FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Epstein-Barr Virus, LMP
Cloni CS. 1-4
Ready-to-Use
(Link)
Codice IR753
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
FLEX Monoclonal Mouse Anti Epstein-Barr Virus, LMP, Clones CS 1-4, Ready-to-Use (Link), è destinato per essere
utilizzato nell’immunoistochimica congiuntamente a strumenti Autostainer Link. L’anticorpo marca le cellule infettate
dal virus Epstein-Barr che esprimono la proteina latente della membrana (LMP-1) ed è utile per l’identificazione di
cellule tumorali nel morbo di Hodgkin associato al virus Epstein-Barr (1-3) e nel carcinoma nasofaringeo (4).
L’interpretazione clinica di un’eventuale colorazione o della sua assenza deve essere integrata mediante studi
morfologici avvalendosi di controlli adeguati e deve essere valutata nell’ambito dell’anamnesi del paziente e di altri
test diagnostici da parte di un patologo qualificato.
Cenni
e spiegazioni
Il virus Epstein-barr (EBV) è un virus herpes umano, rilevato normalmente come un’infezione asintomatica diffusa
nel >95% della popolazione adulta mondiale che vive a lungo. Il genoma del virus è una molecola di DNA a doppio
filamento di circa 172 kB codificante almeno 80 proteine. Esistono due ceppi di EBV, sebbene il cuore del genoma
sia identico (5, 6). Le cellule e i neoplasmi infettati da EBV mostrano generalmente una di tre pattern di espressione
diversi di geni virali associati alla latenza. Nella latenza di tipo I, è espresso solo l’antigene nucleare codificato EBV 1
(EBNA-1), assieme a due RNA nucleari poliadenilati (EBER 1 and 2) osservati nel linfoma di Burkitt. Nella latenza di
tipo II, è osservata anche l’espressione di tre proteine latenti della membrana, LMP-1, LMP-2A e LMP-2B, rilevato
nel morbo di Hodgkin e nel carcinoma nasofaringeo. La latenza di tipo III è osservata in patologie linfoproliferative
che si manifestano in individui immunocompromessi e nelle linee cellulari linfoblastoidi trasformate dall’EBV. In
questo gruppo, sono espressi tutti gli EBNA (EBNA-1/2/3A/3B/3C/LP), tutti gli LMP e i due EBER (6).
La proteina integrale della membrana, LMP-1, è codificata dal gene BNRF1 e contiene 386 aminoacidi con una
massa molecolare di 63 kDa. È considerata una proteina oncogenica perché è coinvolta in almeno quattro fattori di
trascrizione che segnalano percorsi e induce l’espressione di marcatori superficiali di cellule multipli e di molecole di
adesione (4, 5). L’EBV è associato a determinato tumori di origine linfoide ed epiteliale, compresi il linfoma di Burkitt,
il linfoma immunoblastico, il linfoma dei linfociti T, il morbo di Hodgkin, il carcinoma nasofaringeo e il carcinoma
gastrico (5, 6).
Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining della Dako o alle istruzioni sul sistema di
rilevazione per le procedure IHC per: 1) Principio della procedura, 2) Materiali necessari ma non forniti,
3) Conservazione, 4) Preparazione dei campioni, 5) Procedura per la colorazione, 6) Controllo della qualità,
7) Risoluzione dei problemi, 8) Interpretazione della colorazione, 9) Limiti generali.
Reagente fornito
Miscela di quattro anticorpi monoclonali murino fornito in forma liquida e pronti all’uso come supernatante di coltura
tessutale, dializzato contro Tris/HCl 0,05 mol/L, a pH 7,2, contenente NaN3 0,015 mol/L.
Clone: CS 1, CS 2, CS 3 e CS 4 Isotipo: IgG1, kappa.
Immunogeno
Proteina di fusione recombinante contenente sequenze di beta-galactosidasi batterica e il carbossile di LMP
codificato da EBV (7).
Specificità
Negli esperimenti di Western blot eseguiti su lisati di linee cellulari linfoblastoidi trasformate da EBV, l’anticorpo
marca una banda di 57-66 kDa sulla base dell’isolato del virus, accompagnato a volte da una banda minore di 50-55
kDa corrispondente alla lunghezza completa e alla forma troncata di LMP. L’anticorpo riconosce 20 isolati di EBV
geograficamente distinti (7). L’anticorpo mostra una reazione crociata con un doppietto di 43-44 kDa di proteine
cellulari normali non caratterizzate in estratti cellulari che formano linee cellulari di controllo negative all’EBV (7).
L’anticorpo marca una linea cellulare linfoblastoide positiva all’EBV normale stabilita dall’infezione di linfociti B
normali a riposo con il virus B95.8, mentre la linea cellulare BL2, stabilita da un paziente BL sporadico raro negativo
all’EBV, nonché altri isolati cellulari non collegati, compresi i linfociti B e T tonsillari, il fegato fetale e il timo, i
fibroblasti fetali di cultura, le linee cellulari leucemiche umane HSB2 e K562 e 7 linee dei linfociti B negative all’EBV
non mostrano alcuna marcatura, tranne i doppietti proteici cellulari (7).
Precauzioni
1. Per uso professionale.
2. Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura. Sebbene
non sia classificato come prodotto pericoloso, la sodio azide alle concentrazioni indicate può reagire con il rame e
il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante lo smaltimento, sciacquare le
tubature con abbondante acqua per prevenire l’eventuale accumulo di azide metallica.
3. Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
4. Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
5. Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
(118007-002)
Dako Denmark A/S
IR753/IT/MNI/2009.12.04 p. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Conservazione
Conservare a 2–8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati in
condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall’utente. Non sono stati
osservati segni evidenti che suggeriscano l’instabilità di questo prodotto, pertanto è opportuno analizzare un
controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione
imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un
probabile problema dell’anticorpo, contattare l’Assistenza Tecnica Dako.
Specimen preparation
(Allestimento tessuto)
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
L’anticorpo può essere utilizzato per marcare sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina. I campioni di
tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm.
È necessario pretrattare con smascheramento termoindotto dell'epitopo (HIER, Heat-Induced Epitope Retrieval)
utilizzando Dako PT Link (Codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link. Si ottengono ottimi
risultati pretrattando i tessuti con EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (codice K8000/K8004).
Sezioni incluse in paraffina: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina,
utilizzando la procedura di preparazione dei campioni 3 in 1 Dako PT Link. Attenersi alla procedura di pretrattamento
delineata nel foglietto illustrativo di EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (Codice K8000/K8004).
Nota: Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono essere disidratate, diafanizzate e montate
utilizzando un mezzo di montaggio permanente.
Sezioni deparaffinate: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto deparaffinate fissate in formalina, incluse in
paraffina, utilizzando Dako PT Link e seguendo la stessa procedura descritta per le sezioni incluse in paraffina.
Dopo la colorazione dei vetrini montare i vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquoso o non acquoso.
Evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante il trattamento o nella successiva fase di colorazione
immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si consiglia di utilizzare FLEX
IHC Microscope Slides (codice K8020).
Procedura per la
colorazione
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
Il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision FLEX, High pH, (Link) (Codice K8000). Il ciclo di colorazione e i
tempi di incubazione sono preimpostati nel software Autostainer Link. Il volume di applicazione del reagente
consigliato è 1 x 200 µL o 2 x 150 µL per vetrino. Per istruzioni dettagliate sul caricamento di vetrini e reagenti,
consultare la guida utente Autostainer Link. Se i protocolli non sono disponibili sulla piattaforma Autostainer
utilizzata, rivolgersi ai Servizi Tecnici Dako. Tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente.
Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato,
pertanto dovranno essere definite autonomamente da ogni laboratorio. Se il patologo desidera un’intensità di
colorazione diversa, è possibile regolare la durata di incubazione e la scelta del sistema di visualizzazione
EnVision FLEX/EnVision FLEX+. È possibile contattare un Esperto delle Applicazioni/Esperto dei Servizi Tecnici
di Dako per ricevere informazioni su come riprogrammare il protocollo. Verificare che l’esecuzione del protocollo
ritoccato sia ancora valida valutando che lo schema di colorazione sia identico allo schema di colorazione descritto
in “Caratteristiche prestazionali”.
Si consiglia la colorazione di contrasto in ematossilina utilizzando EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (codice
K8008). Si consiglia di usare un mezzo di montaggio permanente e non acquoso.
I controlli positivi e negativi devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo stesso protocollo dei
campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve comprendere linfoma di Hodgkin e di Burkitt positivi all’EBV
e le cellule/strutture devono evidenziare gli schemi di reazione descritti per il tessuto in questione in “Caratteristiche
prestazionali” in tutti i campioni positivi. Il controllo negativo consigliato è FLEX Negative Control, Mouse, (Link)
(Codice IR750).
Interpretazione dei
risultati della
colorazione
Nelle cellule marcate dall’anticorpo è visibile una colorazione a livello del citoplasma e della membrana.
Caratteristiche
prestazionali
Tessuti normali: L’anticorpo non marca la mucosa nasofaringea normale, né i piccoli linfociti di infiltrazione, la stroma
desmoplastica e l’epitelio normale nei campioni nasofaringei principali marcati (4). L’anticorpo non mostra
colorazione nell’intestino crasso, nell’appendice e nel pancreas (8). Può essere osservata una forte marcatura di
precursori eitroidi e mieloidi normali nonostante la totale assenza della presenza di EBV dal PCR (9).
Tessuti patologici: L’anticorpo ha marcato 22/46 casi di tessuto incluso in paraffina del morbo di Hodgkin, con 1/12
di predominanza linfocitica, 12/24 di sclerosi nodulare, 6/7 di tipo di cellularità mista e 3/3 di sottotipo di deplezione
linfocitica (2). In un altro studio comprendente 47 linfomi di Hodgkin, è stato marcato un totale di 32/47 dall’anticorpo,
compresi 28/82 di tipo di sclerosi nodulare e 4/5 di tipo di cellularità mista (3). Tra 51 carcinomi nasofaringei,
l’anticorpo ha marcato 40/51, compresi 8/10 di carcinoma cheratinizzante a cellule squamose, 7/12 di carcinoma non
cheratinizzante a cellule squamose e 25/29 di carcinoma non differenziati (4).
Bibliografia
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| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
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Spiega zione de i sim boli
Nume ro d i ca ta lo go
Li miti di te mpe ra tu ra
Da ta di sca de nza
Disp osi tivo me di co d ia gn ostic o
i n vi tro
Co ntie ne materi al e
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Prod uttore
Con sul tare l e is tru zio ni
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Co di ce ba tch
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Dako Denmark A/S
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