Lezione n.2
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Corso di Formazione GenHORT 2013 Fondamenti di nutraceutica II Antonella Leone Dipar.mento di Farmacia Università di Salerno Pun. di controllo di flussi metabolici nelle piante: possibili strategie di ingegneria metabolica PRECURSORE Enzima limitante 3 Pathway in competizio 2 ne F B C D Fattore di trascrizione 1 Inibizione da feedback A 5 2 Inibizione di vie laterali compe..ve 3 Eliminazione dell’inibizione da feedback 4 Ottimizzazione della compartimentalizzazione/trasporto (sovra-espressione di geni coinvolti nel trasporto) E PRODOTTO FINALE 1 Sovraespressione di geni che regolano reazioni chiave (costitutiva, inducibili, tessutospecifica) 4 Compartimentalizzazione 5 Regolazione dei geni biosintetici mediante sovra-espressione di fattori di trascrizione Un processo mediante il quale il genoma di un organismo può essere modificato attraverso l’integrazione di uno o più geni “esogeni” (transgeni) Il gene esogeno (transgene )deve 1 Entrare nella cellula vegetale 2 Essere integrato nel genoma della cellula Essere espresso (ubiquitariamente/o in maniera controllata/ in specifici tessuti) 3 1 2 Due metodi principali: Indiretto : Agrobacterium - mediated gene transfer Diretto: elettroporazione, gene-gun 3 Uso promotori specifici che permettono l’espressione del gene esogeno quando e dove si vuole nella pianta Trasferimento del gene/i esogeno7i mediante Agrobacterium tumefaciens • • • • • E’ il metodo più comune per modificare geneticamente le piante dicotiledoni sopratutto Si usa il batterio Agrobacterium tumefaciens, un batterio che naturalmente trasforma il genoma di cellule vegetali durante l’infezione Agrobacteria – Sono batteri del suolo, gram-negativi – Due specie utilizzate per il trasferimento di un gene esogeno: tumefaciens- causa la formazione di galle tumorali rhizogenes- causa la formazione di radici avventizie Galla del colletto causata da A. tumefaciens Il batterio Agrobacterium tumefaciens è un patogeno che causa una malattia conosciuta come tumore del colletto Tumore del colleJo Agrobacterium tumefaciens cresciuto su mezzo artificiale in capsule Petri Agrobacterium sulla superficie di cellule di carota Carota Tabacco Kalanchoe Formazione di radici avventizie mediante trasformazione con A. rhizogenes • L’infezione avviene al livello di ferite • Richiede un processo di riconoscimento e di segnali chimici • Le galle sono dei tumori reali, possono essere rimossi e crescere indefinitivamente senza ormoni vegetali • Questo significa che l’informazione genetica responsabile per la formazione della galla deve essere trasferita dal batterio alla cellula vegetale Le caratteristiche del tumore indotto da A. tumefaciens • Si accumulano dei specifici aminoacidi, chiamate “opine” – Le octopine e la nopalina derivano dall’arginina – agropina - deriva dal glutammato • Le opine, invece, variano nei diversi ceppi di A. tumefaciens • Le opine vengono sintetizzate dalla pianta, ma vengono usate del batterio come fonte di azoto (tumor-inducing principle) • È stato dimostrato che i ceppi virulenti di A. tumefaciens possono perdere la virulenza e i ceppi avirulenti possono riacquistare la virulenza: questo suggerisce la presenza di un elemento extra-cromosomale • Plasmidi di grandi dimensioni sono presenti in A. tumefaciens. La loro presenza è associata alla virulenza del batterio: sono stati chiamati plasmidi Ti : Tumor-inducing Plasmide Ti cromosoma batterico T-DNA geni vir Trasformazione gene.ca delle piante n. Infezione di A. tumefaciens e formazione di galle tumorali DNA cromosomiale Cromosoma Plasmide Ti T-DNA T-DNA galla A. tumefaciens Cellula vegetale trasformata Il plasmide Ti “tumor-inducing” 200 ~ 800 kb T-DNA: Transferred DNA; 10~30 kb Ti plasmid Virulence proteins 16 • Grandi dimensioni (ca 200-kb) • ~10% of del plasmide è trasferito alla cellula vegetale dopo l’infezione • La porzione di DNA trasferito (chiamato T-DNA) si integra nel genoma nucleare della cellula ospite in maniera casuale • In genere una sola copia per cellula, più raramente copie multiple (può essere un problema) • Il plasmide Ti porta anche geni che codificano – enzimi per la sintesi delle opine; – enzimi per la sintesi di ormoni vegetali; – proteine responsabili della mobilizzazione del T-DNA (geni Vir) La regione T-DNA del plasmide Ti Contiene geni che si esprimono solo nelle piante Indispensbili per la formazione del tumore del colletto 1. Geni biosintetici per la sintesi - Auxina : iaaM e iaaH - Citochinina : tmr (ipt) 2. Geni per la sintesi di opine 18 T-DNA region • geni vir: essenziali per il trasferimento e l’integrazione della regione T-DNA • Auxine iaaM e iaaH : sintetizzano gli ormoni auxicini della crescita (acido indolacetico) Cytokinin Auxin Left border Opine • Citochinine - gene tmr (ipt): genera la citochinina trans-zeatina. Promuovono la crescita cellulare e la formazione delle galle Right border 12-24 kbp Opine catabolism vir genes ori • Opine: sono prodotti di reazioni di condensazione tra aminoacidi e keto acidi (es. nopaline, octopine, agropine). Sintetizzate e secrete dalle galle sono utilizzate come fonte di carbonio dall’Agrobacterium (geni iaaM, iaah per la sintesi di auxine ed iptZ citochinine) Induzione del tumore Sintesi di opine nopalina/ octopina Bordo destro Bordo sinistro T-DNA Catabolismo delle opine Trasferimento del T-DNA (geni vir A, G, E, C D, B) Plasmide Ti Origine di replicazione T-DNA LB e RB – bordo sinistro e bordo destro, 25-bp sequenze ripetute dirette auxA - triptofano mono-ossigenasi auxB - indolacetammide idrolasi cyt - isopentinil transferasi ocs - octopine sintasi Questi geni hanno nel promotore segnali tipici per l’espressione nelle cellule eucariotiche 1. iaaM and iaaH per la sintesi dell’auxina IAA tryptophan 2-monooxygenase (iaaM, tms1 or auxA) Tryptophan indole 3-acetamide hydrolase (iaaH, tms2 or auxB) Indole-3-acetamide Auxin (IAA) 22 1. Il gene ipt per la sintesi della citochinica cytokinin (shooting hormone) biosynthesis isopenteniltransferasi (ipt, tmr or cyt) citochinina (Isopentinil Adenina IPA) 23 auxA auxB Triptofano indoleacetammide acido indolacetico (auxina) cyt AMP + isopentenilpirofosfato isopentil-AMP (una citochinina) In seguito al trasferimento ed inserzione del T-DNA nel genoma della cellula vegetale aumenta il livello di questi ormoni, che stimolano la divisione cellulare e la formazione del tumore La regione T-DNA del plasmide Ti Contiene geni che si esprimono solo nelle cellule vegetali Indispensbili per la formazione del tumore del colletto 1. Geni biosintetici per la sintesi - Auxina : iaaM e iaaH - Citochinina : tmr (ipt) 2. Geni per la sintesi di opine 25 2. Geni per la sintesi delle opine (amminoacidi coniugati a zuccheri) Differenti tipi di opine a seconda del ceppo batterico of opinecomposti molto stabili. Sintetizzati solo nella cellula vegetale, dopo l’integrazione del T-DNA, secrete e usate dal batterio come fonte grazie ad enzimi presenti nel plasmide Ti (opine catabolism). Il plasmide Ti “tumor-inducing” 200 ~ 800 kb T-DNA: Transfer DNA; 10~30 kb Ti plasmid Virulence proteins • Si trovano sul plasmide • Favoriscono il trasferimento del T-DNA alla cellula vegetale • virA, B,C,D,E,F,G che occupano circa 30 kb del plasmide Ti • La loro espressione è attivata dall’acetosiringone, una sostanza fenolica prodotto dalle piante in seguito a ferita Plant signals (phenolic compound) respond to wounding induce vir gene expressions 29 Sostanze fenoliche prodotto in risposta a ferita per l’attivazione dei geni vir ~35 Kb, contiene 35 vir genes in sette operoni Le proteine vir sono essenziali per il trasferimento del TDNA e la sua integrazione nel genoma vegetale sequenze RB (right border) e LB (left border) - ~25 bp, indispensabile per il riconoscimento e taglio del T-DNA da parte di proteine vir il T-DNA è trasferito alla cellula vegetale mediante la via di secrezione di tipo IV (simile a quella utilizzata per la coniugazione batterica) come molecola lineare a singolo filamento. il T-DNA è integrato nei cromosomi della cellula vegetale . Funzione dei geni vir • virA - trasporta l’acetosiringone nel batterio e attiva posttraduzionalmente il gene virG; • Vir A è una chinasi di membrana che insieme a ChvE interagisce con il segnale fenolico esterno si autofosforila e successivamente fosforila la proteina citosolica virG, che funziona da attivatore trascrizionale di altri geni vir Compos. fenolici (Acetosiringone) Membrana dell’agroba@erio AAvazione della trascrizione di altri geni vir Funzione dei geni vir • virG - promuove la trascrizione di altri geni vir, legandosi a sequenze specifiche dei promotori dei geni vir • virD2- è una endonucleasi che taglia il T-DNA a livello dei bordi destro e sinistro, creando un T-DNA a singolo filamento che sarà trasportato nella cellula ospite Il prodotto così ottenuto è una molecola libera a singolo filamento ! (T-STRAND) alla cui estremità 5ʼ resta legata covalentemente la proteina ! VirD2.! Al T-STRAND libero si lega la proteina VirE2, una proteina che lega! il DNA a singolo filamento formando il T-COMPLEX che è la forma in cui ! viene effettivamente trasportato il T-DNA (evita lʼattacco di eventuali ! DNasi)! Queste due proteine svolgono un ruolo importante nel trasferimento ! del complesso nel nucleo delle cellule vegetali! -! • virE2- DNA-binding protein, si lega al T-DNA – virD2 & virE2 aiutano il T-DNA ad entrare nel nucleo della cellula vegetale; hanno tipicamente segnali NLSs per la localizzazione nel nucleo; • La traslocazione attraverso l’involucro batterico avviene grazie ai prodotti dell’operone virB (11 proteine che costituiscono un sistema di secrezionemicropili ) e dei geni presenti sul plasmide Ti che resta nel batterio Sostanze vola.li prodoJe dalle piante Cellula vegetale Sito specifico di aJacco dell’agrobaJerio membrana esterna spazio periplama.co membrana interna Sostanze vola.li si legano alla proteina di membrana VirA fosforilazione della proteina VirG Il T-­‐DNA si integra nel genoma della cellula vegetale T-­‐DNA associato alle proteine virE2 viene traslocato aJraverso i pori nucleari nel nucleo della cellula vegetale La proteina VirB forma un micropilo aJraverso il quale il T-­‐DNA viene traslocato fuori dalla cellula baJerica e verso la cellula vegetale La proteina VirG-­‐P aOva la trascrizione degli altri geni Vir Geni vir VirDendonucleasi taglia il T-­‐DNA in corripsondenza del LB e RBsingolo filamento a cui resta legata Vir E1 VirE2 e VirF sono trasportate nella cellula ospite Vir E2 si legerà al T-­‐DNA per evitarne la degradazione ChvE è un gene localizzato sul cromosoma di Agrobacterium tumefaciens coinvolto nell’attivazione della proteina di membrana virA L’inserzione del transgene nel genoma della pianta avviene mediante ricombinazione non omologa in punti del DNA che presentano tagli sul filamento double –strand ad esempio causati dall’azione delle topoisomerasi o di altri enzimi di riparazione del DNA Il plasmide Ti può essere, quindi, utilizzato per integrare un gene esogeno nel genoma di una cellula vegetale, ma sono necessarie alcune modificazioni : • Rimuovere i geni aux e cyt, per evitare la formazione del tumore; • Inserire un gene marcatore selettivo nel T-DNA; • Spostare i geni vir su un plasmide separato per ridurre le dimensioni del plasmide (più facile da maneggiare) Vettori di espressione in pianta derivati dal Plasmide Ti Ti plasmid plant vector Remozione dei geni per la sintesi degli ormoni genes Remozione dei geni per la sintesi delle opine Riduzione delle dimensioni del vettore (vedremo dopo) Aggiunta dell’origine di replicazione di E. coli (ori) ggiunta di un gene marcatore selettivo di E.coli Dentro la regione T-DNA (tra left and right border) aggiunta di un altro gene marcatore selettivo 40 Gene esogeno An intact T-DNA a recombinant Ti plasmid Il plasmide Ti può essere, quindi, utilizzato per integrare un gene esogeno nel genoma di una cellula vegetale, ma sono necessarie alcune modificazioni : • Rimuovere i geni aux e cyt, per evitare la formazione del tumore; • Inserire un gene marcatore selettivo nel T-DNA; • Spostare i geni vir su un plasmide separato per ridurre le dimensioni del plasmide (più facile da maneggiare) • La delezione dei geni auxinici e delle citochinine elimina • Sono stati inseriti dei marcatori selettivi batterici la formazione delle galle di E. coli (selectable shuttle vector) al di fuori della regione T-DNA • Inserimento di marcatori selettivi per pianta all’interno della regione T-DNA • Qualsiasi gene viene inserito all’interno della regione T-DNA sarà incorporato nel DNA della cellula vegetale (es. geni di resistenza ad erbicidi) • Le cellule vegetali trasformate vengono rigenerate come pianta intera attraverso la coltura in vitro. • Ogni cellula della nuova pianta conterrà il transgene • Le monocotiledoni non producono Acetosiringone in risposta ad una ferita--> per questo sono recalcitranti alla infezione da A. tumefaciens • Importante: qualsiasi frammento di DNA situato tra il LB e RB del T-DNA verrà trasferito nel genoma di una cellula vegetale Ci sono due principali problemi da superare nell’uso di A. tumefaciens: (1) Il plasmide Ti è di grandi dimensioni ed è difficile da manipolare (2) in alcuni casi problemi per la rigenerazione dell’ intera planta dal tumore Vettori per la trasformazione genetica delle piante Vettori cointegrati I geni vir e le sequenze da trasferire nel genoma vegetale T-DNA risiedono sullo stesso plasmide geni vir Vettori binari Geni vir I geni vir e le sequenze da trasferire nel genoma vegetale risiedono su plasmidi separati T-DNA VANTAGGIO: plasmidi più piccoli per il clonaggio del gene di interesse, che può essere fatto in E. coli, prima di trasferire il plasmide ricombinante ad un ceppo di A. tumefaciens • Clonare il gene esogeno tra il bordo destro ed il bordo sinistro del T-DNA • Co-trasformare l’ Agrobacterium con entrambi i plasmidi • Infettare la pianta con il batterio ricombinante • Selezionare le cellule effettivamente trasformate, in cui il gene esogeno si è integrato • Rigenerare la pianta transgenica 1. Clonaggio (creazione della cassetta d’espressione del transgene) 2. Trasformazione (via Agrobacterium o altro metodo) 3. Selezione piante trasformate (uso di marcatori selettivi) 4. Screening del materiale con appropriata espressione genica 5. Isolamento delle linee omozigoti 6. test delle piante ottenute (analisi molecolari e d’espressione genica) Isolamento della sequenza nucleo.dica di interesse Clonaggio della sequenza in un ada@o ve@ore di espressione Propagazione nodale Metodo di trasformazione Dire@o Analisi e cara@erizzazione molecolare Indire@o Selezione e differenziamento Radicazione Il gene esogeno deve 1 Entrare nella cellula vegetale 2 Essere integrato nel genoma della cellula 3 Essere espresso (dovunque e/o in maniera controllata/ in specifici tessuti) Uso promotori specifici che permettono l’espressione del gene esogeno quando e dove si vuole nella pianta Trasformazione genetica delle piante T-DNA selvatico T-DNA recombinante Organizzazione di un gene Gene Promotore DNA Sequenza codificante l’RNA 5’ 3’ Terminatore 3’ 5’ Sito di inizio della trascrizione Sito di terminazione della trascrizione Promotori Costitutivi promotori forti capaci di attivare il gene a valle in tutte le parti della pianta trasformata es. S35 CaMV (dicotiledoni) actina (monocotiledoni) Inducibili promotori che contengono sequenze regolatrici consensus capaci di attivare la trascrizione del gene a valle solo quando c’è uno stimolo endogeno o esogeno es. Acido abscissico Ferita da patogeno endogeno Tessuto specifici promotori con sequenze regolatrici consensus capaci di attivare la trascrizione del gene a valle solo in tessuti, organi particolari es. seme radici antere Sequenze consensus • sono sequenze nt di lunghezza variabile che si trovano nei promotori di geni inducibili o tessuto specifici. • la loro delezione di queste sequenze fa perdere l’inducibilità e la tessuto-specificità della trascrizione del gene strutturale a valle • patatina, proteina del tubero di patata • vicilina, proteine di riserva del seme di leguminose • Rubisco, proteina della fotosintesi (indotta da luce) • geni di resistenza a patogeni (indotti da giasmonato, acido salicilico) • geni di tolleranza a stress idrico (indotti da a. abscissico) …il ve@ore deve essere trasferito in A. tumefaciens o A. rhizogenes gene di interesse ampR Trasformazione batterica Vettore binario • CaCl2 • elettroporazione Crescita massiva Geni vir A. tumefaciens ricombinante Trasformazione genetica di piante via A. tumefaciens tagliare dei dischetti fogliari co-coltura con A. tumefaciens coltura liquida di A. tumefaciens in agitazione 30min-1h trasferimento su terreno per formazione di callo Trapianto in terreno dopo 3-4 settimane formazione di calli al margine dei dischi fogliari trasferimento su terreno induttore di radici auxine agente selettivo in coltura 2-4 settimane citochinine trasferimento su terreno stimolatore di germogli Effe@o del bilancio ormonale auxine/citochinine sul differenziamento di germogli e radici E aAvata l espressione di tu@a una serie di geni che perme@ono il differenziamento della parte epigea o radice Scrophularia sp Bilancio ormonale Auxine Alto Citochinine Basso Rizogenesi Embriogenesi Formazione di radici Formazione di callo Formazione di germogli avven.zi Crescita di germogli adcellari Basso Alto RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO dischetto fogliare co-coltivato CALLO GERMOGLI RADICI Auxina/Citochina Auxina/Citochina Auxina/Citochina RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO radici Auxina/Citochina germogli Auxina/Citochina Produzione di una pianta transgenica Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI Alcuni protocolli elaborati hanno permesso l’utilizzo di A.tumefaciens anche in mais e riso Le monocotiledoni non producono Acetosiringone in risposta ad una ferita--> per questo sono recalcitranti alla trasformazione con A. tumefaciens Sono necessari per queste specie altri sistemi di trasferimento ed integrazione del gene esogeno nel genoma della cellula vegetale METODI DIRETTI DI TRASFORMAZIONE M E T O D I D I R E TT I D I TRA S F O RMAZ IO N E GE N E T I CA D E LL E PI ANT E • • • • • M icr o-p r o ie tt ili/GE N E G UN T ra tt ame nto c on PEG Ele tt r opo razi on e M icr o- i n iezi on e d i DNA I nf il t razi on e p r otop las t i C ell u la ve g e t ale p riva d i p ar at e T ra tt ame nto c on e n zimi • cell u lasi • p ec t i n asi • Trasformazione genetica delle piante : metodo biolistico plasmide Particelle • oro (1.5-3.0 µM) • tungsteno • callo • cellule • embrioni • Usato soprattutto per piante recalcitranti alla trasformazione genetica diretta (es. MONOCOTILEDONI) • Trasformazione genetica delle piante : metodo biolistico • Piccole sfere metalliche coperte da DNA (micro-carrier) • Contenute in microproiettili di oro teflon (macro-carrier) Cellule da bombardare • Accelerazione dei macroproiettili ed entrata dei microproiettili all’interno della cellula vegetale • Tessuti ed organi vegetali bombardati Cellule, embrioni, tessuti fogliari, fiori, semi etc macroproiettile Cellule Particelle coperte di DNA Trasformazione gene.ca delle piante n. Trasformazione gene.ca delle piante n. Metodi di trasformazione genetica delle piante Agroinfezione A. tumefaciens Co-coltura di Agrobacterium con frammenti di piante Metodo biolistico Plasmide Ti con gene desiderato DNA trasferito alle cellule vegetali Particelle ricoperte di DNA codificante per il gene desiderato Bombardamento di frammenti vegetali con proiettili Cromosoma integrato con il DNA codificante per il gene esogeno Moltiplicazione delle cellule (callo) cellula nucleo vegetale Rigenerazione di germogli e radici Pianta con nuove caratteristiche applicazione di un impulso elettrico protoplasti digestione con enzimi • cellulasi • pectinasi DNA esogeno cuvetta DNA esogeno Cellule vegetali formazione di pori nella membrana cellulare Cellule vegetali trasformate Trasformazione gene.ca delle piante n. Trasformazione gene.ca direJa di piante di Arabidopsis thaliana mediante infiltrazione Stadio di fioritura Lavaggio per allontanare i batteri in eccesso Infiltrazione in una coltura di A. tumefaciens kan + kan- kan + kanamicina Piante transgeniche (frequenza di ca 5%) Raccolta dei semi e semina su terreno selettivo Il processo di trasformazione via A. tumefaciens avviene con una scarsa efficienza E’ necessario distinguere precocemente e rapidamente le cellule vegetali effettivamente trasformate da quelle in cui il gene esogeno non si è inserito stabilmente nel genoma Oltre al gene esogeno controllato da un promotore costitutivo o inducibile, tra il LB e RB del T-DNA viene quindi clonato anche un gene marcatore selettivo Trasformazione genetica delle piante Geni marcatori selettivi nptII resistenza alla kanamicina visibili* non distruttivi GUS A LUC X-glucuronide luciferina GFP hyg resistenza all’igromicina bar resistenza al glifosate bet degrada le betaine, sostanza tossica per le piante man converte il mannitolo, non utilizzabile dalle piante, in sostanze semplici utilizzabili come fonte di carbonio β-glucuronidase luciferasi ATP luce * geni REPORTER GFP autofosforilazione P GFP Caratteristiche del vettore di A. tumefaciens Gene Promotore marcatore Promotore Gene esogeno Bordo destro • S35-CamV • Actina • Promotori inducibili Sequenza Terminatrice • nos Bordo sinistro Sito multiplo di clonaggio HindIII EcoRI SacI XbaI XhoI Calli resistenti Calli suscettibili non trasformati Trasformazione gene.ca delle piante n. Analisi molecolare delle piante/cellule modificate geneticamente Numero di copie integrate nel genoma vegetale Livello di espressione dell’mRNA Livello di espressione della proteina Analisi Northern Analisi Southern Analisi Western RT- PCR qRT-PCR Sovraespressione dei geni AtDXS e AtDXR in radici avventizie di S. sclarea qRT-PCR RT-PCR Transgenic roots lines M EV 1 2 3 4 300 bp 5 6 7 8 9 10 NS DXS DXR 300 bp 18 S Sovraesressione dei geni AtDXS e AtDXR in radici avventizie di S. sclarea Linee di radici avventizie EV 3 68 kDa 5 Linee di radici avventizie 7 EV DXS actin 54 kDa 4 7 9 DXR actin PlantaLab Vantaggi della Trasformazione Plas.diale • Notevole accumulo di proteina esogena • Contenimento genico • Possibilità di espressione policistronica da un singolo promotore espressione simultanea di più transgeni con un unico evento di trasformazione • Assenza di silenziamento genico • Ricombinazione omologa Es. geni per enzimi della fotosintesi DNA del cloroplasto di O. sativa VeJori u.lizza. Spe I Spe I Sito d’inserzione Spe I rbcL Prrn 1.55 kb aadA TpsbA 1.3 kb accD 1.29 kb pZS197 AscI AscI rbcL 1.55 kb pZSMCS13 Prrn AscI PacI aadA 1.3 kb TpsbA accD 1.29 kb Trasformazione cloroplastica di piante Vantaggi Maggiore espressione del transgene Nessuno effetto posizione e fenomeni di silenziamento genico Espressione di più geni controllati da un solo promotore Eredità materna Limiti: rigenerazione difficile da protolasti Biosintesi di terpeni in pinata CYTOPLASM MVA pathway MITOCHONDRIA Ubiquinones FPP Ace.l-­‐Coa AACT x2 Acetoacetyl-­‐CoA HMGS HMG-­‐CoA PMK Cytokinins Thiamine DXR MEP CMS CDP-­‐ME DMAPP CMK CDP-­‐MEP MCS ME-­‐cPP MVP HDS HMBPP MVPP IDS DMAPP GGPS IDI IPP IPP IDI DMAPP x3 GGPP x3 x2 FPP Phytosterols GPP Monoterpenes Chlorophylls Carotenoids Tocopherols ABA Phylloquinones Plastoquinones GGPS Gibberelins Polyprenoids Brassinosteroids Isoprene GPS x1 FPS Sesquiterpenes DXS DXP MVA MVK PMD G3P+Pyruvate Pyridoxol FPS IPP MHGR PLASTID MEP pathway GGPP Diterpenes Abietadiene synthase?? ? ? ? ? ? Abie.c Acid ? Aethiopinon e Influenza del sistema di trasformazione sull’espressione del transgene via Agrobacterium1. semplici pattern di integrazione . 2. inserimento di geni in regioni eucromatiche ‘zone espresse” Ma… 1. non è efficiente per l’inserzione sito-specifica 2. formazione di siti di integrazione complessi via bombardamento 1. siti multipli di inserzione 2. nessun sito preferenziale di integrazione. 3. efficiente per l’integrazione sito-specifica del tarnsgene nel genoma 4. vettori più semplici Recenti sviluppi per l’ottimizzazione dell’espressione di un transgene 1. stabilizzare l’ espressione ed evitare fenomeni di silenziamento del transgene 1. Il fenomeno di silenziamento genico in piante transgeniche è abbastanza comune Strategie per stabilizzare l’espressione del transgene 1. Disegno accurato del vettore di espressione. 2. Controllo del processo di integrazione del transgene nel genoma vegetale. 3. Soppressione del sistema endogeno delle piante di silenziamento Strategie per ottimizzare l’espressione di un transgene Le condizioni “in vitro” possono influenzare negativamente l’espressione del transgene variazione somaclonale Quindi, • limitare al minimo la fase in vitro • limitare l’esposizione a fitormoni contenuti neli mezzi. • Favorire l’embriogensi, se possibile, all’organogenesi. Le condizioni “in vitro” possono influenzare negativamente l’espressione del transgene variazione somaclonale Quindi, • limitare al minimo la fase in vitro • limitare l’esposizione a fitormoni contenuti neli mezzi. • Favorire l’embriogensi, se possibile, all’organogenesi. Costrutti per una stabilità di espressione del transgene 1. Scelta del promotore: è preferibile usare promotori endogeni vegetali ed evitare promotori virali. 2. Evitare strutture trascrizionali invertite e ripetute (Promotore X-Gene 1-nos3’:: nos3’-Gene 2-Promotore X or Y) 3. Aggiunta di sequenze MARS ai due lati del transgene Matrix attachment regions (MAR) conosciute anche come regioni di attacco allo scaffold/matrice (S/MARs), sono sequenze di DNA nei cromosomi degli eucarioti a cui si lega la matrice nucleare. Questi elementi costituiscono punti in cui il DNA si ancora allo scaffold cromatinico e servono per organizzare la cromatina in domini strutturali. Studi su singoli geni hanno portato alla conclusione che la dinamica e complessa organizzazione della cromatina mediata dagli elementi S/MAR gioca un ruolo importante nella regolazione dell'espressione genica. Quando MARs sono localizzate ad entrambi i lati di un transgene la loro presenza permette in molti casi una più alta e stabile espressione del transgene, probabilmente minimizzando il silenziamento genico Matrix attachment regions (MARs) are DNA sequences that help generate and maintain an open chromatin domain that is favourable to transcription L’aggiunta di regione MAR al gene GUS aumenta l’espressione del gene GUSin piante di tabacco Co-trasformazione con due costrutti separati: uno contenente il gene di interesse e l’altro il gene marcatore Rimozione del gene marcatore mediante la ricombinasi Cre-lox Marker gene Trait gene Cre (Causes recombination) ricombinasi Cre Recombinasi è un enzima derivato del batteriofago. The enzima usa un meccanismo di ricombinaizone simile a quello della toposisomerasi I loxP loxP CRE Trait gene + loxP Catalizza eventi di ricombinazione specifica tra due siti target di riconoscimento (loxP sites), di 34 base pair (bp) con due sequenze palindromiche di 13bp che fiancheggiano una regioen spaziatrice di 8 bp region. Se il gene marcatore è posto tra due sequenze loxP, la pianta transgenica che contiene il gene marcatore (insieme al transgene di interesse): 1) è incrociata con una pianta trasformata con il gene codificante la ricombinasi Cre e la progenie viene analizzata mediante PCR per l’assenza del gene marcatore; 2) oppure trasformata/co-trasformata con un vettore contenente il gene Cre per la ricombinasi Rimozione del gene marcatore mediante la ricombinasi Cre-lox marcatore trans gene trans gene 1, 5 piante con il gene marcatore 3, 4, 6,7 piante senza il gene marcatore 1. Clonaggio (creazione della cassetta d’espressione del transgene) 2. Trasformazione (via Agrobacterium o altro metodo) 3. Selezione piante trasformate (uso di marcatori selettivi) 4. Screening del materiale con appropriata espressione genica 5. Isolamento delle linee omozigoti 6. test delle piante ottenute (analisi molecolari e d’espressione genica) Modificazione di alcuni componen. delle vie metaboliche e prodoO nutriteu.ci Modifica dei Lipidi nuovi oli con un più alto contenuto di PUFA Modifica dei carboidra. • amido meno digeribile -­‐Transito intes>nale -­‐diabete • barbabietola che produce fru@ano invece di saccarosio meno calorie Aumento del contenuto di vitamine alleviare i problemi di carenze Aumento del contenuto di aminoacidi essenziali Aumento del valore nutrizionale Per la presentazione ppt Usare font arial dimensione 24-28 per i titoli dimensione 18-20 per il testo Scegliere la combinazione colore sfondo /testo evitare diapositive affollate
