto la
diagnosi del sarcoma istiocitico deve essere sempre confermata verificando da un lato che le cellule neoplastiche
siano positive almeno ad un altro marcatore specializzato in macrofagi e/o all'antigene leucocitario comune, dall'altro
lato che le stesse cellule risultino negative agli antigeni epiteliali e associati al melanoma (1).
(116860-002)
Dako Denmark A/S
IS613/IT/MNI/2009.12.04 p. 2/3
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Bibliografia
1.
Falini B, Flenghi L, Pileri S, Stein H, Dürkop H, Pasqualucci L, et al. M15.1. PG-M1 a new mAb directed against
a fixative-resistant, macrophage-restricted epitope of the CD68 molecule. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR,
Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens.
Proceedings of the 4th International Workshop and Conference; 1989 Feb 21–25; Vienna, Austria. Oxford,
New York, Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 928–30.
2.
Goyert SM. MC12. CD68 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM,
Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of
the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10–14; Kobe, Japan. New York, London: Garland
Publishing Inc.; 1997. p. 1015–6.
3.
Falini B, Flenghi L, Pileri S, Gambacorta M, Bigerna B, Durkop H, et al. PG-M1: A new monoclonal antibody
directed against a fixative-resistant epitope on the macrophage-restricted form of the CD68 molecule.
Am J Pathol 1993; 142:1359–72.
4.
Cordell JL, Falini B, Flenghi L, Jones DB, Pileri S, Radzun HJ, et al. M15. CD68 cluster workshop report.
In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leukocyte typing IV. White
cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International Workshop and Conference; 1989 Feb 21–25;
Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press; 1989. p. 925–7.
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