1 - Titolo: Neuroanatomia chimica di marcatori di sinapsi in corteccia

Titolo: Neuroanatomia chimica di marcatori di sinapsi in corteccia cerebrale e ippocampo
di animali normali e patologici: ottimizzazione dell’approccio statistico per studi
quantitativi
Tutor: Laura Calzà
Progetto di ricerca
Background
L’applicazione di tecniche immunoistochimiche allo studio neuroanatomico ha fornito
uno strumento straordinario non solo per la indagini descrittive, ma anche per studi
morfologici quantitativi. Questi studi consentono di descrivere su base statistica le
differenze strutturali legate ad esempio ad una patologia, e all’eventuale effetto di
trattamenti farmacologici. In particolare, nello studio dei modelli animali di malattia di
Alzheimer, la descrizione della sede anatomica di localizzazione di specifici difetti della
sinaptologia ha consentito di identificare come le alterazioni sinaptiche siano molto
precoci, comparendo ben prima delle lesioni diagnostiche della malattia (degenerazione
neurofibrillare e placche di amiloide). Questi studi stanno portando ad una profonda
revisione dell’ipotesi amiloidogenica della malattia di Azheimer (Arendt, 2009;
Castellani and Smith, 2011; Karran et al., 2011). In particolare, in due modelli classici
per la malattia di Alzheimer (topo geneticamente modificato per overesprimere le forme
mutate di amyloid precursor protein –APP- e/o preseniline –PS-; cane anziano che
spontaneamente sviluppa la patologia di tipo Alzheimer) lo studio della distribuzione e
quantità di proteine presinaptiche e postsinaptiche sui dendriti apicali di neuroni
piramidali in corteccia cerebrale e corteccia ippocampale, ha indicato come la riduzione
della densità sinaptica (immunoreattività per la sinaptofisina) sia precoce ma anche
reversibile (Crew et al., 2010; Ghi et al., 2009). L’utilizzo estensivo di queste tecniche
anche su altri modelli animali di malattia neurodegenerativa, necessita però di una
ridefinizione dei criteri sperimentali adottati, sia sul piano tecnico che statistico, al fine di
poter ottenere risultati attendibili anche utilizzando una numerosità bassa nelle coorti di
campioni, esigenza questa spesso dettata o dalla bassa fertilità di animali transgenici, o
dalla modesta disponibilità di patologie spontanee. E’ quindi necessario ottimizzare la
conoscenza delle variabili che incidono criticamente sulla variabilità sperimentale e
quindi sulla previsione di numerosità dei campioni inseriti nelle diverse coorti in fase di
preparazione del disegno sperimentale.
I criteri statistici sui quali impostare la sperimentazione devono comprendere:
- variabilità individuale del parametro indagato;
- variabilità intra-sperimentale;
- variabilità inter-sperimentale;
- definizione dei criteri di accettabilià del risultato.
E’ noto che aumentare la numerosità delle coorti di soggetti non è sempre una corretta
strategia per indagare l’esistenza di differenza fra le stesse. La modalità di raccolta dei
dati sul singolo individuo risulta essere molte volte un fattore critico per ridurre la
variabilità (e consentire quindi la riduzione della numerosità delle coorti). L’applicazione
-1-
di questo concetto, già ampiamente presente nella letteratura scientifica, agli studi
neuroanatomici necessita di una standardizzazione delle numerose procedure che portano
alla lettura del preparato anatomico a microscopio, delle procedure di acquisizione,
gestione e analisi dell’immagine.
Obiettivo delle studio
Il nostro laboratorio impiega da molti anni le tecniche immunoistichimiche e l’analisi
quantitativa dell’immagine per lo studio anatomico del cervello normale e patologico,
utilizzando modelli animali di patologia sperimentale e spontanea, e patologia umana
(D'Intino et al., 2005, 2006; Paradisi et al., 2010). In particolare, negli anni più recenti si
è impegnato nello studio della sinaptologia di animali portatori di difetti cognitivi, quali i
topi geneticamente modificati per modellizzare la malattia di Alzheimer e il possible
effetto di trattamenti farmacologici (Imbimbo et al., 2010; Balducci et al., 2011). Questi
studi sono stati eseguiti su coorti di grande numerosità (N=12-20), con conseguente
altissimo costo sia in termini di materiali che di tempo-uomo. L’esperienza maturata in
questi anni suggerisce che ci siano margini per una ottimizzazione del disegno statistico
di questi esperimenti, mirato sia alla riduzione della numerosità delle coorti che alla sua
estensione ad altri modelli di malattie neurodegenerative.
Obiettivo di questo progetto è definire il coefficiente di variabilità intra- e interesperimento dello studio morfometrico di MAP2, sinaptofisina e sinaptobrevina nella
corteccia cerebrale (prefrontale/mediale limbica) e nella corteccia ippocampale (CA1),
eseguita mediante colorazione triplice. Saranno utilizzati topi geneticamente modificati
per overesprimere una forma mutata (APP695 con doppia mutazione KM670/671NL)
della proteina APP umana (hSwAPP), studiati a diverse età e comparati con wild-type di
pari età. I dati così ottenuti su singolo animale, saranno analizzati mediante statistica
correlativa con i risultati individuali di performamce in test comportamentali di
apprendimento e memoria (Y-maze e contextual fear conditioning realizzati mediante
tecnica computerizzata di video tracking) e analisi di espressione dei mRNAs delle
proteine indicate (real-time PCR).
Risultati attesi
Ci si propone di definire e stimare le principali variabili sperimentali per la definizione
dei criteri statistici da applicare al disegno di esperimenti di neuroanatomia chimica per
modelli animali sperimentali (topi geneticamente modificati) e spontanei (cane anziano)
di patologie neurodegenerative.
Ci si propone di definire:
- influenza del fluorocromo sulla variabilità del risultato;
- influenza della modalità di campionamento (precisione anatomica) sulla
variabilità del risultato;
- influenza della durata complessiva delle procedure di allestimento delle sezioni
sulla variabilità del risultato;
- influenza della durata complessiva delle procedure di acquisizione delle immagini
sulla variabilità del risultato;
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-
influenza della modalità di acquisizione (sectioning Z mediante microscopia
confocale a scansione laser vs sectioning Z mediante CCD camera raffraddata e
software di deconvoluzione) sulla variabilità del risultato.
Da questi parametri ci si aspetta di poter definire criteri di disegno di esperimenti basati
sui principi della power analysis for sample size definition da applicare a studi
neuroanatomici di alterazioni fisiologiche o patologiche (performance del test), che
comprendano:
- criteri di predittività del numero dei soggetti nelle singole coorti;
- numero di sezioni per soggetto;
- numero di immagini per sezione.
Questi risultati saranno testati su un programma statistico adeguato (es. Power and
Precision) e applicati al progetto Telethon GGP11147 “Molecular mechanisms
underlying brain alterations in the CDKL5 variant of Rett's syndrome” per i quali è
prevista la generazione di nuovi animali geneticamente modificati dei quali non è nota la
fertilità.
Metodi
Immunofluorescenza indiretta:
Intensificazione mediante TSA:
SOP M-P13
SOP M-P18
Saranno testati i seguenti fluorocromi (green, red, far-red):
DyLight 488, DyLight 405; Rhodamine Red-X, Cy5
Microscopia:
-
SOP MIA-P4
SOP MIA-P10
confocale a scansione laser: Nikon A1
microscopia a fluorescenza Nikon E600 con motorizzazione piano Z e software
acquisizione e deconvoluzione NIS-Ar
Refs.
Arendt T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 2009,
118:167-79.
!B!a!l!d!u!c!c!i! !C!,! !M!e!h!d!a!w!y! !B!,! !M!a!r!e! !L!,! !G!i!u!l!i!a!n!i! !A!,! !L!o!r!e!n!z!i!n!i! !L!,! !S!i!v!i!l! i!a! !S!,! !G!i!a!r!d!i!n!o! !L!,! !C!a!l!z!à
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!C!H!F!5!0!7!4! !R!e!s!t!o!r!e!s! !M!e!m!o!r!y! !a!n!d! !H!i!p!p!o!c!a!m!p!a!l! !S!y!n!a!p!t!i!c! !P!l!a!s!t!i!c!i!t!y! !i!n! !P!l!a!q!u!e!-!F!r!e!e! !T!g!2!5!7!6!
!M!i!c!e!.! J! A
! !l!z!h!e!i!m!e!r!s! !D!i!s!.! !2!0!1!1!, 2!4!:!7!9!9!-!8!1!6!.
Castellani RJ, Smith MA. Compounding artefacts with uncertainty, and an amyloid
cascade hypothesis that is 'too big to fail'. J Pathol. 2011, 224:147-52.
-3-
Crews L, Rockenstein E, Masliah E. APP transgenic modeling of Alzheimer's disease:
mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain Struct Funct. 2010,
214:111-26.
D'Intino G, Paradisi M, Fernandez M, Giuliani A, Aloe L, Giardino L, Calzà L. Cognitive
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102:3070-5.
D'Intino G, Vaccari F, Sivilia S, Scagliarini A, Gandini G, Giardino L, Calzà L. A
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Ghi P, Di Brisco F, Dallorto D, Osella MC, Orsetti M. Age-related modifications of egr1
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Karran E, Mercken M, Strooper BD. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's
disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2011
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Imbimbo BP, Giardino L, Sivilia S, Giuliani A, Gusciglio M, Pietrini V, Del Giudice E,
D'Arrigo A, Leon A, Villetti G, Calzà L. CHF5074, a novel gamma-secretase modulator,
restores hippocampal neurogenesis potential and reverses contextual memory deficit in a
transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2010, 20:159-73.
Paradisi M, Fernández M, Del Vecchio G, Lizzo G, Marucci G, Giulioni M, Pozzati E,
Antonelli T, Lanzoni G, Bagnara GP, Giardino L, Calzà L. Ex vivo study of dentate
gyrus neurogenesis in human pharmacoresistant temporal lobe epilepsy. Neuropathol
Appl Neurobiol. 2010, 36:535-50.
-4-
Attività previste per l’assegnista
Conoscenze da acquisire:
-
Completa autonomia sulle procedure di singola, doppia e triplice colorazione in
immunofluorescenza indiretta su sezione di tessuto;
Completa autonomia sulle procedure di intensificazione mediante tecnica TSA;
Conoscenza anatomica delle aree della corteccia prefrontale e anteriore cingolata
in topo e cane;
Conoscenze di base di microscopia confocale a scansione laser;
Conoscenze di base di acquisizione di immagini a fluorescenza singola e multiple
mediante CCD camera e softwere di deconvoluzione.
Esperienze formative:
E’ previsto che l’assegnista frequenti il laboratorio di neurochimica (Prof. S. Tanganelli)
presso la Sezione di Farmacologia del Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale
dell’Università di Ferrara, per studi neurochimici correlati (K +-evoked release di
neurotrasmettitori da preparazioni di sinaptosomi), al fine di ottenere dati neurochimici
comparativi sulla funzionalità del versante presinaptico, da correlare con i dati
morfologici ottenuti. Questi esperimenti saranno condotti su topi Tg2576, sacrificati nelle
stesse condioni (età, sesso, stabulazione, etc) degli animali usati per gli studi morfologici.
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Progetto a supporto del cofinanziamento.
Founding Agency:
Comitato Telethon Fondazione Onlus
Project code:
GGP11147
Project Title:
Molecular mechanisms underlying brain alterations in the CDKL5
variant of Rett's syndrome
Oct/Nov 2011-14
Duration:
task in the project Dr. Laura Calzà (Partner 1) will carry out the behavioural,
neuroanatomical and neurochemical characterization of the Cdkl5
mouse model (WP 6.1,6.2)
task for post-doc
6.2, as follow
6.2 Neuropathological and neurochemical characterization
Preliminary observations of the central and peripheral nervous system will be carried out
to detect gross abnormalities. Brains, spinal cords, dorsal root and sympathetic ganglia
will be collected at different developmental times (2 prenatal, 3 postnatal), embedded and
serially sectioned to run morphological and morphometric analyses. Volume of brain
structures and neuronal density of defined brain areas (cortical areas, hippocampus) will
be determined by unbiased stereologic approach using a appropriate software. Dendritic
tree analysis will be performed on diolistic staned section by means of confocal images
using the 3D image analysis software Imaris. According to the results of these
observations, immuno-histochemistry will be used for qualitative and quantitative
analysis of the main neurotransmitter systems (aminergic, cholinergic, glutamatergic and
GABAergic systems). The age-dependent evolution of neurogenic areas in the
subventrular zone and dentate gyrus will be also monitored by in vivo and ex-vivo
(neurosphere assay) analysis. Finally, at the indicated time-points, the expression profiles
of growth factors (NGF, BDNF, CNTF, GDNT, VEGF) and related receptors will be
monitored by RT-PCR. According to behavioural results, selected ages and groups will
be included in mRNAs expression studies. T!h!e! !M!o!u!s!e! !S!y!n!a!p!t!i!c! !P!l!a!s!t! i!c!i!t!y! !R!T! !P!r!o!f!i!l!e!r
!P!C!R! !A!r!r!a!y! !p!r!o!f! i!l!e!s! by SABiosciences will be used, to study !t!h!e! !e!x!p!r!e!s!s! i!o!n! !o!f! !8!4! !k!e!y!
!g!e!n!e!s! !c!e!n!t!r!a!l! !t!o! !s!y!n!a!p!t!i!c! !a!l!t!e!r!a!t! i!o!n!s! !d!u!r!i!n!g! !l!e!a!r!n!i!n!g! !a!n!d! !m!e!m!o!r!y!. the list of the genes
will include Immediate-Early Response Genes (IEG); Long Term Potentiation (LTP)
related genes; Long Term Depression (LTD) related genes; Cell Adhesion and
extracellular matrix genes; CREB Cofactors; Postsynaptic Density related genes.
-6-
Informazioni aggiuntive relative al tutor
Carico didattico:
Cellule staminali in Medicina Rigenerativa, Facoltà di Medicina Veterinaria
Biotecnologie Cellulari, Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Scienze Cognitive, Facoltà di Lettere e Filosofia
8CFU
6CFU
6CFU
Altre attività connesse alla ricerca (ultimi 4 anni):
Coordinamento/partecipazione a progetti di ricerca:
Titolo:
Ente finanziatore:
Durata:
Ruolo:
Titolo:
Ente finanziatore:
Durata:
Ruolo:
Titolo:
Ente finanziatore:
Durata:
Ruolo:
Titolo:
Ente finanziatore:
Durata:
Ruolo:
Titolo:
Cellule staminali animali per la riparazione tissutale:
allestimento di prodotti e protocolli per laboratori di ricerca
(Animal Stem Cell Laboratory)
Regione Emilia Romagna, Programma Regionale per la Ricerca
Industriale, l'Innovazione e il Trasferimento Tecnologico
2004-2007
responsabile di progetto
Laboratorio Regionale di Innovazione nelle Scienze della Vita
(BioPharmaNet)
Regione Emilia Romagna, Programma Regionale per la Ricerca
Industriale, l'Innovazione e il Trasferimento Tecnologico
2008-2010
responsabile di UO (Cellule staminali somatiche: sviluppo ed
applicazioni; Preclinica: diagnostica molecolare e modelli di
malattia
Effetto dell’esposizione prenatale a dosi subtossiche di 2,3,7,8tetraclodibenzo-p-diossina sullo sviluppo e la maturazione del
cervello endocrino.
MIUR-PRIN
2008-2010 (bando 2007)
responsabile di progetto
Genomica, Proteomica e Metabolomica nello Spazio (GPM)
Agenzia Spaziale Italiana/Roma La Sapienza, Dipartimento di
Medicina Sperimentale e Patologia dell’Università di Roma “La
Sapienza
2010-12
responsabile di UO (NMR-based metabolomics of the cellular
adaptive response: neural precursor cells (NPCs) expansion and
differentiation under simulated microgravity and hypoxia.)
Molecular mechanisms underlying brain alterations in the
CDKL5 variant of Rett's syndrome
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Ente finanziatore:
Durata:
Ruolo:
CDKL5 variant of Rett's syndrome
Telethon
2011-14
responsabile di UO
Incarichi istituzionali relati alla ricerca:
- Direttore del Centro Interdipartimentale per la Ricerca Industriale Scienze della Vita e
Tecnologie per la Salute
- Referente Scientifico della Piattaforma Scienze della Vita, Rete Alta Tecnologia
Regione Emilia Romagna
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