10b-Trasformazione genetica_2_1314
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1! Trasformazione Genica (trasferimento di uno o pochi geni) > Metodi Indiretti Uso di vettori biologici per il trasferimento di DNA, generalmente singoli o pochi geni > Metodi Diretti Uso di mezzi fisici o chimici per il trasferimento di DNA, da singoli geni a genomi completi 2! Metodi indiretti di trasformazione genetica in planta Uso di vettori biologici per il trasferimento di DNA, generalmente singoli o pochi geni Agro-coltura di tessuti con Agrobacterium tumefaciens oppure con A. rhizogenes Transfezione con virus (es: CaMV) 3! La storia dell Agrobacterium tumefaciens Mary-Dell Chilton Jeff Schell Marc van Montagu Studio della crescita tumorale dei tessuti di pianta infettati da Agrobacterium tumefaciens 4! Agrobacterium tumefaciens Agente eziologico del tumore del colletto Mary-Dell Chilton et al. (1977) Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorogenesis. Cell, 11: 263-271 5! Il plasmide Ti (geni iaaM, iaah per la sintesi di auxine ed iptZ citochinine ) Induzione del tumore Sintesi di opine nopalina /octopina Bordo destro Bordo sinistro T-DNA Catabolismo delle opine Trasferimento del T-DNA (geni vir A, Plasmide Ti G, E, C D, B) Origine di replicazione 6! Mappa di un T-DNA 7! 8! Processi molecolari per la ricombinazione eterologax Fasi dell’attacco, del trasferimento del T-DNA e della formazione del tumore 9! 10! Vettori binari per la trasformazione genetica mediata dall’agrobatterio Agro-trasformazione in laboratorio 11! In generale l Agrobacterium è considerato il miglior metodo per la trasformatione genetica dei vegetali vantaggi: 1. trasferimento di un basso numero di copie del transgene 2. più alta percentuale di trasformanti stabili 3. possono essere trasferiti migliaia di bp 4. sistema che richiede minor tempo per una trasformazione stabile 12! Trasformazione genetica con Agrobacterium spp. Scelta del ceppo di Agrobacterium tumefaciens Crescita dell’agrobatterio (YEP, max 28°C, 48 h, eventuale induttore es. acetosiringone) Preparazione degli espianti (sezioni di foglia, fusto) Co-coltivazione dell’agrobatterio con gli espianti per 24-48h Crescita su appropriato terreno di differenziazione con batteriostatico Selezionedei putativi germogli transgenici e loro radicazione 13! Espressione stabile: cocoltura Coltura in vitro Cromosoma della pianta Gene esogeno Pianta transgenica infezione selezione Sviluppo Della pianta 14! Metodi diretti di trasformazione genetica in planta Uso di mezzi fisici o chimici per il trasferimento di DNA, da singoli geni a genomi completi Incubazione DNA con semi secchi o tessuti Trasformazione del polline Microiniezione ed Elettroiniezione in cellule Elettroporazione o elettrofusione di protoplasti Biolistica Metodo biolistico 15! Fusti di orchidea 16! Vettore d’espressione per trasformazione genetica diretta 35S CAMV-5 Gene John Sanford Rbs -3 nos-5 nptII nos-3 17! Esperimenti di trasformazione di cloroplasti di tabacco con metodo biolistico (da Cardi T., CNR-IGV sez. Portici) Spec 500 mg/l + Strep 500 mg/l Spec 500 mg/l Germoglio SpecR 18! Espianti SpecR/StrepR da germoglio transplastomico Espianti SpecR/StrepS da germoglio mutante Confronto temporale tra le due principali procedure di trasformazione genetica 19! Il miglioramento delle piante, dal coltivatore al DNA Benefici dall’uso di piante transgeniche nei Paesi in via di sviluppo • Resa più elevata per unità di superficie • Piante resistenti a stress biotici (parassiti) ed abiotici (siccità, salinità, temperatura) • Piante con migliorate capacità nutrizionali (più vitamine, più ferro, aminoacidi) 20! Il futuro delle biotecnologie verdi è già iniziato RISO DORATO Geranyl-geranyl diphosphate Phytoene Phytoene synthase (gene vegetale) Phytoene desaturase (gene batterico) ζ-carotene lycopene Carotene desaturase (gene vegetale) lycopene cyclase (gene vegetale) β-carotene Nell’uomo Vititamin A
