07/01/2015
Produzione di antibiotici da microrganismi
Paolo Landini
Uni Milano
Margherita Sosio
KtedoGen
Gli antibiotici sono composti di basso peso
molecolare (150-5000 Dalton) in grado di
inibire la crescita batterica a basse
concentrazioni (nM-mM)
Gli antibiotici sono (in gran parte) “Metaboliti secondari”
prodotti da microrganismi
Struttura chimica molto complessa
Molecole organiche con presenza di atomi “insoliti”
(Cl, F)
Cosa si intende per metaboliti secondari?
Sono prodotti solo da alcune specie batteriche
• non sono essenziali per il microrganismo produttore
• sono generalmente prodotti al termine della crescita
(fase stazionaria)
• presenza di ceppi all’interno della stessa specie con
differente capacità di produzione (da 0 a iperproduttori)
• Spesso coprodotti con composti simili o con altri
metaboliti
I metaboliti primari sono (ovviamente) quelli necessari alla
vita della cellula e comuni a tutti gli organismi
•Amino acidi
•Zuccheri
•Acidi grassi
•Vitamine e cofattori enzimatici, etc.
1
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Applicazioni di metaboliti secondari
di origine microbica
antibiotici (penicilline, eritromicina, tetracicline, etc.)
antitumorali (daunomicina, bleomicina, calicheamicina, etc.)
antifungali (anfotericina, echinocandina)
immunosoppressori (ciclosporina, etc.)
altri farmaci: lovastatina (anti-colesterolo), acarbose (diabete)
utilizzo veterinario (avermectina, antielmintico)
agricolo (polioxina, bialaphos, blasicidina, antifungali e antiparassitari)
allevamenti (antibiotico per uso animale)
antibiotics for human medicine
O HO
OH
OH
N
H
O
O
OH
O
HO
HO
O
O
HO
O
HO
O
NH
O
Cl
O
N
H
NH
O
CH3
H
N
N
H
O
CH3
CH3
O
H
N
O
Cl
O
HO
NH
O
fusidic acid, Mr 519
CH3
NH2
O
HO
HO
O
O
HO
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
HO
teicoplanin, Mr 1908
OH
HO
O
O
OH
CH3
N
O
H3C
CH3
OH
HO
O
OMe
O
P
O
O
OH
OH
O
phosphomycin, Mr 166
erythromycin, Mr 720
antitumor agents
O
NH2
H
N
NH2
N
N
O
NH
O
OH
O
HO
N
N
H
O
OH
OH
OH
OH
S
bleomycin, Mr 1415
H3C
O
OH
O
O
NH2
O
O
O
HO
O
O
OH
O
OH
S
N
HO
OH
O
O
H
N
N
H
+
N
H
N
O
H
N
H2N
S
O
O
OH
CH3
OH
O
O
O
HO
NH
O
H3C
O
H3C
H
O
Sn
H3C
calicheamycin, Mr 1071
NH2
daunomycin, Mr 506
O
S
N
CH3
O CH
3
O
O
O
OH
NH
OH
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antifungal agents for human medicine
OH
HO
HO
O
HO
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
O
O
OH
OH
amphothericin, Mr 922
NH 2
HO
HO
O
O
N
NH
N
H
O
HN
OH
O
OH
HO
O
O
NH
O
OH
HN
OH
N
HO
echinocandin, Mr 1036
HO
immunosuppressants and other pharmacological agents
HO
H3C
O
CH3
O
N
O
O
NH
O
O
O
O
N
N
H
HN
O
O
CH3
N
O
O
NH
OH
OH
O
HO
O
O
O
OH
CH3
HN
CH3
O
N
N
OH
HO
FK506, Mr 802
O
N
HN
CH3
N
H3C
H3C
O
CH3
O
cyclosporin, Mr 1201
HO
O
O
O
OH
HO
OH
O
HO
OH
O
O
O
HO
H
O
OH
OH
acarbose, Mr 632
lovastatin, Mr 403
Gli Actinomycetales sono i principali produttori di metaboliti secondari
60.0
Actinomycetales
% metabolites
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
3
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Cosa sono gli Attinomiceti ?
(una visione “utilitaristica”)
Batteri estremamente complessi da un punto di vista
biochimico, genomico e cellulare (originariamente
classificati come funghi)
Principalmente (ma non solo) microrganismi del suolo
Possono degradare sostanze organiche di struttura
molto complessa fino a mineralizzazione
(potenzialmente buoni bio-risanatori)
Generalmente non patogeni
Produttori di antibiotici utilizzati in terapia
Cosa sono gli Attinomiceti ?
(dal punto di vista tassonomico)
Batteri Gram positivi sporigeni, con crescita ifale/
pluricellulare
Aerobi
%GC content molto elevato (60-78%).
Gruppo molto diversificato al proprio interno
Generi:
•Corynebacterium
•Mycobacterium
•Frankia
•Streptomyces
•> 100 generi
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Streptomyces lavendulae
Il ciclo vitale di un attinomicete
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Actinomycete colony
Streptomyces GENOMES
S. coelicolor A3(2) S. avermitilis MA-4680
Genome size (Mb)
Number of genes
GC content (%)
Average gene length (bp)
Gene clusters for natural products
Gene clusters (% genome)
8.67
7825
72.1
991
9.02
7574
70.7
1034
22
4
25
6.4
Potentialità per la scoperta di cluster
genici nuovi o non ancora caratterizzati
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Gli Streptomyces da un punto di
vista biochimico e regolativo
Streptomiceti/Attinomiceti:
Batteri (Gram +) del suolo
(30 °C temperatura ottimale di crescita, tempo di
duplicazione circa 1 h)
Organismo multicellulare
(Uniche forme monocellulari: spore e protoplasti)
Sporigeno (su substrati solidi, spore in circa 7 gg)
Crescita come micelio in terreno liquido
Principale produttore di antibiotici
S. coelicolor
Geni regolatori:
Numero di ORF predette
S.
E.
B.
S.
coelicolor
coli
subtilis
cerevisiae
7825
4289
4099
6203
65 fattori sigma
TCRS:
85 sensor kinases
79 response regulators
“A factor”: un segnale di quorum sensing
OH
O
O
O
identificato in S. griseus
Mutanti incapaci di produrre A factor sono Spo-, StrS and StrA factor aggiunto esternamente ripristina il fenotipo originario
A factor lega il repressore ArpA, inibendone l’attività
E’ in grado di agire a concentrazioni nM
Coinvolto nella produzione di numerosi composti antimicrobici
A factor, S.
griseus
S. bikiniensis, S.
cyanofuscatus, S.
viridochromogenes
S. virginiae
g-butirrolattoni in
Streptomyces
S. bikiniensis, S. cyanofuscatus
S. virginiae
S. virginiae
S. virginiae
S. virginiae
Streptomyces sp. FRI5
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“gene clusters”
L’insieme di geni necessari alla sintesi, alla resistenza
e alla regolazione dei metaboliti secondari
dimensioni: 10-120 kb
Approccio genomico/metagenomico per l’identificazione di nuovi cluster:
Sequenziamento genomico
Come vengono prodotti i metaboliti secondari?
Per capirlo occorre identificare:
I geni coinvolti nella loro biosintesi
La loro funzione specifica
S1
In
I1
metabolite
S1
Cluster genici
L’insieme dei geni necessari per la sintesi
dei metaboliti secondari e per la loro regolazione
10-120 kb
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Meccanismi di biosintesi
Metaboliti
Primari*
Reazioni di
classe I
(sintesi)
Reazioni di
classe III
(decorazione)
*aminoacidi
*acidi carbossilici
*zuccheri
Reazioni di classe II
(modificazione)
cluster genico
(10- >120 kb)
antibiotico
NH2
O
A
OH
NH2
acido -amino adipico
-alanina
O
HO
H2N
OH
OH
H2N
H2N
O
O
O
OH
ornitina
O
H 2N
OH
OH
OH
OH
4-idrossi-fenilglicina
3,5-diidrossi-fenilglicina
glicopeptidi,
ramoplanina
B
OH
DPH
OH
O
O
O
prefenato
HpgT
Hmo
H 2N
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
HmaS
OH
O
OH
HO
O
O
O
OH
4-p-idrosssi-fenilglicina
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main classes of microbial secondary metabolites
peptides
polyketides
terpenes
oligosaccharides
Oligopeptides
ribosomal origin
lantibiotics (e.g. nisin), microcins
non ribosomal origin ß-lactams, glycopeptides, cyclosporin,
bacitracin, etc.
made by nonribosomal peptide synthetases
(NRPS)
a lantibiotic: nisin
NH2
H
N
O
O
NH
O
O
N
H
N
H
O
O
S
O
H
N
H2N
O
S
O
N
H
H
N
O
NH
O
HN
NH2
O
O
HN
N
H
O
NH
N
H
O
O
O
O
H
N
O
N
H
NH
O
N
HN
O
H
N
N
H
S
S
O
N
H
H
N
O
NH2
O
O
N
H
S
S
NH2
HN
H
N
S
O
O
NH
H
N
H
N
HN
O
O
HO
O
O
N
H
H
N
O
H
N
N
H
O
O
O
OH
N
H
O
N
N
N
N
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oligopeptides of ribosomal origin
synthesis of a prepropeptide
post-translational modifications + cleavage
Un peptide antimicrobico: la nisina
Prodotta da lactobacilli; espressione richiede alta densità cellulare
(QS) unitamente a fase stazionaria di crescita.
Spettro d’azione: Gram + (a concentrazioni nM)
Prodotta spontaneamente (o aggiunta) nella preparazione dei formaggi
Il sistema di produzione e processamento della nisina
Oltre al sistema di modificazione/esporto e di trasduzione del segnale, i
ceppi produttori di nisina posseggono geni per l’immunità
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Caratteristiche degli antibiotici
peptidici sintetizzati dal ribosoma
• Codificati da un gene come precursore
• Fungono anche da molecole segnale e
regolano l’espressione del proprio operone
• Vengono modificati post-traduzionalmente
da proteine codificate da geni presenti nello
stesso operone
• Regolano geni per l’immunità (resistenza
intrinseca)
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