T-DNA

Programmi di sequenziamento genomico nelle
piante
•Arabidopsis
•Riso
•Pioppo
•Mais
•Pomodoro
•Soia
•……etc.
Già completati
Analisi funzionale dei geni
•Mutagenesi inserzionale
(Knock out)
•RNA Antisenso
•RNAi
Diminuire l’espressione
•Mutagenesi inserzionale
•Mutagenesi inserzionale su larga scala
•T-DNA tagging
•Trasposon tagging
Il trasferimento genico nelle piante
Mediato da:
•Vettore biologico: Agrobacterium, virus
•Diretto: biolistico, microiniezione, etc
Agrobacterium tumefaciens e rhizogenes
Agrobacterium tumefaciens
•
E’ un patogeno delle piante responsabile del tumore (la galla)
•
La trasformazione delle cellule della pianta è conseguenza del
trasferimento e dell’integrazione nel genoma nucleare della cellula
target di una regione (T-DNA) del plasmide Ti (Tumor-inducing)
T-DNA
LB
RB
E
oncogenes
and opine
synthase
D
C
G
B
A
vir
Ti
ori
opine
catabolism
L’integrazione del T-DNA nel genoma
dell’ospite è casuale
Trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens
plasmide
Agrobacterium tumefaciens
helper
RB
Trasforma senza
indurre il tumore
(disarmato)
LB
NOS-pro NPTII(KanR)
NOS-t
CaMV35S
Vettore a T-DNA
gene X
NOS-t
Piantine trsformanti (verdi; KanR) di Arabidopsis thaliana
Arabidopsis thaliana (pianta modello) il cui genoma
è stato completamente sequenziato ( 2000)
225.000 linee inserzionali (T-DNA)
Arabidopsis Biological Stock Center (Ohio S.U.)
Nothingham Arabidopsis stock center (NASC)
Breve sequenza del DNA genomico fiancheggiante
l’inserto permette di stabilirne la posizione nel genoma
Trasposoni
Barbara McClintock (1902 –1992)
Ds dissociation (non autonomo); Ac Activator (autonomo)
Ac: 4563 bp
IR : sequenze ripetute (imperfette) terminali 11bp
Un gene che codifica per la trasposasi (807 aa)
Come può essere utilizzato il trasposon (e T-DNA tagging)
la sequenza del genoma:
•è disponibile
•non è disponibile
Assegnare una funzione ai geni
Individuare, clonare e caratterizzare geni
(anche su larga scala)
Trasposizione generalizzata
Mu (mais)
(tutto il genoma)
Trasposizione “bersaglio” specifica
(una regione genomica)
Ac/Ds
Mu (mutator)
•70-90% degli elementi Mu si inserice nei geni
•le inserzioni si verificano tardivamente nelle cellule germinali
•si inseriscono con alta frequenza sia in loci associati che non
associati e qui rimangono stabili e trasmissibili attraverso la
linea germinale
•non vengono persi e continuano a replicarsi (saturation
mutagenesis)
Elemento Mu
Rescue Mu
Consiste in un plasmide inserito in un elemeto Mu non autonomo
•pBluescript: plasmide batterico ad alto numero di copie
•Lc (Leaf color): fattore trascrizionale richiesto per la prod. antocianine
•viene cotrasformato con pAHC20 (resistenza al Basta)
•le linee cotrasformate devono esser incrociate con una linea che porta un MuDr
attivo per potere trasporre.
Rescue Mu
•
Accelerare la scoperta e la caratterizzazione di geni
mutagenizzati con Mu che presentino un fenotipo di interesse
•Recupero del plasmide
5-20 Kb di DNA, fiancheggiante
l’elemento Mu, in forma plasmidica facilmente sequenziabile
(non occorre costruire una libreria genomica del mutante)
•Non solo inserzioni germinali, ma anche somatiche
tardive (cellule della foglia)
•Difficilmente danno un fenotipo e difficilmente vengono
trasmesse alla progenie
•Una nuova risorsa per costruire librerie batteriche di DNA
genomico di Mais arricchito in sequenze eucromatiche