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UNIVERSITA’ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di laurea specialistica in Farmacia
Tesi di laurea
SINTESI DI LIGANDI MULTIFUNZIONALI PER IL
TRATTAMENTO DELL’ALZHEIMER
Relatori
Candidata
Dr.ssa Simona Rapposelli
Giulia Colli
Dr.ssa Maria Digiacomo
ANNO ACCADEMICO 2011-2012
Once upon a night we'll wake to the carnival of life
the beauty of this ride ahead such an incredible high
It's hard to light a candle, easy to curse the dark instead
This moment the dawn of humanity
The last ride of the day
Last ride of the day, Nightwish
INDICE
INTRODUZIONE GENERALE……………………………………5
1. Il morbo di Alzheimer………………………………….…..….6
2. Principali caratteristiche neuropatologiche…….…………......7
2.1 Aggregazione amiloide…………………….…………....7
2.2 Metalli di transizione………………………………......12
2.3 Neuroinfiammazione………..………………………….15
2.4 Sistema colinergico…………………………………….16
2.5 Grovigli neurofibrillari………...…………….……...…18
2.6 Stress ossidativo………………………………………..21
2.7 Depressione…………………………………………….24
3. Farmaci attualmente utilizzati in terapia…………….…...…..26
4. Farmaci multifunzionali………………………………………27
5. Farmaci multifunzionali nel morbo di Alzheimer……...….….30
5.1 Ibrido AChEI/ AChEI e ibrido AChEI/Antiaggregante. 30
5.2 Ibrido AChEI / Antiossidante e ibrido
FANS /Antiossidante.....33
5.2.1 Ibridi NO-Donor................................................35
5.3 Ibrido AChEI / Antidepressivo........................................38
INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE.................41
PARTE GENERALE........................................................................53
BIBLIOGRAFIA...............................................................................70
INTRODUZIONE GENERALE
Introduzione generale
1.
IL MORBO DI ALZHEIMER
Il morbo di Alzheimer (AD) è una delle cause più comuni di demenza nella
popolazione più anziana1. Si tratta di una malattia neurodegenerativa
caratterizzata da un progressivo e globale deterioramento delle funzioni mentali,
più in particolare delle funzioni cognitive.
I sintomi dell’AD si differenziano da individuo a individuo, ma in generale la
progressione della malattia segue tre fasi principali: mite, moderata e severa2.
Nella fase mite, i pazienti mostrano occasionali perdite di ricordi recentemente
acquisiti (memoria a breve termine), confusione, capacità di giudizio
compromessa e disorientamento nel tempo, spazio e luogo. Con la progressione
della malattia questi sintomi diventano più frequenti e la memoria dei pazienti si
deteriora ulteriormente. La fase più avanzata dell’AD è caratterizzata da una
grande compromissione della memoria con incapacità da parte dei pazienti di
riconoscere i membri più stretti della famiglia e difficoltà a camminare, parlare e
mangiare. In questa fase, i pazienti hanno bisogno di assistenza totale nelle attività
quotidiane. Più recentemente, è stato descritto un periodo di più sottili
cambiamenti nella capacità mnemonica che prelude alla vera e propria demenza,
chiamato “Indebolimento cognitivo mite” (MCI)3,4. La maggior parte dei pazienti
affetti da MCI manifestano l’AD; secondo recenti scoperte, è opportuno iniziare il
trattamento farmacologico per l’AD in questa fase, prima che si abbiano ulteriori
danni al cervello.
6
Introduzione generale
2. PRINCIPALI CARATTERISTICHE NEUROPATOLOGICHE
Ad oggi, il meccanismo eziologico dell’AD risulta essere ancora poco chiaro.
Stress ossidativo, alterazione del sistema colinergico, formazione di aggregati di
β-amiloide e neuroinfiammazione sono quattro eventi chiave che caratterizzano la
fisiopatologia dell’AD e possono essere bersaglio di farmaci nel trattamento di
questa patologia5.
2.1 Aggregazione amiloide
Per molti versi, la patologia dell’AD rimane legata alle iniziali osservazioni
istologiche di Alois Alzheimer; egli osservò, nel cadavere di una donna di 56 anni
morta per una progressiva demenza, perdite neuronali, placche senili, grovigli
neurofibrillari (NFTs) e gliosi reattive.
E’ stato scoperto che le placche senili sono costituite principalmente da una
proteina di 4-KDa, il peptide Beta-amiloide (Aβ)6. Aβ deriva dalla proteolisi della
proteina precursore dell’amiloide, APP7; nei soggetti sani l’ APP, attraverso una
reazione biologica catalizzata dall’-secretasi, produce un peptide innocuo
chiamato p3. Per motivi non totalmente chiariti, nei soggetti malati l’enzima che
interviene sull’APP non è l’-secretasi ma una sua variante, la -secretasi
(BACE), che porta alla produzione di un peptide di 99 aminoacidi, C99, il quale a
sua volta viene trasformato dalla -secretasi nel peptide -amiloide di 40 (Ao
di 42 aminoacidi (A. Il peptide Aβ non presenta le caratteristiche biologiche
della forma naturale e tende a depositarsi in aggregati extracellulari sulla
membrana dei neuroni7 (Figura 1). La lunghezza dei peptidi Aβ è d’importanza
critica; sembra infatti che gli Aβ1-42 abbiano potenziale neurotossico molto
maggiore rispetto al più abbondante peptide Aβ1-408. Il processo di aggregazione
di Aβ inizia con la formazione di monomeri e procede con dimeri, oligomeri
solubili, protofibrille e infine con fibrille mature9; tra questi, gli oligomeri solubili
sembrano essere i più neurotossici10-12.
7
Introduzione generale
Figura 1. Formazione di placche senili a partire da APP
L’ipotesi che la cascata amiloide sia una delle principali cause dell’AD è
supportata da studi condotti su colture cellulari e animali9,13,14. Le evidenze
sperimentali hanno portato alla ricerca di una classe di farmaci che hanno come
target i peptidi Aβ, attraverso la riduzione dell’aggregazione, il blocco di BACE e
l’inibizione della γ-secretasi15-19. Sfortunatamente, l’importante ruolo svolto da
questi target nelle normali funzioni fisiologiche rappresenta un problema nello
sviluppo di farmaci sicuri e efficaci per il trattamento dell’AD e nessun nuovo
farmaco è stato prodotto ad oggi20-23, tuttavia alcune molecole sono in fase di
sperimentazione.
Per quanto riguarda gli inibitori della γ-secretasi (GSIs), questi possono ridurre la
sintesi di Aβ e con ciò prevenirne l’aggregazione24. Sfortunatamente, γ-secretasi
scinde anche altre proteine di membrana oltre ad APP25 ed una somministrazione
cronica di suoi inibitori provoca ripercussioni anche nel tratto gastrointestinale,
nella milza e nel timo, limitandone quindi la quantità somministrabile in vivo; gli
effetti collaterali sembrano dovuti principalmente all'inibizione del pathway
Notch, che svolge un ruolo chiave in diversi processi cellulari come la
proliferazione e il differenziamento26-28. Nonostante ciò, alcuni studi preclinici
hanno dimostrato che gli inibitori di γ-secretasi, a dosi tollerabili, possono
migliorare il deficit cognitivo29; per questo Semagacestat (LY-450139)30,31 e MK075232 (Figura 2), hanno raggiunto la fase clinica e vengono attualmente testati
sugli esseri umani. Semagacestat in particolare, sembrerebbe ridurre la
8
Introduzione generale
concentrazione di Aβ nel plasma e la sua produzione nel SNC33,34. Altri GSIs di
seconda generazione, come Begacestat (GSI-953)35 e Avagacestat (BMS708163)36 hanno mostrato una migliore selettività verso il pathway Notch e sono
ancora in fase di trials clinici.
H3C
CH3
O
O
HO
NH
HO
CH3
O
NH
O
O
S
Cl
O
N
CH3
F
F
LY-450139
MK-0752
Cl
CF 3
CF 3
HO
CF 3
HN
O
O
H2N
S
N
S
O
O
O
S
N
F
Cl
Begacestat
O
N
Avagacestat
Figura 2. Inibitori γ-secretasi
Oltre agli inibitori, sono stati studiati anche i modulatori di γ-secretasi (GSMs). Al
contrario dei primi, i GSMs abbassano selettivamente Aβ42 senza interferire con le
funzioni fisiologiche della γ-secretasi, e non danno effetti secondari Notchmediati. Infatti, i GSMs si legano specificamente al fragmento N-terminale della
presenilina, l’unità catalitica della γ-secretasi, ma non alle sue altre subunità37, e
provocano la formazione di un isoforma più breve, più solubile e meno
amiloidogenica rispetto al peptide Aβ, senza inibire i processi proteolitici di APP
o di Notch38. Un esempio di GSM, ancora in fase di studio, è RO-5737 (Figura 3).
9
Introduzione generale
O
NH
N
O
H3C
CH3
N
N
N
CH3
H3C
RO-57
Figura 3. Modulatore γ-secretasi
E’ stato visto inoltre che anche alcuni FANS (come indometacina, sulindac e
ibuprofene) sono modulatori della γ-secretasi39. I FANS inbiscono le
cicloossigenasi (COX), enzimi responsabili della sintesi di prostaglandine, e
l’attivazione dei monociti40,41. Studi epidemiologici hanno mostrato che il
trattamento cronico con FANS abbassa il rischio di AD42-46, e inizialmente tale
attività è stata attribuita all’attenuazione dell’infiammazione47-49. Nel 2001 è stato
però scoperto che un sottoinsieme di FANS riduceva selettivamente le
concentrazioni di Aβ indipendentemente dall’inibizione delle COX50; questo
sottoinsieme è stato chiamato SALAs (Agenti che abbassano selettivamente
l’amiloide)51,52. Recentemente è stato dimostrato, in colture di cellule neuronali,
che i SALAs agiscono indipendentemente dalle γ-secretasi, attraverso un
upregulating di metalloproteasi che eliminano Aβ1-4253. Tra questo tipo di
composti troviamo l’R-flurbiprofene o Tarenflurbil (Figura 4), che, al contrario di
S-flurbiprofene, non inibisce la COX e conseguentemente non causa gli effetti
collaterali a livello gastrointestinale generalmente associati ai FANS54. Rflurbiprofene è già stato testato in fase 3 in pazienti con Alzheimer ma non ha
mostrato effetti clinici; questo potrebbe essere dovuto ad una bassa potenza come
modulatore della
γ-secretasi o ad una scarsa penetrazione nel SNC55,56. Il
Flurbiprofene rimane uno dei SALAs più potenti, mentre molti FANS come
l’aspirina e il naprossene non mostrano attività51,57.
10
Introduzione generale
H
CH3
OH
O
F
R-flurbiprofene
Figura 4. FANS che agisce su γ-secretasi
Riguardo la possibilità di inibire BACE, è stato identificato un sottotipo in
particolare, BACE1, quale enzima necessario per la formazione di Aβ a livello
cerebrale58. Purtroppo è stato difficoltoso progettare inibitori BACE1 potenti ed in
grado di attraversare le BEE, anche a causa di un efflusso di quest’ultimi ad opera
della p-glicoproteina59,60, una glicoproteina di membrana con funzione di pompa
la cui attività sembra essere quella di estrudere dal citoplasma sostanze
riconosciute come estranee61. Farmaci come il rosiglitazone e pioglitazone (Figura
5), usati per il trattamento del diabete di tipo 2, agiscono anche come inibitori
delle β-secretasi stimolando i recettori PPARγ (recettore della proliferazione
perossisomale). L'attivazione di questi recettori può sopprimere l'espressione delle
β-secretasi e di APP, e promuovere la degradazione di quest’ultima62. Gli studi
clinici condotti con rosiglitazone in pazienti con Alzheimer o MCI, sono
attualmente testati in fase 3, mentre il pioglitazone è in fase 2.
O
O
O
O
S
N
HN
S
N
CH3
HN
N
CH3
O
O
Pioglitazone
Rosiglitazone
Figura 5. Inibitori BACE
Infine, sono stati scoperti inibitori diretti dell’aggregazione di Aβ. Essi possono
agire o legandosi ai monomeri Aβ, prevenendo l'oligomerizzazione o
alternativamente come antiaggreganti, reagendo con gli oligomeri Aβ, così da
neutralizzarne la tossicità e promuovere la clearance63. Un esempio è dato
11
Introduzione generale
dall’acido 3-ammino-1-propansolfonico (3APS o tramiprosate) (Figura 6), che è
attualmente in fase 3 in Europa64, ma che è già stato commercializzato nel 2008
dalla compagnia farmaceutica-nutraceutica Bellus Health, come Vivimind, come
protettore per la memoria65.
H2N
O
S
OH
O
Figura 6. 3APS
2.2 Metalli di transizione
I peptidi Aβ, una volta aggregati tra loro, tendono a reagire con metalli di
transizione, come Zinco (Zn) e Rame (Cu), i quali inducono una rapida
precipitazione di Aβ66. Infatti, analisi su cervelli affetti da AD hanno rivelato Cu e
Zn accumulati in placche amiloidi extracellulari67. Il sequestro di Cu da parte di
Aβ porta alla generazione di specie reattive dell’ossigeno68 mentre quello dello Zn
priva i neuroni e le sinapsi di uno ione metallico la cui omeostasi sinaptica è
essenziale per la corretta funzione cerebrale69 (Figura 7).
Figura 7. Conseguenze dell’interazione tra metallo e Aβ
Considerando che le interazioni tra Aβ e ioni metallici contribuiscono alla
tossicità e alla deposizione di Aβ nel cervello affetto da AD, composti chelanti i
12
Introduzione generale
metalli dovrebbero prevenire questa interazione e quindi
avere un’azione
protettiva70.
Uno dei composti più interessanti come chelante è la 5-cloro-7-iodo-8-idrossichinolina, ovvero il cliochinolo71 (CQ) (Figura 8).
Cl
I
N
OH
Figura 8. Cliochinolo
CQ è in grado di chelare selettivamente Zn2+ e Cu2+ rispetto a Ca2+ e Mg2+71 e
mostra una buona capacità di attraversare la barriera ematoencefalica72. Analisi su
cervelli di topi trattati con CQ hanno rivelato la presenza di un minor numero di
placche amiloidi ed un decremento del 41% di Aβ precipitato, che si trasforma in
Aβ solubile71, e che viene rapidamente eliminato da proteasi normalmente
presenti nel cervello73. In presenza di Zn invece, Aβ si lega allo ione metallico e
diventa fortemente resistente alla degradazione a causa di cambiamenti
conformazionali a cui va incontro73. CQ promuove l’uptake cellulare degli ioni
metallici, che porta alla iperattivazione di una cascata di segnali cellulari la quale
ha tra le conseguenze un aumento di proteasi cellulari che degradano Aβ74.
Una delle chinasi che viene inibita nella cascata cellulare indotta dal legame CQmetallo è la glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK3). GSK3 è una chinasi ubiquitaria
con un range molto ampio di substrati, tra cui la proteina associata a microtubuli
tau75,76. Tau è iperfosforilata nel cervello affetto da AD e l’eccessiva attività di
GSK3 contribuisce a questa iperfosforilazione77. Facilitando l’uptake cellulare di
Cu e Zn, CQ è in grado di promuovere la degradazione di Aβ e di diminuire la
fosforilazione di tau, e in tal modo colpire due delle caratteristiche patologiche
principali dell’AD74 (Figura 9).
13
Introduzione generale
Figura 9. Interazione tra CQ e metalli
Attualmente esiste una seconda generazione di chelanti metallici, tra cui
ritroviamo PBT2, un derivato dell’8-idrossi-chinolina78. PBT2 è più solubile di
CQ, passa più facilmente la barriera ematoencefalica e mostra un efficacia
maggiore in studi preclinici in vivo. PBT2 lega il metallo in rapporto 2:1,
provocando una deprotonazione del protone fenolico; questo porta alla
formazione di un complesso neutro solubile con gli ioni metallici, in grado di
attraversare le membrane cellulari79 (Figura 10). Attualmente, la molecola è in
fase 2 dei trials clinici.
Figura 10. Complesso tra 8-idrossi-chinolina e metallo
Diversi studi hanno indicato che la formazione di aggregati di Aβ e metalli
potrebbe non essere sufficiente a spiegare l’eziologia dell’AD, infatti la posizione
e numero dei depositi amiloidi non spiega bene il grado di compromissione
cognitiva80. Nello specifico, l’uso di Aβ come marker per l’AD nel fluido
14
Introduzione generale
cerebrospinale è stato problematico ed analisi post-mortem di cervelli anziani
spesso hanno mostrato alti livelli di Aβ e abbondanti placche senili in assenza di
demenza81,82.
Una
spiegazione
per
questo
potrebbe
essere
che
una
neuroinfiammazione possa convertire le placche diffuse in placche neuritiche, che
causano demenza47.
2.3 Neuroinfiammazione
La “gliosi” descritta da Alzheimer è una neuroinfiammazione a livello celebrale
riscontrabile in pazienti affetti da AD e caratterizzata dalla presenza di cellule
della microglia attivate all’interno dei confini della placca e astrociti reattivi
localizzati in periferia83-85 (Figura 11).
Figura 11. Neuroinfiammazione
Le cellule della microglia attivate rappresentano la più caratteristica peculiarità
dell’infiammazione nell’AD. Fibrille e altre componenti delle placche neuritiche
possono attivare le cellule della microglia, le quali a loro volta producono fattori
chemiotattici che contribuiscono all’ulteriore attivazione delle cellule della
microglia e delle proteine del complemento, esercitando così una diretta attività
citotossica. Aβ può legare ed attivare il fattore complemento C1a e quindi attivare
l’intera cascata del sistema complemento. Microglia e astrociti, inoltre, producono
una varietà di citochine e chemochine, tra cui Interleuchina 1b, 6 e il fattore di
15
Introduzione generale
necrosi tumorale α (TNFα), noti per essere associati a reazioni immunologiche e
infiammatorie e sovra espresse nel cervello affetto da AD.
I farmaci che agiscono a questo livello sono i FANS, e sono attualmente usati in
terapia.
2.4 Sistema Colinergico
Una delle caratteristiche principali dell’AD è la diminuzione di Acetilcolina
(ACh) a livello neuronale86-88. L’acetilcolina è un neurotrasmettitore sintetizzato
generalmente nei neuroni dall'enzima colina acetil-transferasi utilizzando come
substrato colina ed il gruppo acetile dell'acetil-CoA. L'enzima acetilcolinesterasi
(AChE) è responsabile della degradazione, per idrolisi, dell'acetilcolina,
riconvertita in colina. Tale enzima, presente nelle terminazioni nervose, presenta
due siti di legame, PAS (sito attivo periferico) e CAS (sito attivo catalitico), ed è
responsabile dell'interruzione nella trasmissione del segnale. L'acetilcolina può
essere degradata anche da altre colinesterasi, quali la butirrilcolinesterasi (BChE),
che però la legano con affinità minore89.
L’ipotesi di riduzione della funzionalità colinergica è divenuta la base per la
progettazione di una nuova classe di farmaci: gli inibitori dell’Acetilcolinesterasi
(AChEI). Molti studiosi hanno criticato tale ipotesi, basandosi sull’assenza critica
di degradazione dei neuroni colinergici e sulla presenza di livelli elevati di colina
O-acetiltransferasi (ChAT) nei primi stati dell’AD90-92, ma un trial clinico recente
(AD2000) ha chiaramente evidenziato l’efficacia del Donezepil, un AChEI,
nell’AD mite-moderato93,94.
Un esame più approfondito dell’ipotesi colinergica, insieme alla teoria amiloide,
può aiutare a spiegare l’efficacia degli AChEI e la neurotossicità di Aβ. E’ stato
osservato che la degenerazione neuronale nell’AD non è dovuta semplicemente
alla perdita di cellule, ma ad un processo degenerativo che inizia con il decrescere
della stabilità e plasticità sinaptica. Tale quadro patologico è comune nel MCI e
nella prima fase dell’AD95-99. Questo processo degenerativo è controbilanciato da
un incremento dell’attività colinergica100,101, mediato parzialmente dall’up16
Introduzione generale
regulation di Aβ che avviene in seguito al legame ai recettori dell’ACh α7nicotinici102-105. Queste osservazioni sono compatibili con l’efficacia degli AChEI
nell’AD, e spiegano la successiva perdita di efficacia, dovuta alla diminuzione dei
neuroni colinergici95. Il recettore nicotinico dell’ACh (nAChR), agendo come
recettore per Aβ1-42, provoca ingresso di Ca2+ nella cellula (Figura 12) e determina
una serie di risposte a valle che vanno dallo squilibrio dell’ERK (chinasi che
regola i segnali extracellulari) all’interruzione della fosforilazione della proteina
CREB, un fattore di trascrizione implicato nella formazione della memoria a
lungo termine106.
Figura 12. Legame tra Aβ e nAChR
Inibitori dell’AChE sono attualmente utilizzati nella terapia per l’AD; la Tacrina (
Figura 13) è stato il primo inibitore dell’ AChE approvato per l’AD nel 1993, ma
ha mostrato gravi effetti collaterali, soprattutto epatotossicità. Sequenzialmente,
sono stati approvati altri inibitori di AChE quali Donepezil, Rivastigmina e
Galantamina; essi
risultano più lipofili e passano più facilmente la BEE,
risultando quindi meno affini per l’AChE periferica. Attualmente sono utilizzati
nella terapia standard dell’AD107.
17
Introduzione generale
NH2
N
O
MeO
N
MeO
Tacrina
Donezepil
CH3
H3C
N
OMe
O
O
O
CH3
OH
N
N
CH3
CH3
CH3
Rivastigmina
Galantamina
Figura 13. Inibitori AChE
2.5 Grovigli neurofibrillari
Ulteriori studi hanno messo in evidenza, nei malati di AD, un meccanismo
patologico aggiuntivo caratterizzato dalla formazione di aggregati neurofibrillari
(NFTs), che sono strutture istopatologiche localizzate all’interno delle cellule
neuronali. Gli NFTs, o grovigli neurofibrillari,
sono stati classificati come
aggregati intracellulari di una proteina filamentosa a doppia elica, la proteina tau,
in uno stato iperfosforilato108.
Tau è una proteina multifunzionale associata ai microtubuli, che gioca un ruolo
importante nell’assemblaggio e nella stabilizzazione dei microtubuli e nel legame
di questi polimeri con altri filamenti del citoscheletro. In condizioni normali,
l’equilibrio tra fosforilazione e defosforilazione di tau modula la stabilità del
citoscheletro e conseguentemente la morfologia assiale. Nell’AD il cervello è
18
Introduzione generale
ricco di tau iperfosforilata ad opera di varie proteine chinasi e fosfatasi, che
determinano un cambiamento strutturale e conformazionale che influenza la sua
capacità di legarsi alla tubulina e quindi promuovere l’assemblaggio
microtubulare (Figura 14).
Figura 14. Proteina tau in un soggetto sano e un soggetto affetto da AD
Esistono 2 principali approcci terapeutici che hanno come target la proteina tau:
A. modulazione della fosforilazione della tau attraverso l'impiego di inibitori
delle chinasi;
B. inibizione dell'aggregazione di tau e/o promozione del disassemblaggio
degli aggregati.
Il primo approccio è basato sull’osservazione che l’iperfosforilazione della tau nel
cervello affetto da AD e la formazione di neurofibrille possono essere promosse
da una sbilanciata attività delle protein chinasi. GSK3, come già si è visto, è una
chinasi implicata nella fosforilazione di tau, quindi svolge un ruolo importante
nella patogenesi dell'AD109. Il litio e il valproato, farmaci già noti per il
trattamento dei disordini psichiatrici, inibiscono GSK3 e riducono la
19
Introduzione generale
fosforilazione di tau110. Tuttavia studi clinici con litio somministrato a pazienti
con AD mite, non ha mostrato alcun beneficio a livello cognitivo111.
Anche la riduzione dei livelli di tau e l’incremento del catabolismo delle forme
anomale può essere una strategia terapeutica; gli inibitori di Hsp90 ad esempio,
diminuiscono il numero di proteine tau in modo aspecifico112. Gli inibitori di
Hsp90 si legano al sito di legame per l’ATP di Hsp90 ed inibiscono la sua attività
ATPasica, stimolando la degradazione delle proteine su cui agisce Hsp90. Un
esempio di inibitore è PU-DZ8 (Figura 15), che agisce riducendo solo la tau
fosforilata, quindi in modo specifico, e non quella normale113,114.
O
O
NH2
N
N
I
F
N
N
NH
H3C
CH3
PU-DZ8
Figura 15. Inibitore di Hsp90
Un peptide di 8 aminoacidi, il Davunetide (NAP o AL-108) (Figura 16), ha
mostrato attività neuroprotettiva attraverso la stabilizzazione dei microtubuli,
l’inibizione della tau-iperfosforilazione e la riduzione dell’aggregazione di Aβ115.
Studi in vivo hanno mostrato che trattamenti cronici con NAP nei topi riducono la
concentrazione di tau iperfosforilata116. Il farmaco è attualmente in fase 2 dei trials
clinici115.
20
Introduzione generale
H3C
N
O
NH
H2N
O
NH
O
NH2
OH
O
NH
H3C
NH H
CH3
O
O
O
N
O
O
H3C H3C
NH2
NH
NAP
O
OH
Figura 16. AL-108
Infine, un farmaco che agisce come inibitore dell’aggregazione di tau è Rember, o
blu di metilene (Figura 17). Attualmente, questo farmaco ha concluso con
successo la fase 2 ed entrerà a breve in fase 3; gli studi in fase 2 hanno evidenziato
una riduzione dell’81% nel degradamento cognitivo in un arco di 12 mesi di
trattamento con Rember. Inoltre non è stato osservato alcun peggioramento nelle
funzioni mentali dei pazienti trattati nell’arco di 19 mesi116.
N
H3C
N
CH3
+
S
Cl
N
CH3
CH3
Figura 17. Rember
2.6 Stress ossidativo
Diversi studi hanno dimostrato un evidente coinvolgimento dello stress ossidativo
come meccanismo patogenico dell’AD117,118. Il concetto di stress ossidativo si
riferisce ad uno stato di squilibrio tra pro- e anti-ossidanti che determina un
danneggiamento tissutale119. Tale stato può derivare da un aumento della
produzione di cellule ossidanti e/o da una diminuzione della concentrazione di
specie antiossidanti come glutatione, vitamina E, ascorbato, superossido dismutasi
(SOD) e catalasi. L’iperproduzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS),
perossido, ossido nitrico e nitrato, è riscontrabile nell’AD e media i segnali di
apoptosi e il danneggiamento cellulare120. E’ stato dimostrato che le fibrille Aβ
21
Introduzione generale
inducono la formazione di alte concentrazioni di ossigeno e specie reattive
dell’azoto e la deplezione di antiossidanti endogeni121.
La microglia attivata produce larghe quantità di ossido nitrico (NO) e superossido.
NO è un radicale libero con bassa reattività e tossicità, che agisce come
messaggero intra e inter-cellulare in molti sistemi biologici. NO e superossido si
possono combinare formando il perossinitrito120, che è una specie ossidante molto
forte e tossica, responsabile della citotossicità in vivo dell’NO. Il perossinitrito
reagisce con la maggior parte delle componenti cellulari, in particolare con
tirosina libera o legata a proteine, per formare nitrotirosina (Figura 18). Evidenze
sulla produzione di perossinitrito nell’AD sono state ottenute da alcuni studi che
hanno rilevato un aumento dei livelli di nitrotirosina nel cervello di pazienti affetti
da AD122.
O
O 2N
HO
OH
NH2
Figura 18. Nitrotirosina
L’implicazione di NO nei processi degenerativi cellulari è riscontrabile
principalmente attraverso la neurodegenerazione eccitotossica indotta da
glutammato, dove una prolungata sovrattivazione dei recettori dell’acido
glutammico (NMDAR) causa un eccessiva entrata di calcio nella cellula (Figura
19). Tale aumento dei livelli di ioni Ca è dovuto all’incremento della produzione
di NO attraverso l’ossido nitrico sintasi (NOS)121. La tossicità dovuta
all’incremento dell’attività NOS è associata alla sovrapproduzione di NO o ROS,
mentre molti studi dimostrano le proprietà neuroprotettive di NO e NO/cGMP a
livelli fisiologici123-125. Esiste quindi una concentrazione ottimale di NO, sopra la
quale si osserva neurotossicità e sotto la quale la sua normale funzione è
compromessa.
22
Introduzione generale
Figura 19. Stress ossidativo
Presunti meccanismi di regolazione dell’attività del recettore NMDA da parte di
NO endogeno e donatori di NO esogeno includono la modificazione del sito
regolatore della redox tra tiolo e disolfuro e la modificazione di altri residui di
recettori per la cisteina, coinvolgendo cambiamenti conformazionali al recettore
NMDA126,127. Questa modificazione diretta e l’inibizione dei recettori NMDA
fornisce una via di neuroprotezione cGMP-indipendente per NO.
Lo stress ossidativo può essere causato anche dalla cascata amiloide. Aβ, infatti, si
accumula e danneggia i mitocondri, probabilmente a causa dei complessi che
forma con alcune proteine come l’alcol deidrogenasi (ADH)128. E’ tuttora ignoto
se Aβ venga prodotta a partire da APP già all’interno dei mitocondri oppure
attraversi la membrana mitocondriale129. Gli effetti tossici sui mitocondri causano
la produzione di ROS, e gli stessi amiloidi, nella forma oligomerica legata a Cu,
ne sono generatori. Quindi entrambi gli effetti, cioè stress ossidativo e cascata
amiloide, si rafforzano reciprocamente, creando un feedback positivo dannoso
dovuto alla liberazione di Aβ130.
23
Introduzione generale
Figura 20. Riepilogo delle principali caratteristiche neuropatologiche coinvolte in AD
2.7 Depressione
Quasi il 30-50 % di pazienti con l’AD soffre di depressione131,132. La presenza di
sintomi depressivi tra individui con decadimento cognitivo lieve incrementa
fortemente le probabilità di sviluppare AD133. Sono state formulate alcune teorie
tra il rapporto depressione e demenza; alcun suggeriscono una relazione
prodromica134,135, altri una relazione causale136-140. L’associazione di depressione
e AD porta ad un incremento ulteriore della disabilità, maggiori problemi
funzionali e comportamentali e molto stress da sostenere131,141; è stato scoperto
che la mortalità in pazienti con AD e depressione è molto più alta rispetto a
pazienti con AD ma non depressi142-146.
E’ ben noto che i recettori serotoninergici popolano densamente l’ippocampo,
regione legata alla memoria a lungo termine e una delle prime zone del cervello a
soffrire dei danni provocati dall’AD. Dato che la serotonina gioca un ruolo diretto
nell’apprendimento e nella memoria147,148, è stato proposto un meccanismo di
modulazione da parte della serotonina attraverso una regolazione delle
24
Introduzione generale
trasmissioni colinergiche e glutaminergiche149-151. E’ stato inoltre osservato un
effetto diretto sull’espressione del fattore neurotrofico cerebrale (BDNF) che
agisce sulla memoria a lungo termine. La somministrazione cronica di farmaci
inibitori selettivi della ricaptazione della serotonina (SSRI) come fluoxetina e
sertralina (Figura 21) aumenta infatti l’espressione di CREB nell’ippocampo e di
conseguenza aumenta l’espressione dei BDNF152,153.
H
N
H3C
NH
H
O
H
O
NH
H3C
H
H
O
O
Cl
Cl
CF 3
Fluoxetina
Sertralina
F
Paroxetina
Figura 21. Alcuni farmaci inibitori selettivi della ricaptazione della Serotonina (SSRI)
In aggiunta alla capacità di trattare la depressione in pazienti con AD, è stato
ipotizzato che i farmaci SSRI possano modificare direttamente la malattia; infatti
in studi animali, un pretrattamento con la Paroxetina (SSRI) ha migliorato le
performance cognitive e ridotto l’accumulo di Aβ e della proteina tau
modificata154. Questo è stato poi confermato in altri studi, dove la paroxetina ha
abbassato significativamente il livello di Aβ nel cervello in un topo affetto da
AD155,156.
25
Introduzione generale
3. FARMACI ATTUALMENTE UTILIZZATI IN TERAPIA
Attualmente, non esiste un trattamento di prevenzione per l’AD. Gli unici farmaci
disponibili approvati dal FDA sono per il trattamento sintomatico a breve termine
della demenza, ma con la progressione della malattia perdono la loro già limitata
efficacia. Sono principalmente costituiti da AChEI, come Tacrina, Donepezil,
Rivastigmina e Galantamina. L’unico farmaco appartenente ad una classe
differente, approvato limitatamente all’AD mite e moderato, è l’antagonista non
competitivo del recettore dell’acido glutammico NMDA, Memantina107 (Figura
22).
NH2
H3C
CH3
Memantina
Figura 22. Inibitore NMDAR
Inoltre, anche la neuroinfiammazione, coinvolta generalmente nelle malattie
neurodegenerative, può rappresentare un eccellente bersaglio per farmaci come i
FANS, tra cui il Flurbiprofene42-46 (Figura 23).
CH3
OH
H
O
F
Figura 23. Flurbiprofene
26
Introduzione generale
4. FARMACI MULTIFUNZIONALI
Spesso per patologie complesse come l’AD, in cui sono coinvolti vari processi
cellulari, lo sviluppo di farmaci innovativi e selettivi per un unico bersaglio, o
“single-target”, sembra essere insoddisfacente e terapie appositamente create per
agire selettivamente su un unico bersaglio mostrano una bassa efficacia157.
Quindi una valida alternativa può essere quella di progettare farmaci che agiscono
simultaneamente su più target, attraverso la co-formulazione di due o più
differenti farmaci agenti come singole componenti o lo sviluppo di una “chimera”,
cioè una singola entità molecolare capace di interagire contemporaneamente con
bersagli diversi.
L’approccio “multi-target” è una delle strategie più seguite per lo sviluppo di
nuove molecole ibride. I farmaci multi-target possono agire in modi diversi:
- L’effetto terapeutico può essere dovuto all’interazione con differenti
bersagli, che possono far parte di un sistema o essere coinvolti in diverse
vie o tessuti;
- La modulazione di un bersaglio può favorire l’interazione con un altro
alterando il metabolismo del composto o bloccando meccanismi di
resistenza;
- L’effetto terapeutico può essere ottenuto attraverso effetti indotti da
interazioni con siti multipli espressi sullo stesso bersaglio;
Rispetto ad un farmaco multicomponente, un farmaco ibrido può presentare
diversi vantaggi, come un rischio più basso di interazione sostanza-sostanza, una
maggiore biodisponibilità e un miglior profilo farmacocinetico rispetto a un
farmaco multicomponente158. Inoltre, generalmente, l’affinità di un farmaco
multifunzionale verso un bersaglio specifico è più bassa rispetto a un ligando
single-target; questo da un lato può essere considerato uno svantaggio, ma
dall’altro può comportare una diminuzione degli effetti collaterali.
27
Introduzione generale
Riguardo la co-formulazione di farmaci, la valutazione di interazioni sinergiche a
dosi diverse richiede esperimenti e analisi specifiche. Al contrario, gli effetti
indotti da un farmaco multi-target sono più difficili da valutare attraverso le
classiche tecniche di screening, perché l’effetto finale può non sempre essere
sinergico. Infatti l’effetto su un singolo target può essere paradossalmente ridotto
ed incrementato per un altro ma l’effetto finale del farmaco ibrido risulta essere
buono dal punto di vista farmacodinamico. Una bassa affinità non presuppone
necessariamente una bassa efficienza ma al contrario, un legame più debole ma
più cooperativo può portare all’attivazione di vari eventi cellulari con una
migliore efficienza globale159,160.
Esistono varie strategie per l’ottenimento di farmaci multitarget. Un metodo
consiste nella combinazione di due diverse molecole capaci di interagire con un
alta selettività verso specifici bersagli. Per far ciò, è necessario conoscere le
caratteristiche farmacologiche responsabili dell’affinità per ciascun bersaglio e
combinarle in una singola molecola utilizzando opportuni linker. Il linker può
avere caratteristiche diverse:
 può essere distrutto in vivo da esterasi nel plasma per rilasciare due
porzioni capaci di interagire in modo indipendente l’una dall’altra con il
loro specifico recettore161-164;
 può prendere parte alla modulazione dell’attività verso diversi bersagli
contemporaneamente. In questo caso, l’interazione ottimale con target
diversi dipende in maniera critica dalla lunghezza del linker, che gioca un
ruolo primario nell’attivazione contemporanea di vari bersagli (Figura 24).
28
Introduzione generale
Figura 24. Esempi di linker a varia lunghezza
Un altro intrigante e produttivo approccio per la formulazione di un farmaco
multi-target è quello di unire le componenti farmacofore responsabili dell’attività
verso un bersaglio specifico in una singola molecola.
29
Introduzione generale
5. FARMACI
MULTIFUNZIONALI
MORBO
NEL
DI
ALZHEIMER
Negli ultimi anni sono stati progettati vari farmaci ibridi per il trattamento
dell’AD.
5.1 Ibrido AChEI / AChEI e ibrido AChEI / Antiaggregante
Alcuni
farmaci
ibridi
sono
stati
progettati
partendo
dagli
inibitori
dell’acetilcolinesterasi. Essi derivano semplicemente dal legame delle porzioni
farmacofore di tacrina e donepezil attraverso una catena alchilica. Questi ibridi
hanno mostrato attività AChE inibitoria nell’ordine del subnanomolare, con
attività sulla butirilcolinesterasi (BChE) e proprietà amiloidi antiaggreganti ad
alte concentrazioni107,165 (Figura 25).
NH2
N
O
MeO
N
MeO
Tacrina
Donezepil
O
MeO
R1
MeO
N
NH
n
O
n
HN
NH
m
NH
N
R
Figura 25. Ibridi di Tacrina e Donezepil
Il modeling, basato sia sul legame della tacrina che del donezepil, indica che il
gruppo indolico, appropriatamente legato, si lega al sito periferico (PAS)
dell’AChE mentre la porzione tacrinica si lega al sito attivo catalitico (CAS). Un
30
Introduzione generale
attività inibitoria superiore su AChE si ottiene con i derivati in cui n=6 o 7 e m=2,
sebbene il contributo del “linker m” sull’attività sia debole.
Il composto con n=6 e m=2 si differenzia come potente e selettivo inibitore di
AChE, in grado di spiazzare lo ioduro di propidio in uno scambio competitivo. Lo
ioduro di propidio è un composto fenantrenico poliaromatico, usato normalmente
come marcatore biologico e agente intercalante il DNA. Date le proprietà
antiaggreganti di questa molecola, è stata incorporata in un ibrido diretto a legare
entrambi i siti di AChE; l’ibrido tacrina-propidio (Figura 26) mostra un inibizione
nanomolare di AChE e in incubazione con Aβ1-40 inibisce la formazione di fibrille
con IC50=14 μM166,167.
NH2
+
N
NH
NH
NH
NH2
Figura 26. Ibrido di Tacrina e Propidio
Sono stati progettati un numero ampio di farmaci ibridi basati sul concetto
dell’incorporazione di porzioni farmacofore di antiaggreganti e AChEI; molti di
questi sembrano legarsi anche al sito PAS. Derivati della Cumarina costituiscono
la componente antiaggregante168,169-175, come nel caso di un ibrido formato da
Donepezil e il derivato 6,7-dimetossi-cumarinico, legati tramite un linker in
posizione 3 (Figura 27).
31
Introduzione generale
N
O
O
O
MeO
MeO
Cumarina
Donezepil
NH
NH
H3CO
O
H3CO
O
O
Ibrido tra Donezepil e derivato cumarinico
Figura 27. Ibrido tra un inibitore AChE e un antiaggregante
Inoltre sono state riportate altre attività, come quella antiossidante o di inibitore di
β-secretasi, in farmaci ibridi trifunzionali. Un esempio molto elaborato è basato
sull’ibrido ottenuto da tacrina, acido lipoico e l’antiossidante memochina, che
contiene una porzione benzochinonica simile al coenzima Q176. Questi ibridi sono
inibitori nanomolari di AChE, inibitori macromolari di BChE e inibitori
dell’aggregazione di Aβ1-42.
Un altro esempio di ibrido consiste nella combinazione del 1-azabenzatrone e
della tacrina attraverso un linker oligometilenico contenente un gruppo amminico
in posizione variabile (Figura 28); questi ibridi mostrano una elevata attività
inibitoria su AChE, con IC50 nel range del nanomolare177.
32
Introduzione generale
N
m1
m2
NH
O
O
NH
n
NH
N
n=1,2
m1= 1,2,3
m2= 2,3,4
Figura 28. Ibrido tra 1-azabenzantrone e tacrina
5.2 Ibrido AChEI / Antiossidante e ibrido FANS / Antiossidante
In basi a recenti studi sul ruolo dello stress ossidativo nella progressione dell’AD,
sono stati sintetizzati ibridi incorporando antiossidanti. Gli esteri dell’acido
ferulico e i relativi metaboliti secondari nelle piante sono antiossidanti fenolici
classici, così come l’acido caffeico, suo precursore metabolico.
La somministrazione cronica dell’acido ferulico sembra indurre resistenza alla
neurotossicità di Aβ1-42. Alla luce di ciò, è stata effettuata una combinazione tra
acido ferulico e tacrina tramite un linker alchilenamminico, T6FA178,179 (Figura
29). In alcuni casi, la potenza di inibizione dell’AChE ha superato quella della
tacrina stessa. L’ibrido più potente (n=5) ha mostrato attività antiossidante
comparabile ad un analogo della vitamina E, il Trolox180. Inoltre questi ibridi sono
capaci di inibire la formazione di β-amiloide, inibendo l’aggregazione di Aβ1-40
autoindotta o indotta da AChE e bloccando la morte cellulare.
33
Introduzione generale
O
NH2
O
HO
CH3
OH
N
Tacrina
Acido ferulico
n
O
O
NH
HN
CH3
OH
N
n= 5, IC50= 4.4 nM; IC50 del trolox= 1.5
Figura 29. Ibrido tra tacrina e acido ferulico
Recentemente sono stati sintetizzati ibridi tra tacrina e acido caffeico, i T3CA181
(Figura 30), che in vitro hanno mostrato proprietà inibitorie verso AChE e
contribuiscono all’eliminazione delle specie reattive dell’ossigeno. Inoltre sembra
che agiscano da chelante sul rame e possiedano anche attività neuroprotettive. In
particolare, il più selettivo verso l’AChE (n=3, R=Cl) lega entrambi i suoi siti
(PAS e CAS) e inibisce l’aggregazione di Aβ1-40 autoindotta o indotta dall’AChE;
inoltre ha potenti effetti neuroprotettivi contro la morte cellulare indotta da H2O2 e
glutammato.
O
NH2
HO
OH
N
HO
Acido caffeico
Tacrina
34
Introduzione generale
R
OH
NH
NH
OH
n
N
O
n=2,3,6
R= H,Cl
Figura 30. Ibridi tra tacrina e acido caffeico
Inoltre è stato sviluppato un ibrido che unisce una porzione (2,1-b)
chinazolinimminica con l’acido lipoico attraverso un linker ammidico (Figura 31).
A seconda della lunghezza del linker, l’attività inibitoria su AChE e BChE varia.
Con un linker epta od ottametilenico si aumenta la selettività verso BChE182.
n
O
H
NH
S
N
S
N
n=1-6
Cl
N
Figura 31. Ibrido tra acido lipoico e chinazolimmine
5.2.1 Ibridi NO-Donor
Considerando il coinvolgimento dell’NO nell’AD, sono stati studiati vari nitrati. I
nitrati sono metabolicamente labili e richiedono una bioattivazione per rilasciare
NO; molti mostrano eccellente biodisponibiltà sul SNC a causa dell’elevata
lipofilicità della porzione NO183. Nei test, hanno dimostrato un miglioramento
delle capacità cognitive e del deficit della memoria184. Per questa ragione i nitrati
rappresentano un eccellente gruppo farmacoforo nell’approccio all’AD.
Recentemente è stata sintetizzata una nuova molecola, il nitrato GT-015 o GT-715
(Figura 32), avente proprietà neuroprotettive185,186. Da evidenziare è l’
incorporazione di un linker disolforico che può essere considerato un farmacoforo
e quindi tale molecola può essere vista come un ibrido. Inoltre, il linker
sembrerebbe contribuire alla neuroprotezione187-189.
35
Introduzione generale
S
S
O 2NO
ONO 2
O 2NO
ONO 2
GT-015
Figura 32. GT-015
Un altro ibrido sintetizzato recentemente è il GT-1061 (Figura 33)190, attivo
oralmente, che presenta una porzione tiazolica legata ad un nitrato. Può essere
visto come un ibrido tra clometiazolo (CMZ) e un gruppo NO-donor, che presenta
la
normale
attività
di
CMZ
(anticonvulsivante,
potenziatore
GABAA,
neuroprotettore, ansioliticio e sedativo iptonico ad alte dosi) ampliata da NO107.
CH3
N
ONO 2
S
GT-1061
Figura 33. Ibrido tra CMZ e nitrato
Altri ibridi, stavolta tripli, ottenuti dalla coniugazione di tacrina, acido ferulico e
un gruppo NO-donor (Figura 34) hanno mostrato, in vitro, attività inibitoria su
AChE più alta della tacrina; in più sembrano indurre vasodilatazione moderata,
correlata al rilascio di NO191.
O
m
HN
n
NH
O
ONO 2
O
CH3
N
m=2-4,6,8; n=2-4,6
Figura 34. Ibrido tra tacrina, acido ferulico e NO-donor
Un ibrido costituito da una porzione antiossidante e una antinfiammatoria è il GT094 (Figura 35); deriva da GT-015 ed è costituito da una porzione farmacofora dei
36
Introduzione generale
FANS e da un raggruppamento NO-donor. In questo caso il linker contribuisce
all’attività biologica. Questa combinazione ha un chiaro potenziale nei disordini
neurodegenerativi ma, ad oggi, è stata riportata, in studi in vitro e in vivo, solo
un’attività
chemiopreventiva
192,193
citoprotettiva)
(antinfiammatoria,
antiproliferativa
e
.
OEt
O
S
S
O 2NO
GT-094
O 2NO
Figura 35. Ibrido tra NO-donor e FANS
Un altro esempio interessante è rappresentato da HCT-1026 (Figura 36), in cui il
flurbiprofene è legato ad una funzione NO-donor. In seguito ad idrolisi, in vivo,
vengono rilasciati il 4-idrossi-butilnitrato e il flurbiprofene. Questo composto
ibrido possiede un profilo di sicurezza migliore rispetto al FANS stesso194. Dal
nitrato potrebbe essere rilasciato lentamente NO, sebbene una chiara
identificazione degli steps metabolici per i quali NO-FANS producono NO non
sia
ancora
stato
definita195.
Diversi
studi
hanno
riportato
un’attività
antinfiammatoria per HCT-1026196,197 sebbene il suo meccanismo di azione non
sia del tutto chiaro e recentemente è stata ipotizzata un’attività antinfiammatoria
NO indipendente FANS-indipendente198. Mentre GT-1061 mostra un eccellente
biodisponibilità nel cervello, i livelli nel plasma e nel cervello di HCT-1026
sembrano essere sotto la soglia minima195.
CH3
F
O
ONO2
O
HCT-1026
Figura 36. Ibrido tra NO-donor e flurbiprofene
37
Introduzione generale
E’ stato progettato anche un ibrido che racchiude acido ferulico (che viene
rilasciato dalla bioattivazione delle esterasi), flurbiprofene e la porzione 4idrossibutilinitrica, NCX-2216 (Figura 37). Questo ibrido sembra inibire
transitoriamente l’innalzamento di TNFα e iNOS dopo un induzione di LPS199.
L’ibrido contente solo l’acido ferulico e il raggruppamento nitrato sembra avere
anch’esso attività inibitoria dell’espressione di iNOS200; questo suggerisce che
l’acido ferulico contribuisce all’attività dell’ NO-flurbiprofene. E’ stata inoltre
riscontrata una riduzione del 40-45% di depositi amiloidi201,202.
CH3
F
O
CH3
O
O
O
ONO 2
O
NCX-2216
Figura 37. Ibrido tra NO-donor, acido ferulico e flurbiprofene
5.3 Ibrido AChEI / Antidepressivo
L’alterazione del sistema serotoninergico e noradrenergico, sommata alla perdita
colinergica,
conduce
nei
pazienti
con
AD
a
profondi
cambiamenti
comportamentali, inclusa depressione, psicosi e deficit cognitivo. Questo apre una
strada per un intervento terapeutico basato su farmaci che accrescono l’attività
delle ammine biogene nel cervello, sia da soli che uniti ad altri composti che
agiscono sul sistema colinergico203,204. Sono stati rilevati effetti promettenti in
pazienti in cui l’inibitore selettivo MAO Selegilina è stato combinato con inibitori
AChE.
La porzione farmacofora della selegilina, cioè la propargil-ammina, è stata
incorporata nello scheletro della fisostigmina, con aggiunta di un immina, che
sembra funzionare da substrato per le MAO205 (Figura 38). E’ stata riportata una
serie di ibridi basati sull’indolo, che sono stati testati per l’attività inibitoria di
38
Introduzione generale
MAO-A, MAO-B e
AChE206. L’introduzione di alogeni elettronattrattori in
posizione 8 dell’indolo risulta accrescere l’affinità per AChE.
H3C
NH
O
H3C
CH3
N
O
N
H
CH3
N
CH
CH3
CH3
Fisostigmina
Selegilina
R1
R3
N
O
R4
N
O
R2
N
R
CH3
Figura 38. Ibrido tra Fisostigmina e Selegilina
Gli ibridi migliori sono quelli selettivi per MAO-A rispetto a MAO-B; la
sostituzione in posizione 8 aumenta l’affinità per MAO-A, mentre in 6 aumenta
l’affinità per MAO-B. Il composto più potente (R1,R3,R4 =Me, R2=8-Br) ha un
IC50 =0.54, 51 e 0,06 μM per l’inibizione di MAO-A, MAO-B e AChE206.
La combinazione di AChEI con SSRI porta a grandi benefici terapeutici rispetto
ad una somministrazione separata; le porzioni chiave di rivastigmina e fluoxetina
sono stati scelte come basi per l’ottenimento di ibridi AChEI/SSRI e sono stati
sintetizzati 2 gruppi di composti, a catena aperta o ad anello chiuso207 (Figura 39).
E’ stato dimostrato un miglioramento dell’attività rispetto alla fluoxetina e la
rivastigmina stessi.
39
Introduzione generale
H3C
N
CH3
CH3
NH
O
O
CH3
O
N
CH3
CH3
CF 3
Fluoxetina
Rivastigmina
CH3
CH3
N
N
O
H3C
O
H3C
O
O
N
NH
CH3
CH3
Ibrido ad anello
O
O
Ibrido a catena aperta
NO 2
NO 2
Figura 39. Ibridi tra SSRI e AChEI
Infine un altro esempio è il Ladostigil208,209 (Figura 40), utilizzato per trattare la
demenza e la depressione associata ad AD; questo composto è il risultato della
combinazione delle frazioni farmacofore dell’inibitore dell’AchE Rivastigmina e
dell’inibitore MAO-B Deprenyl. E’ stato provato che questo ibrido possiede
attività neuro protettive sia in vivo che in vitro210,211.
H3C
N
O
CH3
O
CH3
CH3
N
O
CH3
CH3
Rivastigmina
H3C
N
N
O
NH
CH
CH3
CH
CH3
Deprenyl
Figura 40. Ibrido tra rivastigmina e deprenyl
40
INTRODUZIONE ALLA PARTE
SPERIMENTALE
41
Introduzione alla parte sperimentale
Il morbo di Alzheimer è una patologia a carico del sistema nervoso centrale
caratterizzata da una degenerazione cerebrale progressiva ed irreversibile che
colpisce più di 36 milioni di soggetti anziani in tutto il mondo177. Le principali
caratteristiche neuropatologiche dell’AD sono l’accumulo extracellulare di
peptide -amiloide nelle placche senili, la formazione di aggregati neurofibrillari e
la perdita di attività neuronale e sinaptica con conseguente atrofia delle regioni
corticali e subcorticali5.
Le placche senili, che caratterizzano l’Alzheimer, sono costituite da aggregati di
Aβ che deriva dalla proteolisi della proteina APP ad opera della β-secretasi
(BACE), e della γ-secretasi (GS)6 (Figura 41).
Figura 41. Formazione del peptide Aβ
Dato il ruolo chiave di BACE e GS nella formazione dei peptidi neurotossici,
entrambi gli enzimi hanno rappresentato dei validi target per lo sviluppo di
farmaci in grado di prevenire la formazione di placche amiloidi15-20. Tra gli
inibitori BACE sviluppati nell'ultimo decennio si ritrova il Rosiglitazone62, mentre
tra gli inibitori GS attualmente in studi clinici si ritrovano il Semagacestat 30,31,
un’inibitore di GS; il derivato RO-57 sembra invece capace di modularne
l’attività37. (Figura 42).
42
Introduzione alla parte sperimentale
H3C
CH3
O
HO
NH
O
O
O
S
N
HN
CH3
NH
O
NH
N
H3C
O
O
CH3
N
N
N
CH3
O
CH3
N
N
CH3
H3C
Rosiglitazone
Semagacestat
RO-57
Figura 42. Farmaci che agiscono sulla cascata amiloide
Successivamente alla formazione di Ai peptidi neurotossici si uniscono a
formare aggregati con metalli di transizione, come Zinco (Zn) e Rame (Cu), che
ne provocano una rapida precipitazione66. A causa delle stabili interazioni che si
instaurano tra Ae gli ioni metallici, ne consegue una diminuzione della
concentrazione di ioni liberi circolanti nell’intero organismo, che generalmente è
accompagnata dalla formazione di radicali liberi, per mancanza di ioni Cu68, e
squilibrio nell’omeostasi sinaptica, per mancanza di ioni Zn69.
Dato il ruolo chiave degli ioni metallici nella formazione dei depositi di amiloide, recentemente sono stati sviluppati dei composti capaci di agire come
chelanti del rame e dello zinco e quindi capaci di prevenire l’interazione con i
peptidi AIl primo, e forse il più interessante, composto chelante è la 5-cloro-7iodo-8-idrossi-chinolina, ovvero il cliochinolo71 (CQ) (Figura 43).
Cl
I
N
OH
Figura 43. CQ
CQ è in grado di chelare selettivamente Zn2+ e Cu2+ rispetto a Ca2+ e Mg2+,
diminuendo così l’Aβ precipitato attraverso la sua trasformazione in Aβ
solubile71, permettendone quindi l’eliminazione da parte di proteasi normalmente
presenti nel cervello73.
43
Introduzione alla parte sperimentale
La chelazione dei metalli avviene con due molecole di CQ attraverso la
formazione di due legami ionici tra il gruppo OH di CQ in posizione 8 e due
legami di coordinazione tra l’azoto chinolinico e il metallo stesso79 (Figura 44).
Figura 44. Complesso tra 8-idrossichinolina e metallo
Un altro aspetto patologico importante dell’AD è rappresentato dalla diminuzione
dei livelli di Acetilcolina nella corteccia e nell’ippocampo86-88; la maggioranza
delle strategie terapeutiche per il trattamento di questa malattia si basa proprio su
questo e prevede l’utilizzo di inibitori dell’Acetilcolinesterasi (AChEI). La
Tacrina (Figura 45) è stato il primo inibitore dell’ AChE approvato per l’AD nel
1993, ma ha mostrato gravi effetti collaterali, soprattutto epatotossicità.
Successivamente, sono stati approvati altri inibitori di AChE quali Donepezil,
Rivastigmina e Galantamina, che sono attualmente utilizzati in terapia107.
N
NH2
O
MeO
N
MeO
Tacrina
Donezepil
44
Introduzione alla parte sperimentale
CH3
H3C
OMe
N
O
O
O
CH3
OH
N
N
CH3
CH3
CH3
Galantamina
Rivastigmina
Figura 45. Inibitori di AChE
Altra classe di farmaci impiegati è rappresentata dagli antagonisti del recettore
glutamatergico NMDA. Infatti la eccitotossicità mediata dal glutammato e lo
stress ossidativo indotto dall’A amiloide sono ritenuti i principali responsabili
della neurodegenerazione che si osserva nell’AD117,118,121. Il farmaco più
importante appartenente a questa classe è la memantina107 (Figura 46).
NH2
H3C
CH3
Memantina
Figura 46. Inibitore NMDAR
Le strategie terapeutiche attuali per la cura dell’AD non risultano capaci di
modificare in modo significativo il decorso della neurodegenerazione, ma offrono
solo benefici transitori e limitati ai pazienti affetti da tale patologia.
Considerando la sua natura multifattoriale, gli attuali farmaci basati sul concetto
“una molecola- un target” non sono sufficienti per fermare la progressione della
malattia, mentre l’approccio multitarget, in cui una molecola è in grado di agire
simultaneamente su diversi processi patologici, potrebbe risultare più efficace178.
Inoltre, evidenze sperimentali, hanno mostrato che sia gli AChE inibitori che
45
Introduzione alla parte sperimentale
l’antagonista NMDA memantina impiegati per la terapia dell’AD e approvati
dall’FDA come trattamenti a singolo target, risultano in realtà molecole
promiscue capaci di interagire anche con altri bersagli farmacologici178.
Negli ultimi anni è quindi cresciuto l’interesse sulla ricerca di farmaci multitarget
per il trattamento dell’AD, ed in letteratura fioriscono numerosi esempi di ibridi
dotati di proprietà neuroprotettive178.
Un esempio di farmaco multitarget sviluppato per il trattamento dell’AD è il
T3CA, un ibrido formato dalla Tacrina (AChEI) e dall’Acido caffeico (proprietà
antiossidanti)181 (Figura 47). Recenti studi hanno indicato che oltre alla
neuroprotezione indotta dall’antiossidante e dall’inibizione dell’enzima AChE,
tale dimero è capace di bloccare in vitro la morte cellulare indotta dal glutammato
attraverso l’attivazione di un pathway endogeno di sopravvivenza (Nrf2/HO-1
pathway). T3CA si è rivelato un potente inibitore del BACE1 (IC50 = 250 nM),
l’enzima associato alla produzione di  ed è inoltre capace di chelare gli ioni
rameici. Quest’ultima attività è stata attribuita al linker diamminico181.
O
NH2
HO
OH
N
HO
Acido caffeico
Tacrina
R
OH
NH
NH
OH
N
n
O
n=2,3,6
R= H,Cl
Figura 47. T3CA
46
Introduzione alla parte sperimentale
Sulla base di queste considerazioni, in questa tesi di laurea è stata progettata la
sintesi dei derivati multitarget 1,2 e 3. Il composto 1 è costituito da tre porzioni
farmacoforiche, riconducibili al cliochinolo
(chelante di ioni metallici), alla
rivastigmina (AChEI) e all’acido lipoico (antiossidante). Il derivato 2 presenta
come nucleo centrale quello idrossi-piridinico, a cui è stata legata la porzione
antiossidante dell' acido lipoico e quella AchEI del carbammato. Il composto 3
presenta un nucleo anilinico, al quale è stato legato l’acido lipoico, ed una
porzione piridinica, alla quale è stato legato il carbammato.
O
Linker 1,3
diammino-propanico
HN
NH
S
S
Nucleo chinolinico
Acido lipoico
N
H3C
O
N
Carbammato
O
CH3
1
Linker 1,3 diammino
Nucleo idrossi-
propanico
O
piridinico
O
NH
NH
S
N
O
O
N
S
Acido lipoico
CH3
CH3
Carbammato
2
47
Introduzione alla parte sperimentale
Nucleo piridinico
O
Acido lipoico
N
N
H3C
N
O
S
CH3
S
HN
Carbammato
O
Nucleo anilinico
3
Per la sintesi del composto 1 sono state tentate varie vie di sintesi; purtroppo,
nessuna di queste ha portato al composto finale previsto.
Inizialmente, la sintesi è stata effettuata seguendo la procedura riportata nello
SCHEMA 1
SCHEMA 1
NO 2
NO 2
a
N
N
OH
O
O
CH3
4
5
b
NH2
NH2
HN
c, d, e
N
NON REAGITO
O
O
CH3
7
N
Cl
NH 2
O
O
CH3
6
Reagenti e condizioni: a: Ac2O, Py, 2h, t.a.; b: EtOH, Pd/C, H2, 2h; c: PhOH,
NaI, reflusso, 6h; d: MeCN, K2CO3, KI, MW; e: 1-pentanolo, reflusso, 18h.
48
Introduzione alla parte sperimentale
L’8-idrossi-5-nitro chinolina commerciale 4 è stata acetilata in posizione 8 per
reazione con anidride acetica in piridina, fornendo il derivato 5. Successivamente
per riduzione catalitica in presenza di Pd/C è stata ottenuta l’ammina 6, la quale è
stata fatta reagire con la 3-cloropropilammina commerciale. Questa reazione è
stata eseguita impiegando differenti condizioni di reazione.
Inizialmente, la
reazione è stata condotta al microonde in presenza di K2CO3, KI e MeCN,
ottenendo un grezzo costituito essenzialmente da prodotto di partenza. Anche la
reazione in cui è stato utilizzato fenolo come solvente e NaI come catalizzatore, a
reflusso per 6h o semplicemente in 1-propanolo non ha portato alla formazione
del composto 7 desiderato.
Un altro tentativo è stato quello di partire dal 5-cloro-8-chinolinolo e farlo reagire
con l’ 1,3-diamminopropano come descritto nello SCHEMA 2.
SCHEMA 2
HN
Cl
Cl
c, d, e, f
a, b
N
N
OR
OH
NH2
H2N
N
NH2
OR
NON REAGITO
8
9a, 9b
10a, 10b
Reagenti e condizioni: a: Ac2O, Py, 2h, t.a.; b: CH3I, K2CO3, DMF, acetone,
12h, t.a.; c: PhOH, NaI, reflusso, 6h; d: MeCN, K2CO3, KI, MW; e: 1-pentanolo,
reflusso, 18h; f: Pd(OAc)2, dppf, t-BuOK, toluene, N2, 72h.
Il composto 5-cloro-8-chinolinolo commerciale 8 è stato protetto a livello della
funzione fenolica per acetilazione con anidride acetica in piridina o per
metossilazione con CH3I per dare rispettivamente i derivati 9a e 9b. La successiva
reazione con 1,3-diamminopropano utilizzando le condizioni descritte nello
SCHEMA 1 (fenolo e KI a reflusso o 1-pentanolo a reflusso o reazione al MW)
od effettuando una reazione di cross coupling Buchwald-Hartwig con Pd(OAc)2,
dppf, toluene e t-BuOK sotto N2 non ha fornito il prodotto desiderato 10.
49
Introduzione alla parte sperimentale
Per quanto riguarda invece il composto 2, è stato sintetizzato seguendo la via
proposta nello SCHEMA 3.
SCHEMA 3
O
O
a
OH
S
+
H2N
NH
NH2
S
11
+
COOH
N
NH2
S
S
12
COOMe
b
N
OH
OH
14
13
c
O
O
NH
NON REAGITO
NH
S
N
OH
S
15
Reagenti e condizioni: a: Et3N, HOBT, EDCI, T=0°C, buio, CH2Cl2, poi t.a.,
24h; b: H2SO4, MeOH, MW; c: toluene, reflusso, 24h.
L’acido lipoico commerciale 11 è stato fatto reagire in CH2Cl2, Et3N, HOBT,
EDCI con l’1,3 diamminopropano a t.a. per ottenere il composto 12.
Contemporaneamente, l’acido 2-idrossi nicotinico commerciale 13 è stato
sottoposto ad esterificazione di Fisher utilizzando H2SO4 e MeOH in microonde, a
dare il composto 14, che è stato sottoposto a reazione di condensazione con il
composto 12 in toluene a reflusso per 24, ma non è stato ottenuto il composto 15
desiderato.
Per il composto 3, invece, è stata seguita la via proposta nello SCHEMA 4.
50
Introduzione alla parte sperimentale
SCHEMA 4
OH
Br
N
N
a
N
+
HO
O 2N
N
H
NO 2
18
17
16
b
O
N
+
S
HO
N
HO
S
NH2
19
11
c
CH3
O
N
d
N
N
N
N
H3C
HO
NH
NH
O
CH3
NH
CH3
O
O
S
S
S
S
3
20
Reagenti e condizioni: a: EtOH, Et3N, reflusso, 12h; b: AcOEt, Pd/C, H2, t.a.,
4h; c: Et3N, HOBT, EDCI, T=0°C, buio, CH2Cl2, poi t.a., 24h; d: CDI, CH2Cl2,
DMF, t.a., 24h.
I composti commerciali 2-(piperazin-1-il)-etanolo 16 e 3-bromometilanilina 17
sono fatti reagire in EtOH per dare il composto 18, il quale viene ridotto con
riduzione catalitica in presenza di Palladio, fornendo il derivato 19. Questo viene
fatto reagire con acido lipoico commerciale 11 in presenza di Et3N, HOBt, EDCI,
ottenendo il derivato 20, il quale a sua volta è fatto reagire con 1,1-carbonilimidazolo e dietilammina commerciale, ottenendo così il composto desiderato 3.
51
PARTE SPERIMENTALE
52
Parte sperimentale
MATERIALI E METODI
La struttura di tutti i composti è stata controllata per mezzo della spettrometria di
massa e ¹H-NMR. Degli spettri ¹H-NMR e MS sono stati riportati i particolari più
significativi. Tutti i composti sintetizzati presentano dati spettroscopici in accordo
con le strutture assegnate.
Gli spettri di risonanza magnetica nucleare sono stati eseguiti con uno
spettrofotometro Varian Gemini 200 operante a 200 MHz in CDCl3, i chemical
shift δ sono espressi in ppm (scala δ).
Le analisi elementari sono state eseguite nel nostro laboratorio di analitica: la
differenza tra i valori teorici e quelli calcolati è risultata essere compresa
nell’intervallo di ± 0,4%.
Le evaporazioni sono state eseguite sottovuoto in evaporatore rotante e le
disidratazioni delle fasi organiche sono state eseguite usando Na2SO4.
Le TLC analitiche sono state effettuate usando lastre Merck di gel di silice G60
contenente un indicatore fluorescente 20×20.2 mm; le varie macchie sono state
evidenziate da una lampada UV (256 nm).
Per le cromatografie su colonna è stato usato un gel di silice Merck 70- 230 Mesh.
Per la filtrazione su celite è stata usata Celite ® 521.
Le procedure assistite dal microonde sono state effettuate con un CEM Discover®
LabMateTM Microwave.
53
Parte sperimentale
SCHEMA 1
Sintesi del composto 5-nitrochinolin-8-il acetato (5)
NO 2
N
O
O
CH3
Ad una soluzione di 8-idrossi-5-nitro chinolina commerciale 4 (500 mg, 2.63
mmoli) sciolta nella minima quantità di piridina, è stata aggiunta Ac2O (0.37 ml,
3.94 mmoli). La soluzione è stata lasciata in agitazione per 2h a temperatura
ambiente. Trascorso tale periodo il solvente è stato evaporato, ottenendo un solido
giallo costituito essenzialmente dal prodotto desiderato 5.
Resa: 96%
1
H NMR (CDCl3): δ 2.54 (s, 3H, OMe); 7.55 (d, 1H, J= 8.5 Hz, Ar); 7.69 (dd,
1H, J= 8.8, 4.1 Hz, Ar); 8.45 (d,1H, J= 8.5 Hz, Ar); 9.02 (dd, 1H, J=4.1, 1.5 Hz,
Ar); 9.09 (dd, 1H, J= 8.8, 1.5 Hz, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C11H8N2O4
C
H
N
Calc. %
56.90
3.47
12.06
Trov. %
56.52
3.36
12.32
54
Parte sperimentale
Sintesi del composto 5-aminochinolin-8-il acetato (6)
NH2
N
O
O
CH3
Ad una soluzione del nitro derivato 5 (591 mg, 2.55 mmoli) in EtOH (5 ml) è
stato aggiunto Pd/C (140 mg). La miscela risultante è stata sottoposta ad
idrogenazione a temperatura ambiente per 2h. Trascorso tale periodo, la soluzione
è stata filtrata su setto a celite ed è stata evaporata, ottenendo un solido giallo
costituito essenzialmente dal prodotto desiderato 6.
Resa: 96%
1
H NMR (CDCl3): δ 2.47 (s, 3H, OMe); 6.76 (d, 1H, J= 8.1 Hz, Ar); 7.24 (d, 1H,
J= 1.5 Hz, Ar); 7.38 (dd, 1H, J= 8.6, 4.2 Hz, Ar); 8.18 (dd, 1H, J= 8.6, 1.7 Hz,
Ar); 8.91 (dd, 1H, J= 4.2, 1.7 Hz, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C11H10N2O2
C
H
N
Calc. %
65.34
4.98
13.85
Trov. %
65.39
4.70
13.51
55
Parte sperimentale
Sintesi del composto 5-[(3-aminopropil)amino]chinolin-8-il
acetato (7)
NH2
HN
N
O
O
CH3
1°PROVA:
Ad una soluzione del composto 6 (200 mg, 0.99 mmoli) in fenolo (0,87 ml, 9.90
mmoli), posto sotto atmosfera di N2, è stato aggiunto NaI (148 mg, 0.99 mmoli) e
la miscela risultante è stata tenuta in agitazione per 1h a riflusso sotto atmosfera di
N2. Quindi è stato aggiunta la 3-cloropropilammina (2,19 g, 16.83 mmoli) e la
reazione è stata lasciata a riflusso per ulteriori 6h. Trascorso tale periodo il
solvente è stato evaporato ed il grezzo è stato purificato tramite cromatografia su
colonna, utilizzando come eluente una miscela CHCl3/MeOH 9.5:0.5, ma non è
stato possibile isolare il prodotto desiderato 7.
2°PROVA:
Ad una soluzione del composto 6 (100 mg, 0.49 mmoli) in MeCN (3 ml) è stata
aggiunta 3-cloropropilammina (43 mg, 0.33 mmoli), K2CO3 (46 mg, 0.33 mmoli)
e KI (27 mg) in MeCN (3ml). La miscela così ottenuta è stata posta al microonde
impostando i seguenti parametri: 250 Watt, 30 minuti, 160°C, 150 psi. Dopo
raffreddamento, il solvente è stato evaporato, ottenendo un grezzo corrispondente
al prodotto di partenza 7.
3°PROVA:
Ad una soluzione del composto 6 (200 mg, 0.99 mmoli) sciolto nella minima
quantità necessaria di 1-pentanolo, è stato aggiunta 3-cloropropilammina (278 mg,
2.97 mmoli).La miscela di reazione è stata posta sotto agitazione a riflusso per
18h. Trascorso tale periodo il solvente è stato evaporato e il grezzo è stato
56
Parte sperimentale
sottoposto a cromatografia su colonna utilizzando come eluente una miscela
CHCl3/MeOH 9.5:0.5, ma, anche in questo caso, non è stato possibile isolare il
prodotto desiderato 7.
57
Parte sperimentale
SCHEMA 2
Sintesi del composto 5-clorochinolin-8-il acetato (9a)
Cl
N
OAc
Ad una soluzione di 5-cloro-8-chinolinolo 8 (2.00 g, 11.14 mmoli) sciolto nella
minima quantità di piridina, è stata aggiunta Ac2O (0.94 ml, 11.14 mmoli). La
soluzione è stata lasciata in agitazione per 2h a temperatura ambiente, quindi il
solvente è stato evaporato, ottenendo un solido giallo costituito essenzialmente dal
prodotto desiderato 9a.
Resa: 96%
1
H NMR (CDCl3): δ 2.51 (s, 3H, OMe); 7.39 (d, 1H, J= 8.2 Hz, Ar); 7.55 (dd,
1H, J= 8.6, 4.2 Hz, Ar); 7.62 (d, 1H, J= 8.2 Hz, Ar); 8.58 (dd, 1H, J= 8.6, 1.6 Hz,
Ar); 8.97 (dd, 1H, J= 4.2, 1.6 Hz, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C11H8NO2Cl
C
H
N
Calc. %
59.61
3.64
6.32
Trov. %
59.78
3.58
6.46
58
Parte sperimentale
Sintesi del composto 5-cloro-8-metossichinolina (9b)
Cl
N
OMe
Ad una soluzione di 5-cloro-8-chinolinolo 8 (200 mg, 1.11 mmoli) sciolto in
acetone (5 ml) e DMF (minima quantità necessaria) è stato aggiunto CH3I (316
mg, 2.23 mmoli) e K2CO3 (308 mg, 2.23 mmoli). La miscela è stata lasciata in
agitazione per 12h a temperatura ambiente. Trascorso tale periodo, la soluzione è
stata evaporata ed il residuo è stato ripreso con CH2Cl2 e lavato con NaOH ed
H2O. La fase organica è stata poi essiccata, filtrata ed evaporata, ottenendo un
solido grezzo costituito essenzialmente dal prodotto desiderato 9b.
Resa: 77%
1
H NMR (CDCl3): δ 4.09 (s, 3H, OMe); 6.98 (d, 1H, J= 8.4 Hz, Ar); 7.55-7.59
(m, 1H, Ar); 7.54 (d, 1H, J= 8.4 Hz, Ar); 8.54 (dd, 1H, J= 8.6, 1.5 Hz, Ar); 8.98
(dd, 1H, J= 4.0, 1.5 Hz, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C10H8NOCl
C
H
N
Calc. %
62.03
4.16
7.23
Trov. %
61.70
4.36
7.01
59
Parte sperimentale
Sintesi del composto 10a,b
HN
NH2
N
OR
1°PROVA:
Ad una soluzione dell’opportuna chinolina 9a,b (0.86 mmoli) in fenolo (0.75 ml,
8.57 mmoli), è stato aggiunto NaI (38 mg, 0.26 mmoli) e la miscela risultante è
stata tenuta in agitazione per 1h a riflusso sotto atmosfera di N2. Quindi è stato
aggiunto 1,3-diamminopropano (825 mg, 11.14 mmoli) e la miscela di reazione è
stata lasciata reagire per ulteriori 6h. Trascorso tale periodo il solvente è stato
evaporato ed il grezzo è stato sottoposto a cromatografia su colonna, utilizzando
come eluente una miscela CHCl3/MeOH 9:1, ma non è stato possibile isolare il
composto desiderato 10a,b.
2°PROVA:
Ad una soluzione dell’opportuna chinolina 9a,b (1.03 mmoli) in MeCN (15 ml) è
stato aggiunto 1,3-diamminopropano (51 mg, 0.69 mmoli), K2CO3 (143 mg, 1.03
mmoli) e KI (171.5 mg). La miscela di reazione così ottenuta è stata posta al
microonde impostando i seguenti parametri: 250 Watt, 30 minuti, 160°C, 150 psi.
Trascorso tale periodo, dopo raffreddamento, il solvente è stato evaporato,
ottenendo un grezzo corrispondente al prodotto di partenza 10a,b.
3°PROVA:
Ad una soluzione dell’opportuna chinolina 9a,b (0.90 mmoli) in 1-pentanolo
(minima quantità), è stato aggiunto 1,3-diamminopropano (200 mg, 2.70 mmoli).
La miscela di reazione è stata posta sotto agitazione a riflusso per 18h. Trascorso
tale periodo il solvente è stato evaporato e il grezzo è stato sottoposto a
cromatografia su colonna, utilizzando come eluente una miscela CHCl3/MeOH
60
Parte sperimentale
9:1, ma anche in questo caso non è stato possibile isolare il composto desiderato
10a,b.
4°PROVA:
Ad una soluzione dell’opportuna chinolina 9a,b (0.83 mmoli) in toluene (5 ml) è
aggiunto Pd(OAc)2 (37 mg, 0.16 mmoli) e dppf (91 mg, 0.16 mmoli). La miscela
è stata lasciata in agitazione a riflusso sotto atmosfera di N2 per 10 minuti, quindi
è stato aggiunto t-BuOK (93 mg, 0.83 mmoli) e la miscela è lasciata in agitazione
per altri 10 minuti. Trascorso tale periodo, è stato aggiunta goccia a goccia una
soluzione di 1,3-diamminopropano (122 mg, 1.65 mmoli) in toluene (1ml). La
soluzione è stata poi lasciata in agitazione a riflusso per 48h, quindi il solvente è
stato evaporato ottenendo un grezzo che è stato sottoposto a colonna
cromatografica utilizzando come eluente una miscela CHCl3/MeOH 9:1, ma non è
stato possibile isolare il composto desiderato 10a,b.
61
Parte sperimentale
SCHEMA 3
Sintesi del composto metil 2-idrossipiridina3 carbossilato
(14)
COOMe
N
OH
Ad una soluzione di Acido 2-idrossinicotinico 13 (1,4 g, 10,07 mmoli) in MeOH
(8ml) è stato aggiunto H2SO4 conc. (2,5 ml). La miscela di reazione così ottenuta
è stata posta al microonde impostando i seguenti parametri: 200 Watt, 40 minuti,
100°C, 100 psi. Trascorso tale periodo, si è evaporato il MeOH e la soluzione è
stata neutralizzata con una soluzione satura di NaHCO3. Si è estratto con
CH2Cl2,essiccato, filtrato ed evaporato, ottenendo un solido bianco costituito
essenzialmente dal prodotto desiderato 14.
Resa: 79%
1
H NMR (CDCl3): δ 3,72 (s, 3H, OMe); 6,26 (dd, 1H, J= 7,1, 6,3 Hz, Ar); 7,66
(dd, 1H, J= 6,3, 2,2 Hz, Ar); 8,05 (dd, 1H, J= 7,1, 2,2 Hz, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C7H7NO3
C
H
N
Calc. %
54.90
4.61
9.15
Trov. %
54.82
4.55
9.01
62
Parte sperimentale
Sintesi del composto N-(3-aminopropil)-5-(1,2-ditiolan-3il)pentanamide (12)
O
NH
S
NH2
S
Ad una soluzione di 1,3-diaminopropano (216 mg, 2.91 mmoli) in CH2Cl2 (5 ml),
raffreddata a 0°C, è stato aggiunto in successione Et3N (589 mg, 5.83 mmoli),
HOBt (157 mg, 1.17 mmoli), EDCI (223 mg, 1.17 mmoli), e la miscela risultante
è stata lasciata in agitazione, al buio, per 30 minuti. Quindi è stata addizionata di
acido lipoico 11 (200 mg, 0.97 mmoli) è lasciata in agitazione a t.a. per ulteriori
24h. Trascorso tale periodo il solvente è stato evaporato. Il grezzo così ottenuto è
stato purificato tramite precipitazione da MeOH/Et2O. La soluzione è stata
evaporata ottenendo un olio costituito dal prodotto desiderato 12.
Resa: 46%
1
H NMR (CDCl3): δ 1.04-1.23 (m, 2H, CH2); 1.35-1-67 (m, 4H, CH2); 2.15-2.39
(m, 6H, CH2); 2.70-2.81 (m, 2H, CH2); 3.05-3.49 (m, 5H, CH, CH2) ppm.
Analisi elementare:
C11H22N2O3S2
C
H
N
Calc. %
50.34
8.45
10.67
Trov. %
50.50
8.55
11.01
63
Parte sperimentale
Sintesi del composto N-(3-{[5-(1,2-ditiolan-3il)pentanoil]amino}propil)-2-idrossipiridina-3-carbossamide
(15)
O
O
NH
NH
S
N
OH
S
Una miscela dell'estere 14 (29 mg, 0.19 mmoli) e dell'ammina 12 (100 mg, 0.38
mmoli) è stata scaldata in fiala a 150°C per 48h. Trascorso tale periodo è stato
aggiunto HCl 1N, fino a pH=4, e la fase acquosa è stata estratta con CHCl 3, la
fase organica è stata essiccata, filtrata ed evaporata. Il grezzo ottenuto è stato
cromatografato usando come eluente CHCl3/MeOH 9.5:0.5. Non è stato però
possibile isolare il prodotto desiderato 15.
64
Parte sperimentale
SCHEMA 4
Sintesi del composto 2-[4-(3-nitrobenzil)piperazin-1il]etanolo (18)
N
N
HO
NO 2
Una soluzione di piperazina commerciale 16 (1 g; 11.63 mmol) in EtOH in
minima quantità e Et3N ( 880.9 mg; 8.722 mmol; 1.2 ml) viene scaldata a riflusso.
E’ stato aggiunto quindi goccia a goccia il 3-nitro-benzilbromuro commerciale 17
(1.256 g; 5.814 mmol) sciolto in EtOH in minima quantità. La miscela di reazione
è stata lasciata sotto agitazione a riflusso per 2h. Trascorso tale periodo si è
lasciato raffreddare la sospensione fino a t.a. e si è filtrato su setto. Il solvente è
stato evaporato a pressione ridotta e sul solido ottenuto è stata eseguita una
triturazione con CHCl3. La soluzione è stata decantata, quindi il solvente è stato
evaporato per ottenere il grezzo 18 che non è stato ulteriormente purificato.
Resa: 69%
1
H NMR (CDCl3): δ 2.54-2.65 (m, 6H, CH2); 3.55-3.64 (m, 6H, CH2); 7.47 (dd,
1H, J= 8.1, 7.8 Hz, Ar); 7.49 (d, 1H, J=7.8 Hz, Ar); 8.10 (d, 1H, J= 8.1 Hz, Ar).
Analisi elementare:
C13H19N3O3
C
H
N
Calc. %
58.85
7.22
15.84
Trov. %
58.70
7.60
15.91
65
Parte sperimentale
Sintesi del composto 2-[4-(3-aminobenzil)piperazin-1il]etanolo (19)
N
N
HO
NH2
Ad una soluzione di nitroderivato 18 (300 mg, 1.13mmoli) in AcOEt (5 ml) è
stato aggiunto Pd/C (55 mg). La miscela risultante è stata sottoposta ad
idrogenazione a temperatura ambiente per 4h. Trascorso tale periodo, la soluzione
è stata filtrata su setto a celite ed è stata evaporata, ottenendo un solido giallo
costituito essenzialmente dal prodotto desiderato 19.
Resa: 75%
1
H NMR (CDCl3): δ 2.48-2.56 (m, 8H, CH2); 2.90 (t, 2H, J= 4.8 Hz, CH2); 3.42
(s, 1H, CH2); 3.57-3.64 (m, 2H, CH2); 6.48-6-61 (m, 2H, Ar), 6.67-6.71 (m, 1H,
Ar); 7.00-7.13 (m, 1H, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C13H19N3O3
C
H
N
Calc. %
66.35
8.99
17.86
Trov. %
66.24
9.31
17.94
66
Parte sperimentale
Sintesi del derivato 20
N
N
HO
NH
O
S
S
Ad una soluzione di anilina 19 (230 mg, 0.98 mmoli) in CH2Cl2 (5 ml),
raffreddata a 0°C, è stato aggiunto in successione Et3N (534 mg, 5.28 mmoli),
HOBt (142 mg, 1.06 mmoli), EDCI (202 mg, 1.06 mmoli), e la miscela risultante
è stata lasciata in agitazione, al buio, per 30 minuti. Quindi è stata addizionata di
acido lipoico 11 (182 mg, 0.88 mmoli) ed è stata lasciata in agitazione a t.a. per
ulteriori 24h. Trascorso tale periodo il solvente è stato evaporato. Il grezzo così
ottenuto è stato purificato tramite colonna cromatografica utilizzando come
eluente CHCl3/MeOH 9:1. La soluzione è stata evaporata ottenendo un olio
costituito dal prodotto desiderato 20.
Resa: 19%
1
H NMR (CDCl3): δ 1.52-2.00 (m, 7H, CH2); 2.33-2.65 (m, 13H, CH2); 3.09-
3.20 (m, 2H, CH2); 3.51 (s, 1H, CH2); 3.55-3.67 (m, 3H, CH2); 7.05 (d, 1H, J=
7.50 Hz, Ar); 7.23-7.31 (m, 2H, Ar); 7.47 (s, 1H, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C21H33N3O2S2
C
H
N
Calc. %
59.54
7.85
9.92
Trov. %
59.66
8.06
10.15
67
Parte sperimentale
Sintesi del derivato finale 3
CH3
O
N
N
N
O
NH
CH3
O
S
S
Ad una soluzione di alcol 20 (30 mg, 0.07 mmoli) sciolto in CH2Cl2 e DMF in
minima quantità, viene aggiunto CDI (12 mg). La miscela è stata posta a t.a. sotto
agitazione per 2h. Trascorso tale periodo è stata aggiunta dietilammina (5 mg,
0.07 mmoli) e la miscela è stata fatta reagire per altre 24h, quindi è stata ripresa
con CH2Cl2 e lavata con una soluzione satura di NaCl. Il solvente è stato
evaporato ed il grezzo è stato purificato tramite colonna cromatografica
utilizzando come eluente CHCl3/MeOH 9:1, ottenendo il derivato 3.
Resa: 20%
1
H NMR (CDCl3): δ 1.06-1.17 (m, 6H, CH3); 1.51-2.16 (m, 7H, CH2), 2.33-2.72
(m, 11H, CH2); 3.05-3.26 (m, 6H, CH2), 3.55-3.60 (m, 3H, CH2, CH ); 3.77 (s,
2H, CH2), 4.20-4.28 (m, 2H, CH2); 7.06 (d, 1H, J= 6.9 Hz, Ar); 7.22-7.33 (m, 2H,
Ar); 7.50-7.60 (m, 1H, Ar) ppm.
Analisi elementare:
C26H42N4O3S2
C
H
N
Calc. %
59.74
8.10
11.72
Trov. %
59.41
8.01
11.53
68
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84
Ed eccoci giunti, baldi giovanotti, alla parte in cui chi non ha capito nulla di
quello che ho scritto fino ad ora può gioire, perchè finalmente torno a parlare
italiano.
Grazie inanzitutto alla Prof. ssa Rapposelli, che mi ha dato la possibilità di
imparare a lavorare in un laboratorio di sintesi e di fare una bellissima esperienza.
Grazie a Ketty, che ha sofferto insieme a me in questo lungo cammino oscuro, a
Giulia per avermi incoraggiato anche se non mi veniva un tubo ed a Simona, con
cui probabilmente fonderò un gruppo di coriste.
Grazie a babbo e mamma, per avermi permesso, con molti sacrifici, di arrivare
fino a questo punto, alla palletta, semplicemente per volermi tanto bene, a mio
fratello, agli zii ed a tutto il resto della mia famiglia.
Grazie alle mie compagne di laboratorio, con cui ho condiviso lunghe file
all’evaporatore, ed a quel grullo di Matteo che ci ha movimentato le giornate.
Grazie ad Antonella, o meglio “Madre”, per avermi insegnato ad essere una vera
farmacista, a Virginia per avermi adottato quando madre non c’era, ed a tutti i
farmacisti della Comunale 5 di Pisa per essere intervenuti in mio aiuto quando i
clienti non erano del tutto normali.
Grazie al mio super fantastico bellissimo cane Miù, per essere un topino
batuffoloso e per farmi sempre le feste.
Grazie a Francesco e Patrizia, che mi hanno coinvolto nel losco giro dei giochi di
ruolo e nella movida fiorentina.
Grazie ad Alessandra, per essere tornata appositamente da Londra e per unirsi al
gruppo delle pazze nel viaggio della speranza (non sai quello che stai facendo).
Grazie agli amici, Alfredo, Rossella, Jacopo, Alice, Dario, Barbara, Alberto,
Paolo, Giuseppe, Giulia (anzi Giulie), Gabriele, Chiara e tutti quelli che mi sono
dimenticata!
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Grazie a Valter, Lucia, Vale, Ilir, Francesca, Adriano, Mariella, Margherta, Matia,
Asia e Alessio e a tutta la pizzeria Bar Roma per avermi accompagnato in 5 anni
della mia vita, per avermi insegnato un lavoro e per avermi fatto sentire come una
di famiglia.
Grazie a Marzia, che non è più mia suocera ma che è rimasta una grande amica.
Sono quasi alla fine è, resistete.
Grazie a Silvia, per aver bruciato broccoli e fuso moke, per aver pulito il bagno n
volte più di me, per avermi trascinato nelle pazze serate pisane, per essere una
delle mie fornitrici ufficiali di libri da leggere e per essersi unita anche solo per un
anno al club di via fratti (povera innocente).
Grazie a Giulia, alias Amanti, per avermi svegliato soavemente (cioè urlando e
saltandomi sul letto) le mattine pisane, per aver fatto ritardare quasi tutti i treni/
autobus che ha preso con me, per essere la modella principale delle foto più idiote
che ho, per farmi da parrucchiera e personal trainer e per essere fondamentalmente
pazza. Ma soprattutto grazie per avermi sopportato 10 anni. Ti voglio bene!
Grazie ad Alessandro, che mi ha accompagnato in quest’ultimo anno e mezzo e
che poverino, a quanto dice, non ha intenzione di lasciarmi. Ti amo.
Infine grazie a tutti voi per aver letto la mia probabilmente unica opera letteraria,
per essere venuti in un giorno per me così importante e per partecipare con me alla
gioia di questo momento.
Ed ora, festaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa!!
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