TECNICHE
TECNICHE
SPETTROSCOPICHE PER
PER
SPETTROSCOPICHE
LO STUDIO
STUDIO DELLE
DELLE
LO
PROTEINE
PROTEINE
Spettroscopia UV-VIS
La radiazione elettromagnetica
La radiazione elettromagnetica è composta da un vettore
campo elettrico e da un vettore campo magnetico che
oscillano su piani perpendicolari tra loro ed alla direzione di
propagazione
Una radiazione elettromagnetica è caratterizzata da parametri quali energia,
frequenza, lunghezza d’onda e intensità
Per la doppia natura onda-particella, i fenomeni elettromagnetici
possono essere spiegati sulla base di fotoni o quanti
Interazioni tra radiazioni
elettromagnetiche e materia
Gli elettroni molecolari possono essere distribuiti su vari livelli energetici,
quando viene fornita energia attraverso una radiazione elettromagnetica
l’elettrone passa da un livello energetico fondamentale ad un livello superiore
(eccitato)
spettro di assorbimento
Quando l’elettrone ritorna allo stato
fondamentale esso emette la stessa
energia
spettro di emissione
DE = E1 – E2 = hu
h = 6.63 x 10-34 Js costante di Planck
u è la frequenza
Spettroscopia UV-visibile
principi teorici
Legge di Lambert-Beer
Se una sostanza assorbente è parzialmente trasparente essa trasmette solo
una parte della radiazione incidente
la trasmittanza è il
rapporto tra l’intensità della luce trasmessa e la luce incidente
T = I/Io
Intensità = numero di fotoni che incidono nell’unità
di tempo
L’assorbanza o estinzione è il log(10) del reciproco della trasmittanza
A = E = log (1/T) = log (Io/I)
A = el cl
Va da zero (100% T) a infinito (0% T)
el = coefficiente di assorbanza molare
Spettrofotometria
La lunghezza d’onda viene selezionata tramite l’uso di prismi
(scomposizione della radiazione mediante il fenomeno della rifrazione) o
reticoli (scomposizione della radiazione mediante il fenomeno della
diffrazione). In entrambi i casi essi costituiscono un monocromatore
Spettrofotometro a singolo raggio
Spettrofotometro a doppio raggio
Spettri di assorbimento
• Gli spettri di assorbimento nell’UV (200-400 nm) e nel visibile
(400-700 nm) derivano dal tipo di transizione elettronica:
elettroni delocalizzati di legami p di doppi legami carbonio-carbonio
e dei doppietti elettronici spaiati di azoto e ossigeno.
Cromoforo = parte di una molecola che dà origine ad uno spettro di
assorbimento
Doppi legami coniugati abbassano l’energia di transizione (frequenza più bassa)
spostamento batocromo
Diminuzione di doppi legami
spostamento ipsocromo
Abbassamento del massimo di assorbimento = spostamento ipocromico
Innalzamento del massimo di assorbimento = spstamento ipercromico
Applicazioni della spettrofotometria
• Calibrazione di uno standard per
determinazione concentrazione di una
sostanzacromofora
• Spettri differenziali, aumentano la
sensibilità a piccole variazioni di
assorbanza dovute a modificazioni delle
proprietà spettrali di una molecola
Spettri di assorbimento
• Gli spettri di assorbimento nell’UV (200-400 nm) e nel visibile
(400-700 nm) derivano dal tipo di transizione elettronica:
elettroni delocalizzati di legami p di doppi legami carbonio-carbonio
e dei doppietti elettronici spaiati di azoto e ossigeno.
Cromoforo = parte di una molecola che dà origine ad uno spettro di
assorbimento
Spettri di assorbimento del
NAD/NADH
DAD1, 13.414 (33.8 mAU, - ) of 005-0601.D
mAU
30
25
20
15
10
5
0
220
240
260
280
300
320
340
360
380
nm
DAD1, 19.513 (3.8 mAU, - ) of 001-0201.D
mAU
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
220
240
260
280
300
320
340
360
380
nm
Riduzione del NAD a NADH
Nicotinammide Adenina Dinucleotide
(ossidato)
Nicotinammide Adenina Dinucleotide
(ridotto)
Saggio per l’enzima alcool
deidrogenasi
CH3CH2OH + NAD+
Etanolo
CH3CH2O + H+ + NADH
Acetaldeide
Poiché il NADH assorbe la luce a 340 nm, la velocità di catalisi dell’ADH può essere
seguita tramite spettrofotometria. Attraverso la lettura dell’assorbanza a 340 nm, in
funzione del tempo, dopo l’aggiunta dell’enzima ad una miscela di reazione opportuna si
ottengono i dati necessari per calcolare la velocità iniziale.
Vo = (DAbs/Dt)iniziale
Cosa stiamo misurando?
La produzione di NADH
NAD+
NADH
Lo spostamento della lunghezza d’onda
Dipendenza dalla presenza di ADH e Etanolo
NAD non deve essere il fattore limitante della velocità di reazione
– [NAD] costante e alta
– [ADH] costante
– [ETOH] bassa e variabile
Note sull’ADH:
PM = 141000 – 148000
pI = 5.4
pH ottimale = 8.4-9.5
l’ADH ha struttura quaternaria con quattro subunità che legano ognuna uno ione zinco.
L’enzima contiene 36 gruppi –SH quattro dei quali sono disposti nel sito attivo
Protocollo
NAD 27.7 mM (20 mg in 1 ml H20)
Calcoli la concentrazione di substrato:
M = d * %Vol * 10 /PM
Etanolo PM = 46
Metanolo PM = 32
Coefficiente di estinzione del NADH a 340 nm 6.22 mM-1 cm-1
2 bianchi
Prova 1
Prova 2
Prova 3
Prova 4
Prova 5
Prova 6
NAD
70
70
70
70
70
70
70
Tampone
923
918
913
908
903
898
888
Etanolo
-
5
10
15
20
25
35
ADH
7
7
7
7
7
7
7
Volume totale
Misura della velocità inziale Vo a
varie concentrazioni di subtrato
Grafico dei Doppi reciproci
