1!
Trasformazione Genica
(trasferimento di uno o pochi geni)
> Metodi Indiretti
Uso di vettori biologici per il
trasferimento di DNA, generalmente
singoli o pochi geni
> Metodi Diretti
Uso di mezzi fisici o chimici per il
trasferimento di DNA, da singoli
geni a genomi completi
2!
Metodi indiretti di
trasformazione genetica in planta
Uso di vettori biologici per il
trasferimento di DNA, generalmente
singoli o pochi geni
Agro-coltura di tessuti
con Agrobacterium
tumefaciens oppure con
A. rhizogenes
Transfezione con
virus (es: CaMV)
3!
La storia
dell Agrobacterium tumefaciens
Mary-Dell Chilton
Jeff Schell
Marc van Montagu
Studio della crescita tumorale dei tessuti di pianta
infettati da Agrobacterium tumefaciens
4!
Agrobacterium tumefaciens
Agente eziologico del tumore del colletto
Mary-Dell Chilton et al. (1977)
Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells:
the molecular basis of crown gall tumorogenesis.
Cell, 11: 263-271
5!
Il plasmide Ti
(geni iaaM, iaah per la sintesi di auxine ed iptZ citochinine )
Induzione del tumore
Sintesi di opine
nopalina /octopina
Bordo destro
Bordo sinistro
T-DNA
Catabolismo
delle opine
Trasferimento
del T-DNA
(geni vir A,
Plasmide Ti
G, E, C D, B)
Origine di replicazione
6!
Mappa di un T-DNA
7!
8!
Processi molecolari per la ricombinazione eterologax
Fasi dell’attacco, del
trasferimento del T-DNA e
della formazione del tumore
9!
10!
Vettori binari per la trasformazione
genetica mediata dall’agrobatterio
Agro-trasformazione in
laboratorio
11!
In generale l Agrobacterium è
considerato il miglior metodo per la
trasformatione genetica dei vegetali
vantaggi:
1. trasferimento di un
basso numero di
copie del
transgene
2. più alta percentuale
di trasformanti
stabili
3. possono essere
trasferiti migliaia di bp
4. sistema che richiede
minor tempo per una
trasformazione stabile
12!
Trasformazione genetica con
Agrobacterium spp.
Scelta del ceppo di
Agrobacterium tumefaciens
Crescita dell’agrobatterio
(YEP, max 28°C, 48 h, eventuale
induttore es. acetosiringone)
Preparazione degli espianti
(sezioni di foglia, fusto)
Co-coltivazione dell’agrobatterio
con gli espianti per 24-48h
Crescita su appropriato terreno di
differenziazione con
batteriostatico
Selezionedei putativi germogli
transgenici e loro radicazione
13!
Espressione stabile: cocoltura
Coltura
in vitro
Cromosoma
della pianta
Gene esogeno
Pianta
transgenica
infezione
selezione
Sviluppo
Della
pianta
14!
Metodi diretti di trasformazione
genetica in planta
Uso di mezzi fisici o chimici per il
trasferimento di DNA, da singoli geni a
genomi completi
Incubazione DNA con semi
secchi o tessuti
Trasformazione del polline
Microiniezione ed Elettroiniezione in cellule
Elettroporazione o elettrofusione di
protoplasti
Biolistica
Metodo biolistico
15!
Fusti di orchidea
16!
Vettore d’espressione per
trasformazione genetica diretta
35S CAMV-5
Gene
John Sanford
Rbs -3
nos-5
nptII
nos-3
17!
Esperimenti di trasformazione di cloroplasti di
tabacco con metodo biolistico
(da Cardi T., CNR-IGV sez. Portici)
Spec 500 mg/l + Strep 500 mg/l
Spec 500 mg/l
Germoglio SpecR
18!
Espianti SpecR/StrepR
da germoglio
transplastomico
Espianti SpecR/StrepS
da germoglio mutante
Confronto temporale tra le due principali
procedure di trasformazione genetica
19!
Il miglioramento delle piante, dal coltivatore al DNA
Benefici dall’uso di piante transgeniche
nei Paesi in via di sviluppo
• Resa più elevata per unità di
superficie
• Piante resistenti a stress biotici
(parassiti) ed abiotici (siccità,
salinità, temperatura)
• Piante con migliorate capacità
nutrizionali (più vitamine, più
ferro, aminoacidi)
20!
Il futuro delle biotecnologie verdi è già iniziato
RISO DORATO
Geranyl-geranyl
diphosphate
Phytoene
Phytoene
synthase
(gene vegetale)
Phytoene desaturase
(gene batterico)
ζ-carotene
lycopene
Carotene
desaturase
(gene vegetale)
lycopene
cyclase
(gene vegetale)
β-carotene
Nell’uomo
Vititamin A
