Diapositiva 1 - Docenti.unina

Produzione di metaboliti a quattro atomi di
carbonio: il butanolo
L’importanza biotecnologica del butanolo e la sua produzione
Agli inizi del 1900 venne consolidata la produzione del butanolo per
via fermentativa
Sostituita dalla sintesi per via chimica
Nel recente passato, la produzione via fermentazione ha riassunto un
notevole interesse in quanto il butanolo è una migliore alternativa
all’etanolo come combustibile:
•miscelabile alla benzina normale (8-32 %)
•nessun cambiamento richiesto nei motori a scoppio
•meno volatile e corrosivo
•elevato contenuto energetico
Biocatalizzatore impiegato:
Clostridium acetonbutylicum
Anaerobio obbligato
Durante la crescita in batch di C. acetonbutylicum si osservano
due fasi ben distinte contrassegnate dal rilascio di prodotti
specifici
Fase acidogenica (in esponenziale) Fase solventogenica (stazionaria)
Acetone, butanolo, etanolo (3:6:1)
Butirrato, acetato, CO2, H2
(ABE)
La via fermentativa ABE e lo shift tra le due fasi
NAD+
NADH
Fd Ox
Piruvato
acido lattico
NADH
1
NAD+
2
3
H2
Fd Red
5
Acido Acetico
4
ADP
ATP
Acetil fosfato
7
6
Acetil-CoA
Acetaldeide
NADH
NAD+
NADH
NAD+
etanolo
8
9
10
Acetoacetil-CoA
acetone
acetoacetato
NADH
11
NAD+
3 idrossilbutirril- CoA
12
Crotonil-CoA
NADH
13
NAD+
15
Acido
butirrico
ATP
14
ADP
butirrilfosfato
17
16
Butirril-CoA
NADH
NAD+
butirraldeide
NADH
NAD+
butanolo
Fermentazione ABE
(Acetone Butanolo
Etanolo) fase
acidogenica.
Raffigurazione schematica
dei passaggi chiave della
fase acidogenica (indicata
con linee più spesse) della
fermentazione AB. Gli
enzimi coinvolti nel
processo metabolico
rappresentato sono indicati
come segue 1:
piruvatoferrodossina
ossidoreduttasi; 2: NADHferrodossina
ossidoreduttasi; 3:
idrogenasi; 4:
fofsotransacetilasi; 5:
acetato chinasi; 6:
acetaldeide deidrogenasi;
7: etanolodeidrogenasi; 8:
acetil CoA acetiltransferasi;
9: acetoacetilCoA:acetato/butirrato
transferasi; 10:
acetoacetato
decarbossilasi; 11: 3idrossibutirril CoA
deidrogenasi; 12: cotonasi;
13: butirrilCoAdeidrogenasi; 14:
fosfotransbutirrilasi; 15:
butirrato chinasi; 16:
butirraldeide deidrogenasi;
17: butanolo deidrogenasi.
Il piruvato, generato dal metabolimo glucidico, non viene ossidato
dal complesso della piruvato deidrogenasi, ma è ossidato ad acetilCoA dalla piruvato ferrodossina ossidoreduttasi, con conseguente
formazione di CO2, e ferrodossina ridotta (scissione fosforoclastica)
Piruvato
Fd Ox
NADH
1
NAD+
2
Fd Red
3
H2
1: piruvatoferrodossina
ossidoreduttasi; 2: NADHferrodossina ossidoreduttasi;
3: idrogenasi;
4
Acetil-CoA
La scissione fosforoclastica è la conversione, in presenza di CoA, mediata dalla piruvato
ferredossina ossidoreduttasi, del piruvato in CO2, acetil-CoA e ferredossina ridotta.
Piruvato + CoA + Ferredossinaox
CO2 + Acetil-CoA + Ferredossinard
La reazione catalizzata dalla piruvato ferredossina ossidoreduttasi prevede, come la reazione catalizzata dal
complesso della piruvato deidrogenasi, la formazione di un complesso idrossietil-TPP e il trasferimento di
un gruppo acile al CoA. Ma, mentre l’ossidazione del piruvato mediata dal complesso della piruvato
deidrogenasi prevede il trasferimento del gruppo acilico mediante l’acido lipoico e tutti i dettagli del meccanismo
sono noti, nel caso della piruvato ferredossina ossidoreduttasi, poiché manca l’acido lipoico, si ipotizza un
meccanismo basto sulla formazione di specie radicaliche. Inoltre la piruvato ferredossina
ossidoreduttasi contiene una serie di centri ferro zolfo che partecipano al trasferimento di elettroni
all’accettore esterno di elettroni ovvero la ferrodossina. La ferrodossina è una proteina ferro-zolfo
ubiquitaria nei clostridi capace di accettare e donare elettroni, in condizioni opportune la proteina in forma
ridotta può trasferire gli elettroni a una idrogenasi che consente l’uso dei protoni come accettori ultimi di
elettroni generando idrogeno molecolare.
Ferredoxins are acidic, low molecular weight, soluble iron-sulfur proteins
found in various organisms, and act as multifunctional electron carriers
in diverse redox systems.
The major forms of iron-sulfur cluster are as follows:
the [2Fe-2S]
cluster
the two iron
atoms are
bridged to one
another by two
inorganic sulfur
atoms and
ligated to four
cysteines from
peptide
backbone.
the [4Fe-4S]
cluster
the four iron
atoms are ligated
to four cysteines
and form a cubic
structure with the
four inorganic
sulfur atoms.
the [3Fe-4S]
cluster
a single iron of
the [4Fe-4S]
cluster is absent.
Meccanismo di reazione della piruvato ferrodossina ossidoreduttasi
PHOSPHOROCLASTIC
REACTION
+ TPP-E
HETPP-E + FERREDOXIN
+ CoA
HETPP-E +
TPP-E + ACETYL-CoA
FERREDOXIN H2
ACETYL-CoA+
FERREDOXIN
Pi
ACETYLPHOSPHATE
CO2
+
PYRUVATE
+
H2
ACETYL PHOSPHATE
+ ADP + Pi
FERREDOXIN H2
+ CoA
ACETATE + ATP
H2/2H+
E0= - 0.42 V
FERREDOXIN RED/ FERREDOXIN OX
E0= - 0.41 V
NADH+H+/NAD+
E0= - 0.32 V
NAD+
NADH
Fd Ox
Piruvato
acido lattico
NADH
1
NAD+
2
1
3
1
Fd Red
5
Acido Acetico
4
ADP
ATP
Acetil fosfato
7
6
Acetil-CoA
H2
Acetaldeide
NADH
NAD+
NADH
NAD+
etanolo
8
9
10
Acetoacetil-CoA
acetone
acetoacetato
NADH
11
NAD+
3 idrossilbutirril- CoA
12
Crotonil-CoA
NADH
13
NAD+
15
Acido
butirrico
ATP
14
ADP
butirrilfosfato
17
16
Butirril-CoA
NADH
NAD+
butirraldeide
NADH
NAD+
butanolo
Fermentazione ABE
(Acetone Butanolo
Etanolo) fase
acidogenica.
Raffigurazione schematica
dei passaggi chiave della
fase acidogenica (indicata
con linee più spesse) della
fermentazione AB. Gli
enzimi coinvolti nel
processo metabolico
rappresentato sono indicati
come segue 1:
piruvatoferrodossina
ossidoreduttasi; 2: NADHferrodossina
ossidoreduttasi; 3:
idrogenasi; 4:
fofsotransacetilasi; 5:
acetato chinasi; 6:
acetaldeide deidrogenasi;
7: etanolodeidrogenasi; 8:
acetil CoA acetiltransferasi;
9: acetoacetilCoA:acetato/butirrato
transferasi; 10:
acetoacetato
decarbossilasi; 11: 3idrossibutirril CoA
deidrogenasi; 12: cotonasi;
13: butirrilCoAdeidrogenasi; 14:
fosfotransbutirrilasi; 15:
butirrato chinasi; 16:
butirraldeide deidrogenasi;
17: butanolo deidrogenasi.
La fase acidogenica risulta più produttiva in termini di
genesi di ATP per fosforilazione a livello del substrato (acetil
fosfato e butirril fosfato, rispettivamente)
Tuttavia, la secrezione di acidi organici abbassa il pH e
determina il rallentamento della crescita ed il passaggio in fase
stazionaria
Onset della fase solventogenica
In questa fase gli acidi secreti sono rimetabolizzati (forse una
sorta di detossificazione) ed il pH risale!
NAD+
acido lattico
5
Acido Acetico
ADP
ATP
Acetil fosfato
9
10
acetone
acetoacetato
15
Acido
butirrico
ATP
ADP
butirrilfosfato
Fermentazione ABE
(Acetone Butanolo
Etanolo) fase
Piruvato
Fd Ox
solventogenica.
NADH
Illustrazione schematica dei
2
H2
1
3
NAD+
passaggi chiave della fase
1
1
Fd Red
solventogenica (indicata con
linee più spesse) della
7
4
6
fermentazione AB. Gli
enzimi coinvolti nel processo
etanolo
Acetaldeide
Acetil-CoA
NADH
NAD+
NADH
NAD+
metabolico mostrato sono
indicati come segue 1:
8
piruvatoferrodossina
ossidoreduttasi; 2: NADHferrodossina
ossidoreduttasi; 3:
Acetoacetil-CoA
idrogenasi; 4:
fofsotransacetilasi; 5:
NADH
acetato chinasi; 6:
11
NAD+
acetaldeide deidrogenasi; 7:
etanolodeidrogenasi; 8:
acetil CoA acetiltransferasi;
9: acetoacetil3 idrossilbutirril- CoA
CoA:acetato/butirrato
reacetoacetato
r10:
transferasi;
u
d
12
o
r
ep
l
decarbossilasi; 11: 3i
b
i
s
za CoA
os
n
p
idrossibutirril
e
è
s
non
nolo deidrogenasi; 12: cotonasi;
a
h
t
c
t
u
a
b
b
nt e
Crotonil-CoA In
e
tone13: butirril-CoAdeidrogenasi;
m
e
e
c
c
a
a
14: fosfotransbutirrilasi; 15:
NADH
effic
n ch e
a
e
butirrato chinasi; 16:
r
r
13
u
d
o
r
NAD+
p
butirraldeide deidrogenasi;
17: butanolo deidrogenasi.
17
14
16
NADH
Butirril-CoA
NADH
NAD+
butirraldeide
NADH
NAD+
butanolo
Che cosa determina lo switch tra le due fasi?
Abbassamento del pH (la fase solventogenica non parte se il pH è
mantenuto al di sopra di 5.0 – ma se si utilizzano terreni non
tamponati il pH può scendere fino a 4.0 - blocco della crescita!)
Concentrazione di acido butirrico indissociato, equilibrio con
l’acido intracellulare ed è convertito in butirril-CoA!
Concentrazione della fonte di C (se diviene limitante non si
producono i solventi!)
Il processo di produzione del butanolo
Ottimizzazione dei substrati per la crescita dei Clostridi
amido, in particolare C. beijierinchii
cellulosa, C. acetonbutylicum ha un cluster cellulosoma
Modalità di processo:
batch, rese ancora non completamente soddisfacenti (produttività
massima 0.5 gl-1h-1)
fed-batch, non praticabile a meno di un efficiente schema di
allontanamento del butanolo prodotto dal reattore (inibizione)
in continuo, ottime rese e massima produttività ma è difficile
stabilizzare il metabolismo solventogenico
due o più fasi di fermentazioni in continuo (produttività
massima 15.8 gl-1h-1)
Downstream processing:
gas stripping, flusso di CO2 e H2 nel recipiente, quindi condensazione
e riciclo gas
estrazione liquido-liquido (acido oleico, non tossico per le cellule!)