Farmacologia preclinica - Dipartimento di Farmacia

Sezione di Farmacologia
Dipartimento di Farmacia - Scienze del Farmaco
Università di Bari “Aldo Moro”
Farmacologia preclinica
Riferimenti: Dr. Sabata Pierno
Prof. Diana Conte
Saggi farmacologici
Modelli animali
per saggi
in vivo e in vitro
Colture cellulari
per la
sperimentazione
farmacologica
Farmacocinetica? Teratogenesi?
Sviluppo e uso dei farmaci:
dal laboratorio alla clinica
Sperimentazione preclinica
e clinica dei farmaci
Nuove molecole:
valutazione efficacia e
sicurezza in
considerazione di
variabili quali età, sesso,
razza, presenza di
patologie.
Valutazione sicurezza
farmaci
già in uso clinico
(studi tossicologici)
Le fasi dello sviluppo clinico
Tutte le fasi di sperimentazione clinica devono essere
autorizzate dal Ministero della Salute e dai comitati etici
RICERCA
Sperimentazione
preclinica
progettazione/
Modeling e
realizzazione
del farmaco
valutazione efficacia
valutazione sicurezza
studi tossicologici
vanno eseguiti in accordo con la legislazione
internazionale e le norme di
Good Laboratory Practices
Good Laboratory Practices
Per buona pratica di laboratorio (BPL),
(Good Laboratory Practice, GLP)
si intende un complesso di regole
riguardanti le procedure organizzative
e le condizioni con cui,
nei cosiddetti "Centri di Saggio",
sono programmate, eseguite, controllate,
registrate e archiviate
le ricerche di laboratorio per le
prove non cliniche
Good Laboratory Practices
Il fine delle norme di Buona Pratica di Laboratorio è la
promozione della qualità della sperimentazione "non clinica"
e la produzione di dati sperimentali affidabili per garantire il
mutuo riconoscimento dei risultati ottenuti a livello
internazionale, diminuendo i costi per la ricerca.
Le prove "non cliniche" sono quelle ricerche sperimentali
eseguite per valutare la sicurezza dei prodotti chimici, sia per gli
esseri viventi che per l'ambiente.
Rientrano pertanto nel campo di applicazione della Buona Pratica di
Laboratorio tutte le sostanze chimiche, ossia
i prodotti farmaceutici, gli antiparassitari, i prodotti cosmetici,
i farmaci veterinari, gli additivi alimentari, gli additivi per i mangimi
animali e i prodotti chimici industriali
MOLECULAR MODELING
and
DRUG DESIGN
Un farmaco può essere progettato e studiato dapprima
virtualmente
individuato analizzando rapidamente le possibili
affinità recettoriali di enormi quantità di composti noti
e/o ignoti
selezione dei composti più utili
Per il disegno di un farmaco ci si avvale di metodologie differenti nel
campo della chimica, biochimica, informatica, farmacologia, immunologia,
etc.
Es. La disponibilità di metodi cristallografici (X-ray) per lo studio delle
proteine (o recettori) permette di disegnare farmaci adeguati alla
struttura bersaglio
Lo studio prevede:
identificazione ed analisi degli
aminoacidi
computer-aided design del farmaco
sintesi chimica e analisi della
molecola
studio del sito di legame tra le due
strutture
struttura-attività
efficacia del farmaco
Il bisogno di nuovi farmaci
Medical need:
esistono ancora malattie senza terapia o terapie inadeguate
effetti collaterali dannosi
le malattie si modificano nel tempo
nuove esigenze insorgono
Studi Tossicologici nella
sperimentazione preclinica
Gli studi tossicologici devono dare le
seguenti risposte:
Definire la dose massima che non causa alcun effetto,
diretto o indiretto, su organi o sistemi
Definire la dose che provoca effetti tossici e il tipo di
alterazioni indotte
Definire la relazione fra dose terapeutica e dose tossica
Individuare il bersaglio dell’effetto tossico (struttura
cellulare, organo o sistema) sia del composto originale che
dei suoi metaboliti
Definire se gli effetti sono reversibili
Tossicità acuta
Studio effetti tossici dopo somministrazione di una dose
singola in 2 specie animali.
Due vie di somministrazione a dosaggi elevati:
osservazione effetti fino a 15 giorni.
Definizione della massima dose tollerata.
Mutagenesi
Test per valutare l’insorgenza di mutazioni geniche, danni
al DNA e/o cromosomici.
Prove su batteri e/o cellule di mammifero.
Tossicità per somministrazioni ripetute
Valutazione tossicità subacuta (fino a 3 mesi) subcronica (fino a 6
mesi) e cronica (6-12 mesi)
Le prove sono diverse se si tratta di un antibiotico (usato per 1
settimana) o di un antiipertensivo (usato per tutta la vita)
Si studiano 3 dosi, somministrate tutti i giorni, utilizzando la stessa
via di somministrazione prevista per l’uomo
A tempi definiti si valutano le condizioni degli animali, l’insorgenza di
sintomi e alla fine si analizzano organi e apparati.
Tossicità per la riproduzione
Valutazione degli effetti sulla fertilità, sullo sviluppo peri- e postnatale, sulla possibilità di indurre malformazioni (teratogenesi)
Uso del ratto, trattato con 3 o più dosi. I composti in studio vengono
somministrati a maschi e femmine per lunghi periodi prima
dell’accoppiamento e poi si valuta l’indice di fertilità
Per la teratogenesi si usa anche il coniglio.
Il farmaco viene somministrato alla madre durante la gravidanza.
Cancerogenesi
Studi per escludere i rischi nell’uomo, soprattutto quando è previsto
il trattamento per lunghi periodi.
Le prove sono richieste nel caso di molecole a struttura chimica
capace di indurre rischio cancerogeno o quelle che si accumulano in
organi durante le prove di tossicità.
Si studiano gli effetti di 3 dosi nel topo e nel ratto durante il
periodo di 2 anni. Si analizzano almeno 50 fra organi e apparati.
Tossicità speciali
Studi che si rendono necessari su farmaci che hanno rischi di
particolari tossicità oppure per molecole su cui esistono dubbi nati
durante altre prove di tossicità. Per esempio si possono valutare le
proprietà immunogeniche o allergizzanti e studiare la tollerabilità
locale.
Sperimentazione dei farmaci sull’uomo
Una molecola candidata a diventare nuovo farmaco deve essere
sperimentata sull’uomo
Se il profilo farmacologico e tossicologico soddisfa le condizioni di
efficacia e sicurezza
Si richiede alle autorità sanitarie di iniziare gli studi clinici
Ministero della salute
Comitato etico
delle strutture universitarie o ospedaliere nelle quali si
effettua la sperimentazione
Good clinical practices
Norme internazionali di etica e di qualità necessari alla progettazione, conduzione,
registrazione e relazione degli studi clinici che interessano soggetti umani.
Corretta conduzione sperimentazione clinica
Rispetto dei diritti del malato
Informazione dettagliata sui rischi
Garanzia veridicità dei risultati
Studi allargati (circa 1000 soggetti) e multinazionali
(diverse nazioni)
Modelli animali
nei saggi farmacologici
La sperimentazione su organismi viventi ha una
storia antica:
romani e greci pubblicarono osservazioni di
fisiologia e patologia su animali
Galvani e i suoi studi sulla rana contrazione dei muscoli
in Gran Bretagna durante il XX secolo
c’è stato un aumento esponenziale del
numero di animali usati nella
sperimentazione
proteste dell’opinione pubblica
La legislazione sulla sperimentazione animale in Europa è
relativamente recente
Decreto 116 del 27 gennaio 1992
Art. 2 stabilisce l’utilizzo di animali allevati appositamente per
sperimentazione in stabilimenti specializzati
Art. 3 uso consentito solo per le prove di efficacia e tossicità dei
farmaci, per lo studio di effetti tossicologici ambientali e per studi di
fisiologia generale
Art. 4 la sperimentazione è consentita solo quando non esista altro
metodo valido per ottenere i risultati previsti
gli esperimenti devono essere condotti in anestesia generale o locale
gli animali non possono essere usati per piu’ di un esperimento
solo i laureati in medicina, veterinaria e biologia sono abilitati
all’esecuzione di sperimentazione su animali
recente è l’inserimento tra questi dei laureati in farmacia e CTF
Art. 9
Sono soggetti ad autorizzazione ministeriale:
- gli esperimenti su cani, gatti, primati non umani
- esperimenti di tossicità cronica o di analgesia che
inducono un certo disturbo nell’animale (ad es):
stimolazione per alcuni secondi delle zampe del topino
con piastra calda
iniezione nel peritoneo di una soluzione diluita di acido
acetico
le stimolazioni usate sono minimali ma i protocolli
sperimentali devono essere validati dal Ministero della
Sanità
NORME per la STABULAZIONE degli ANIMALI
Gli stabulari devono rispondere a precise
caratteristiche
ambientali:
ventilazione,
temperatura, umidità, ciclo buio-luce, dimensioni
delle gabbie.
Le strutture pubbliche devono effettuare una
registrazione e possono ottenere l’autorizzazione
dopo visita dei funzionari del Ministero che ne
controllano l’idoneità
Le sanzioni pecuniarie per inadempienza arrivano
fino a 70000 euro e quelle penali fino a 3 anni di
carcere.
NORME per la STABULAZIONE degli ANIMALI
Controllo periodico di vari fattori…
Situazione ad oggi sulla sperimentazione
animale nella pratica sperimentale
Prevalenza roditori (topi, ratti)
sperimentazione prevalente nel campo dell’immunologia,
malattie infettive, effetti tossici dei farmaci, teratologia,
oncologia, ecc.
In Italia il numero di sperimentazioni con animali è
diminuito
….nessuno controlla l’uso del cuoio, pellicce,
derattizzazioni??
Gli animali da laboratorio in farmacologia
Topi
Vantaggi:
piccola taglia
riduzione gabbie e spese di mantenimento e quantità di
sostanza necessaria per la sperimentazione
rapida maturazione e tempo di gravidanza
Svantaggi:
parametri relativi all’apparato cardiovascolare diversi (elevato
consumo di ossigeno) rispetto agli esseri umani
La condizione nello stabulario riduce le difese immunitarie
Mappe genetiche
e
paragone con l’uomo
Rispetto al genoma umano, quello del ratto e'
piu' piccolo, ma e' piu' grande di quello del topo.
Tutti e tre hanno comunque dimensioni
paragonabili, comprese fra 25.000 e 30.000 geni.
solo apparentemente simile al
topo, il ratto ha un corredo di geni
molto piu' vicino a quello dell'uomo
e di conseguenza e' un alleato
prezioso quando si tratta di
sperimentare gli effetti di nuovi
farmaci e nuove terapie, prima di
passare ai test sull'uomo, oppure
di conoscere le complesse basi
genetiche di malattie molto
comuni, come quelle
cardiovascolari, dall'infarto
all'ictus, all'ipertensione.
Es. Topi «umanizzati» per curare l’Aids
Creati con lo stesso sistema immunitario dell’uomo.
Ratti
sono piu’ grandi del topo e presentano minore consumo di
ossigeno (ma non rispetto all’uomo)
Tumori spontanei assenza in animali giovani
Artrite simile a patologia umana
Conigli
Facilità nell’effettuare prelievi di sangue
Isolare grandi quantità di anticorpi
Cavie
Usati per lo studio di processi infiammatori infettivi e
allergici
From the following article:
Cancer in rodents: does it tell us about
cancer in humans?
Vladimir N. Anisimov, Svetlana V.
Ukraintseva & Anatoly I. Yashin
Nature Reviews Cancer 5, 807-819
(October 2005)
Estrapolazione dei dati sperimentali
ottenuti con la sperimentazione animale agli
esseri umani
Differenze ratto/uomo
differenze anatomiche: es. fegato
Incidenza tumori
Livelli di colesterolo ematico
livelli di acido urico (catabolismo purine) (> tossicità farmaci x uomo)
Assorbimento saccarina (completo nell’uomo, 50%
nel ratto) ad altissime dosi si è dimostrato cancerogeno negli animali
Summary
Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology
December 2006, Vol. 2, No. 6, Pages 875-894
Species differences between mouse, rat, dog, monkey and human CYP-mediated
drug metabolism, inhibition and induction
Marcella Martignoni ‌ 1, Geny MM Groothuis ‌2 & Ruben de Kanter ‌3
Animal models are commonly used in the preclinical development of new drugs to predict the metabolic
behaviour of new compounds in humans. It is, however, important to realise that humans differ from
animals with regards to isoform composition, expression and catalytic activities of drug-metabolising
enzymes. In this review the authors describe similarities and differences in this respect among the
different species, including man. This may be helpful for drug researchers to choose the most relevant
animal species in which the metabolism of a compound can be studied for extrapolating the results to
humans. The authors focus on CYPs, which are the main enzymes involved in numerous oxidative
reactions and often play a critical role in the metabolism and pharmacokinetics of xenobiotics. In
addition, induction and inhibition of CYPs are compared among species. The authors conclude that
CYP2E1 shows no large differences between species, and extrapolation between species appears to hold
quite well. In contrast, the species-specific isoforms of CYP1A, -2C, -2D and -3A show appreciable
interspecies differences in terms of catalytic activity and some caution should be applied when
extrapolating metabolism data from animal models to humans.
modelli animali portatori di patologie
es. capre miotoniche, topi e cani distrofici,
topi obesi e ipertesi, ecc.
Topi transgenici
Vengono ottenuti prelevando ovociti da una femmina di topo fecondata e
introducendo il transgene previamente prodotto per clonazione nel nucleo
dello zigote. Quest'ultimo viene fatto dividere due o tre volte in vitro e
reimpiantato nella femmina gravida. Il controllo viene effettuato tramite
prelievo di sangue e successiva PCR
Il primo topo knockout fu creato da Mario
Capecchi, Martin Evans ed Oliver Smithies
alla fine degli anni ottanta, ed è valso loro il
Premio Nobel per la medicina (ottobre 2007).
Topi knock-out
Individuato il gene d'interesse, si prepara una sequenza di DNA che contiene gli
estremi simili a quelli della porzione da modificare, mentre l'interno è diverso.
La sequenza è inserita (mediante elettroporazione) all'interno di cellule
staminali embrionali, poi reinserite dentro una blastocisti e poi in un animale
che porta avanti la gravidanza. Questa tecnica permette di inattivare i geni.
In realtà, con la stessa tecnica possono essere ottenuti risultati importanti e
diversi: esistono animali definiti knock-in, poiché il gene non è inattivato ma
modificato, con l'aggiunta o rimozione di porzioni.
Lo studio di animali knock-out ha permesso di comprendere il ruolo di molti
geni, alcuni dei quali già studiati senza successo in vitro.
Topi transgenici
Uso del topo (mus musculus)
Vantaggi: Prolificità, basso
maneggevolezza del genoma
costo,
ragioni
bioetiche,
conoscenza
e
Largo impiego nella ricerca biomedica fin dagli anni 80
Problemi emergenti:
aspetti etici che riguardano la salvaguardia del benessere animale:
la modificazione del genoma può provocare in modo diretto o indiretto
sofferenza agli animali; topi geneticamente modificati potrebbero evadere
dagli allevamenti controllati andando ad interferire con le popolazioni
endemiche locali con il rischio di creare perturbazioni ecosistemiche
Utilità:
possibilità di scegliere i caratteri genotipici su cui lavorare riducendo al
minimo le interferenze;
combinazioni di caratteri può essere ottenuta in una generazione;
trasferimento di materiale e informazioni genetiche tra specie
filogeneticamente molto distanti
GLP e protocolli sperimentali
complesso di regole riguardanti:
organizzazione
programmazione
esecuzione
controllo
registrazione
archiviazione
delle ricerche di laboratorio
per le prove non cliniche
Saggi in vitro
Organi isolati
Cellule isolate
Componenti cellulari
Saggi in vivo
Organismi
Protocollo sperimentale
Un esperimento (dal latino ex, "da", e perire, "tentare",
"passare attraverso") scientifico è la realizzazione di
un'operazione empirica atta ad accertare o ricercare
qualche cosa di specifico, come i meccanismi di un fenomeno
per studiare, validare o confutare una ipotesi nell'ambito di
una teoria, oppure semplicemente osservare gli avvenimenti
in maniera approfondita per migliorare la conoscenza di
fenomeni di qualunque tipo.
Valutazione effetto dei farmaci
Condizioni ambientali organi sopravviventi
Importante il medium che deve permettere all’organo di
sopravvivere in vitro per tutta la durata dell’esperimento
PLASMI SALINI
Composizione salina
Concentrazione ossigeno disciolto nel liquido pO2
Concentrazione H2CO3 disciolto nel liquido pCO2
pH
temperatura
L’ambiente extracellulare ed intracellulare sono separati da membrana
plasmatica. Il disequilibrio ionico tra l’esterno e l’interno genera una
differenza di potenziale elettrico fondamentale per i fenomeni cellulari
potenziale di membrana
Sali fondamentali per plasma
Soluzione Ringer (mM)
NaCl 148 KCl 4.5
CaCl2 2 MgCl2 1
NaHCO3 12 NaHPO4 0.44 (sistemi tampone)
Glucosio per mantenere l’osmolarità e fornire energia
pH = 7.2-7.3
Soluzione fisiologica con le stesse concentrazioni
ioniche del liquido interstiziale
Gas di areazione
Carbossigeno (95% O2 5% CO2)
Quest’ultimo contribuisce a formare il tampone acido carbonico
/bicarbonato che mantiene il pH della soluzione fisiologica stabile
Applicazione di farmaci su tessuto
Farmaco (dosi diverse)
Organo mantenuto in vitro in
soluzione fisiologica
Identificazione recettori
Funzione canali ionici
Scoperta nuovi farmaci
Valutazione degli effetti
farmacologici e tossicità
Sia per i saggi in vitro che in vivo si fa una
valutazione degli effetti farmacologici e/o
tossicologici
Gruppo trattati
Gruppo controlli
valutazione
mediante tecniche adeguate
confronto dei risultati
mediante test statistici