FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human CD68
Clone KP1
Ready-to-Use
(Link)
Codice IR609
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human CD68, Clone KP1, Ready-to-Use, (Link), è destinato all'utilizzo
in immunoistochimica congiuntamente a strumenti Autostainer Link. Questo anticorpo marca i macrofagi e gli
altri membri del fagociti mononucleari ed è utile per l'identificazione di neoplasie di origine mieloide
e monocito/macrofagica (1). L’interpretazione clinica di un’eventuale colorazione o della sua assenza deve essere
integrata mediante studi morfologici avvalendosi di controlli adeguati e deve essere valutata nell’ambito
dell’anamnesi del paziente e di altri test diagnostici da parte di un patologo qualificato.
Cenni
e spiegazioni
La proteina CD68 è una proteina della membrana lisosomiale altamente glicosilata (Mr = 110000), appartenente alla
famiglia LGP delle proteine lisosomiali/plasmatiche trasportatrici di membrana, le quali svolgono un ruolo importante
nella endocitosi e/o nella funzione lisosomiale. La proteina CD68 è espressa in maniera intensa nei granuli
citoplasmatici e in maniera debole sulla superficie di macrofagi, monociti, neutrofili, basofili e cellule NK. Va aggiunto
che la proteina CD68 è espressa in circa il 40% dei linfociti B nel sangue periferico ed è espressa in maniera debole
nel 50% delle leucemie linfoblastiche acute a cellule B (B-LLA). La proteina CD68 è inoltre presente nel citoplasma
dei tessuti non ematopoietici, specialmente nel fegato, nei glomeruli e nei tubuli renali (2). A differenza di molti altri
antigeni dei leucociti CD, la molecola CD68 è estremamente eterogenea da un punto di vista antigenico e i diversi
anticorpi anti-CD68 hanno reattività cellulari diverse (3).
Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining della Dako o alle istruzioni sul sistema di
rilevazione per le procedure IHC per: 1) Principio della procedura, 2) Materiali necessari ma non forniti,
3) Conservazione, 4) Preparazione dei campioni, 5) Procedura di colorazione, 6) Controllo della qualità,
7) Risoluzione dei problemi, 8) Interpretazione della colorazione, 9) Limiti generali.
Reagente fornito
Anticorpo di topo monoclonale pronto per l’uso fornito in forma liquida in un tampone contenente la proteina
stabilizzante e 0,015 mol/L sodio azide.
Clone: KP1 (4). Isotipo: IgG1, kappa.
Immunogeno
Frazione lisosomiale di macrofagi umani del polmone (4).
Specificità
L'anti-CD68 umano, Clone KP1, è stato inserito in un cluster come anti-CD68 nel Fourth International Workshop and
Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (4° gruppo di lavoro e conferenza internazional e sugli
antigeni di differenziazione dei leucociti umani) (5).
Nei test di Western blotting di estratti di polmone, milza e cellule U937, sono state rilevate bande diffuse da 110,
70 e 40 kDa in condizioni di riduzione. In condizioni di non riduzione, l'estratto di milza ha mostrato una banda
da 220 kDa aggiuntiva (4).
L'analisi SDS-PAGE degli immunoprecipitati formati tra l'anticorpo e i lisati marcati 125I della milza umana con linfoma
a cellule ricco di macrofagi ha mostrato una reazione con un polipeptide da 110 kDa, corrispondente a CD68 (4).
Precauzioni
1. Per uso professionale.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura.
Sebbene alle concentrazioni indicate non sia classificato come prodotto a rischio, il contenuto di NaN3 può reagire
con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento,
sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l'eventuale accumulo di azide metallica.
3. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservazione
Conservare a 2–8°C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati
in condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall'utente. Non sono stati
osservati segni evidenti che suggeriscano l’instabilità di questo prodotto. Pertanto, è opportuno analizzare
un controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione
imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta
ad un probabile problema dell'anticorpo, contattare l’Assistenza Tecnica di Dako.
Preparazione dei
campioni
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
L’anticorpo può essere utilizzato per marcare sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina. I campioni di
tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm.
È necessario pretrattare con smascheramento termoindotto dell'epitopo (HIER, Heat-Induced Epitope Retrieval)
utilizzando Dako PT Link (Codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Si ottengono ottimi
risultati pretrattando i tessuti con EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (codice K8000/K8004).
Sezioni incluse in paraffina: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina,
utilizzando la procedura di preparazione dei campioni 3 in 1 Dako PT Link. Attenersi alla procedura di pretrattamento
(117226-002)
Dako Denmark A/S
IR609/IT/MNI/2009.12.04 p. 1/3
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delineata nel foglietto illustrativo di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (Codice K8000/K8004).
Nota: Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono essere disidratate, diafanizzate e montate
utilizzando un mezzo di montaggio permanente.
Sezioni deparaffinate: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto deparaffinate fissate in formalina, incluse in
paraffina, utilizzando Dako PT Link e seguendo la stessa procedura descritta per le sezioni incluse in paraffina.
Dopo la colorazione dei vetrini montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o non acquoso.
Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante il trattamento o nella successiva fase di colorazione
immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si consiglia di utilizzare FLEX
IHC Microscope Slides (codice K8020).
Procedura per la
colorazione
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
Il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision FLEX, High pH, (Link) (Codice K8000). Il ciclo di colorazione e i
tempi di incubazione sono preimpostati nel software Autostainer Link. Il volume di applicazione del reagente
consigliato è 1 x 200 µL o 2 x 150 µL per vetrino. Per istruzioni dettagliate sul caricamento di vetrini e reagenti,
consultare la Guida Utente di Dako Autostainer Link. Se i protocolli non sono disponibili sullo strumento Autostainer
utilizzato, rivolgersi ai Servizi Tecnici Dako. Tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente.
Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato,
pertanto dovranno essere definite autonomamente da ogni laboratorio. Se il patologo desidera un’intensità di
colorazione diversa, è possibile regolare la durata di incubazione e la scelta del sistema di visualizzazione
EnVision FLEX/EnVision FLEX+. È possibile contattare un Esperto delle Applicazioni/Esperto dei Servizi Tecnici
di Dako per ricevere informazioni su come riprogrammare il protocollo. Verificare che l’esecuzione del protocollo
ritoccato sia ancora valida valutando che lo schema di colorazione sia identico allo schema di colorazione descritto
in “Caratteristiche prestazionali”.
Si consiglia la colorazione di contrasto in ematossilina utilizzando EnVision FLEX Hematoxylin (Link)
(codice K8008). Si consiglia di usare un mezzo di montaggio permanente e non acquoso.
I controlli positivi e negativi devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo stesso protocollo
dei campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve comprendere cellule delle tonsille e del cervello
e le cellule/strutture devono evidenziare gli schemi di reazione descritti per i tessuti in questione in “Caratteristiche
prestazionali” in tutti i campioni positivi. Il reagente di controllo negativo consigliato è FLEX Negative Control,
Mouse (Link) (codice IR750).
Interpretazione dei
risultati della
colorazione
Le cellule mielomonocitiche marcate dall'anticorpo presentano una colorazione citoplasmatica diffusa o granulare.
Caratteristiche
prestazionali
Tessuti normali: negli strisci di sangue periferico normale, tutti i monociti e la maggior parte dei granulociti vengono
marcati dall'anticorpo. I macrofagi tissutali in una vasta gamma di tessuti inclusi in paraffina risultano positivi,
compresi i macrofagi del polmone, del centro germinale e del midollo osseo e le cellule di Kupffer nel fegato.
Nel midollo osseo vengono marcati in modo deciso anche i precursori mieloidi e molti granulociti maturi (4). Inoltre,
vengono marcati in modo deciso le cellule microgliali nel cervello (6), gli osteoclasti delle ossa, i glomeruli renali
e i mastociti, mentre si osserva una moderata reazione nei tubuli renali, negli epatociti e occasionalmente nelle
cellule linfoidi (7). Le cellule di Langerhans, le cellule reticolari interdigitate e le cellule dendritiche follicolari (FDC)
risultano negative, ad eccezione della debole positività osservata in una minoranza di FDC nella linfadenopatia
dermatopatica (4). I macrofagi nei centri germinali dei follicoli secondari delle tonsille mostrano una reazione
di colorazione da moderata a forte, mentre le cellule microgliali nel cervello mostrano una reazione di colorazione
da debole a moderata.
Tessuti patologici: leucemie mieloidi acute di tipo M1-M5 marcate in modo deciso dall'anticorpo (7). In un altro
studio, 20 casi su 20 di neoplasie di derivazione mieloide, mielomonocitica e presunta macrofaga hanno mostrato
una forte ed estesa reattività citoplasmatica con l'anticorpo. Anche i linfomi e le leucemie del ceppo 14/41 B hanno
mostrato positività, ma la marcatura è apparsa limitata ai puntini. Le neoplasie dei linfociti B positive erano
praticamente ad uno stadio di proliferazione a piccole cellule (1). In 23 casi su 36 (64%) di iperplasie plasmacellulari,
oltre l'1% delle plasmacellule risultava marcato dall'anticorpo (8). Dei 43 melanomi primari e metastatici,
l'86% risultava debolmente marcato dall'anticorpo (9). Tutti i 22 linfomi dei linfociti T risultavano negativi, così come
i 12 casi su 12 di linfoma anaplastico a grandi cellule CD30+ (1).
Bibliografia
(117226-002)
Dako Denmark A/S
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IR609/IT/MNI/2009.12.04 p. 2/3
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1999;12:1072-7.
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