RELAZIONE SCIENTIFICA ANNO 2000
UNITA’ DI RICERCA DI PARMA
Direttore: Prof. Marisa Ferrari Belicchi
L’unità di ricerca di Parma si compone di 3 gruppi che si distinguono per le proprie diverse
competenze nel campo della chimica dei sistemi biologici. L’attività di ricerca di ciascun gruppo
verrà pertanto illustrata separatamente.
1. Gruppo di ricerca della Prof. A. M. Lanfredi Manotti
(F. Ugozzoli e C. Massera)
Studio di complessi di rutenio(II) e rutenio(III) ad attività antitumorale
Il gruppo, che ha una pluriennale attività di ricerca nel campo della Strutturistica
Diffrattometrica, si occupa sia della caratterizzazione strutturale allo stato solido mediante
diffrazione di raggi-X sia dello studio delle correlazioni proprietà-struttura di complessi metallici
aventi potenziale attività antitumorale.
Negli ultimi anni, in collaborazione con il Department of Chemistry dell’ Università di
Leiden (Olanda) sono state sviluppate ricerche su complessi metallici con frammenti s-triazolici
variamente sostituiti. In particolare l’attenzione è stata rivolta a complessi di rutenio con purine
modificate, simili a derivati di rutenio ad attività anticancerogena per i quali, come riporta la
letteratura, sembrano svolgere un ruolo determinante ai fini dell’attività antiproliferativa le loro
reazioni idrolitiche di acquazione. In questa ottica la caratterizzazione di due monoacqua tricloro
complessi di rutenio(III) con leganti purinici modificati ci ha permesso di evidenziare che tali
leganti eterociclici sono in grado di finalizzare le proprietà fisiche e chimiche dei complessi
attraverso un sistema intramolecolare multiplo di legami ad idrogeno.
Essendo d’altra parte importante studiare il binding dei rutenio-complessi con basi modello
del DNA sono state studiate le proprietà del complesso di rutenio(II) α-[Ru(azpy)2(NO3)2],
(azpy=2-(fenilazo)piridina; α indica l’ isomero in cui i gruppi coordinanti ONO2, N(py), ed N(azo)
sono cis, trans e cis rispettivamente) ed il suo modo di binding a basi modello del DNA quali 9etilguanina (9egua) e guanosina (guo). I risultati sono stati anche confrontati con quelli ottenuti dal
binding di basi modello al complesso bis(bipiridil)rutenio(II). Lo studio strutturale del complesso α1
[Ru(azpy)2(NO3)2] ha permesso di interpretare gli spettri NOESY NMR dei suoi complessi con le
basi modello e quindi di determinare le orientazioni del 9egua e guo mostrando come i derivati della
guanina in complessi di azpy possono avere maggiori libertà stereospaziali che non nei complessi
[Ru(bpy)2Cl2] e che tale flussionalità e’ importante nel binding del complesso α-[Ru(azpy)2(NO3)2]
al DNA.
2. Gruppi di ricerca della Prof. Marina Cingi Biagini
a) (M. Lanfranchi, L. Marchiò, M. A. Pellinghelli, M. Tegoni)
Nuovi complessi con leganti triazolici, triazolinici e triazolidinici
I derivati ciclici della tiocarbonoidrazide rappresentano una classe di composti relativamente
poco studiata. I derivati 4-ammino-5-tiosso-s-triazolinici sono conosciuti in letteratura per la loro
capacità di complessare numerosi ioni metallici con caratteristiche soft e sono da considerarsi acidi
monoprotici. In soluzione mostrano tautomeria tione-tiolo e hanno mostrato un interessante
meccanismo di desolforazione promosso dal rame(II).
I complessi di Werner del rutenio con derivati ciclici della tiocarbonoidrazide sono una
nuova classe di composti che possono essere interessanti nello sviluppo della chimica di
coordinazione dei metalli di transizione. In tempi recenti alcuni ricercatori hanno studiato le
proprietà antitumorali di alcuni complessi di Ru(II) e Ru(III), in particolare i derivati con dmso. Dal
nostro gruppo di ricerca sono stati sintetizzati e caratterizzati, spettroscopicamente e tramite
diffrazione ai raggi X su cristallo singolo, alcuni leganti triazolici solforati e alcuni loro complessi
di Ru(II) e Ru(III). E’ stato studiato il comportamento chimico di derivati triazolici, tiodiazolici e
triazolinici della tiocarbonoidrazide verso il complesso cis-[RuCl2(dmso)4] (1). La reazione di 4ammino-5-metiltio-3-(2-piridil)-1,2,4-triazolo (L1) con 1, forma due complessi diastereomerici,
trans,cis-[RuCl2(dmso)2(L1)] (2) e il complesso chirale cis,cis-[RuCl2(dmso)2(L1)] (3).
La reazione di 1 con 2-(2-formilidrazino)-1,3,4-tiodiazolo in metanolo ha formato il
complesso trans,cis-[RuCl2(dmso)2(L2)] (4) in cui il legante L2 risulta deformilato. Il processo è
stato catalizzato da Ru(II) ma con resa molto bassa. La sintesi di complessi di Ru con 4-ammino-3metil-1,2,4-∆2-triazolina-5-tione (L3) e 4-ammino-3-etil-1,2,4-∆2-triazolina-5-tione (L4) ha rivelato
un interessante processo di ossidazione del metallo promosso da dmso. La reazione di 1 con questi
leganti in soluzione acquosa di HCl 6 M ha portato alla formazione dei complessi mer[RuCl3(dmso)(L3)]⋅½H2O
(5)
e
mer-[RuCl3(dmso)(L4)]· ½H2O
(6).
Il
complesso
mer-
[RuCl3(dmso)(L4)]· CH3COOH· H2O (7) è stato ottenuto ricristallizando 6 da etilacetato. A nostra
2
conoscenza questi complessi rappresentano il primo caso di chelazione di un sistema di tipo N-N-CS.
L3 è stato trovato agire come monodentato tramite l’atomo di zolfo o bidentato chelante
tramite lo zolfo e l’azoto amminico o tridentato chelante N,S e a ponte con l’azoto endociclico ed
infine tridentato µ3. Data la grande versatilità di L3 è stato studiato il comportamento legante di
composti simili come 4-ammino-1,2,4-∆2-triazolina-5-tione (L5) e 4-ammino-3-etil-1,2,4-∆2triazolina-5-tione (L4) rispettivamente verso Ag(I) e Cu(I). Tramite analisi di diffrazione ai raggi X
su cristallo singolo sono state determinate le strutture molecolari di [Ag(HL5)2]NO3 e
[CuCl(HL4)3]. Nel composto di argento sono presenti (evento non frequente) contemporaneamente
specie dimeriche e polimeriche e il legante mostra un nuovo modo di coordinarsi chelando N,S e
disponendosi a ponte tramite l’atomo di zolfo. Il complesso tetraedrico di rame(I) (simmetria C3) è
chirale e questo è dovuto alla disposizione elicoidale delle 3 molecole triazoliniche S-coordinate
che interagiscono tramite legami d’idrogeno con l’atomo di cloro coordinato e con disposizione
testa-coda con altri complessi formando catene che scorrono lungo c. E’ stata osservata una
risoluzione spontanea e nel cristallo analizzato sono presenti solo conformeri Λ.
I derivati ciclici della carbonoidrazide sono oggetto di studio nel campo biologico,
tecnologico e analitico, a tal fine sono state studiate le capacità complessanti di 4-ammino-1,2,4triazolidina-3,5-dione (urazina) sia come legante neutro (Hur) che monoanionico (ur) verso cationi
divalenti (Co, Ni, Cu, Zn). Sono stati sintetizzati e caratterizzati i complessi CoCl2(Hur)2.4H2O,
NiCl2(Hur)2.4H2O e Zn(SO4)(Hur).2H2O nei quali l’urazina agisce come legante neutro. Il
complesso polimerico di zinco ha dato luogo a risoluzione spontanea e nel cristallo esaminato è
presente solo l’isomero A. Partendo dal sale sodico dell’urazina sono stati sintetizzati i complessi
Co(ur)2.4H2O, NiCl(ur).H2O e CuCl(ur).2H2O. Partendo da soluzioni acquose di urazina sono stati
sintetizzati i complessi Cu3(NO)3(ur)4.6H2O, Cu(ur)2.4H2O e Cu2(SO4)(ur)2.2H2O. Di questi ultimi
tre complessi e di CoCl2(Hur)2.4H2O e Zn(SO4)(Hur).2H2O sono state determinate le strutture
cristalline ai raggi X. In questi composti Hur agisce solo come chelante N,O mentre ur nei
complessi di rame esaminati agisce o come monodentato tramite l’azoto endociclico deprotonato o
come tridentato o come tetradentato mostrando una grande versatilità.
b) (F. Dallavalle, M. Tegoni)
Equilibri di formazione di complessi ternari di Cu(II) con acidi (S)-amminoidrossammici e D- o
L-amminoacidi in soluzione
3
Gli acidi amminoidrossammici e più in generale leganti idrossammici variamente
funzionalizzati sono oggetto di studio sia in campo chimico che biologico, specialmente per il ruolo
che rivestono nell’accumulo e nel trasporto di ioni metallici negli organismi viventi. E’ ben noto il
caso del sideroforo naturale Desferossiammina B, impiegato nel trattamento di pazienti betatalassemici come sequestrante specifico per ferro(III). Inoltre, alcuni acidi idrossammici e
amminoidrossammici presentano la capacità di funzionare come inibitori enzimatici mediante un
meccanismo che sembra coinvolgere la chelazione di questi leganti con gli ioni metallici dei
metalloenzimi, anche se sono stati scarsamente studiati i complessi ternari che questi leganti
formano con ioni metallici di transizione e amminoacidi.
Nell’ambito della ricerca riguardante la stereoselettività termodinamica nella formazione di
complessi ternari di ioni bi- e trivalenti con leganti chirali ammino-idrossammici e D- o Lamminoacidi in soluzione è stato preso in esame il sistema Cu2+/ acido (S)-triptofanoidrossammico /
D- o L-amminoacido (Pro, Phe, Trp).
Gli equilibri di protonazione e di complesso-formazione sono stati studiati in soluzione
acquosa mediante potenziometria con elettrodo a vetro e spettrofotometria di assorbimento nel
visibile.
E’ noto che le specie formate da Cu(II) con acidi α-amminoidrossammici (HL) sono [CuL]+,
[Cu2L2H-1]+, [CuL2], [CuL2H-1]-. Lo studio degli equilibri del sistema Cu(II) / acido (S)triptofanoidrossammico (Trpha, HL) è risultato complicato a causa della insolubilità della specie
[Cu2L2H-1]+ che precipita nella zona di pH 4-6 per poi trasformarsi completamente nella specie
solubile [CuL2] e quest’ultima nella specie [CuL2H-1]-.
Per superare questa difficoltà si è scelto un legante competitore di Trpha abbastanza forte,
quale EDTA, in grado di ridurre la concentrazione del complesso insolubile così da evitarne la
precipitazione anche a concentrazioni di metallo non troppo basse, ma con una scarsa tendenza a
formare complessi ternari con Trpha.
I valori delle costanti globali di protonazione e di complessazione (log β, βpqr =
[CupLqHr]/[Cu]p[L]q[H]r a T = 25 ° C e I = 0.1 M (KCl)) sono risultati:
HL
9.13(1)
H2L+
[CuL]+
[Cu2L2H-1]+
[CuL2]
16.16(1)
10.62(4)
20.68(6)
20.53(2)
[CuL2H-1]10.37(2)
I complessi sono stati caratterizzati mediante spettroscopia di assorbimento nel visibile
calcolando i parametri di λmax/ε che sono risultati in buon accordo con quelli già noti per altri
amminoidrossammati. In particolare è stato possibile confermare che la specie [CuL2H-1]- non è un
4
idrossocomplesso ([CuL2(OH)]-), ma contiene il gruppo idrossammico deprotonato anche
all’ossigeno.
Nell’ipotesi che in questi complessi lo ione Cu2+ presenti sempre una geometria ottaedrica
distorta, con due molecole di acqua assiali, si sono calcolati i contributi al campo dei leganti da
parte degli atomi di azoto del gruppo idrossammato (0.479(5) µm-1) e idrossammato deprotonato
anche all’ossigeno (0.623(12) µm-1) secondo il modello di Billo.
Per valutare l’eventuale presenza di stereoselettività termodinamica nella formazione di
specie ternarie con D- o L-amminoacidi, sono stati scelti prolina, fenilalanina e triptofano, cioè
quegli amminoacidi che avevano in precedenza mostrato le maggiori stereoselettività in analoghi
sistemi con leganti (S)-ammino-ammidici.
Rapporti favorevoli alla formazione della massima quantità delle specie miste (Cu:L:A =
1:1:1 o 1:1:2, HA = amminoacido) non sono risultati praticabili a causa della insolubilità del
complesso dinucleare [Cu2L2H-1]+, quindi per evitarne la precipitazione si è dovuto operare in
presenza di un forte eccesso di amminoacido (Cu/A da 1:15 a 1:30). Le specie ternarie individuate
sono [CuLA] e [CuLH-1A]- e i corrispondenti valori di log β sono risultati:
Pro
D
Phe
L
D
Trp
L
D
L
[CuLA]
18.67(2)
18.80(1)
18.01(3)
17.94(2)
18.46(4)
18.35(3)
[CuLH-1A]
9.22(1)
9.12(1)
8.02(5)
8.30(3)
8.25(5)
8.07(4)
La stereoselettività nella formazione dei complessi ternari è stata espressa come ∆log β =
log βSR – log βSS . I valori ottenuti sono i seguenti:
Pro
Phe
Trp
-0.13(2)
+0.07(4)
+0.11(5)
[CuLH-1A] +0.10(1)
-0.28(6)
+0.18(6)
[CuLA]
-
Si può considerare significativa la stereoselettività presentata da entrambi i complessi
contenenti prolina e quella del complesso [CuLAH-1]- con fenilalanina. Comunque, l’entità di
5
questa stereoselettvità è minore di quella ottenuta in precedenza con l’analogo legante (S)triptofanammide.
La stereoselettività osservata è attribuibile a interazioni steriche tra i due residui amminoacidici
sulla base di modelli molecolari.
3. Gruppo di ricerca della Prof. M. Ferrari Belicchi
(F.Bisceglie, G.Pelosi, P.Tarasconi, R.Albertini, S.Pinelli)
Relazione struttura-attività biologica di nuovi complessi con tiosemicarbazoni aromatici
E' proseguita la nostra attività di ricerca basata su sintesi, caratterizzazione e valutazione di
alcune proprietà biologiche di complessi di interesse farmacologico, non analoghi al cis-platino,
contenenti il frammento tiosemicarbazonico con sostituenti di diverso ingombro e natura sugli
atomi di azoto amminico ed idrazinico, con lo scopo di confrontare le caratteristiche geometriche e
gli effetti biologici con quelli dei corrispondenti composti senza sostituenti sulla catena
tiosemicarbazonica.
In particolare i leganti aromatici precedentemente caratterizzati, Me-H3ut e Me2-H3ut (4metil e 4,4-dimetiltiosemicarbazide), ottenuti condensando il 5-formiluracile con tiosemicarbazidi
sostituite, sono stati fatti reagire con sali di rame variando anche il controione inorganico. Sono stati
isolati in forma cristallina e caratterizzati anche mediante diffrazione ai raggi X i complessi
[Cu(Me-H3ut)Cl2].H2O 1 [Cu(Me2-H3ut)Cl2].H2O 2 e [Cu(Me-H3ut)(NO3)(OH2)2]NO3 3. Si è
potuto osservare che nè il differente tipo di controione nè il numero diverso di sostituenti ha
influenzato la deprotonazione del legante che in tutti i complessi è presente in forma neutra. In
entrambi i complessi derivati dal cloruro rameico la coordinazione risulta quadrata piramidale (4+1)
ed implica tre atomi donatori SNO del legante ed un atomo di cloro nel piano di base. L'apice della
piramide è occupato dal secondo atomo di cloro con distanze molto più lunghe rispetto a quelle nel
piano di base in analogia con quanto rilevato in analoghi complessi di rame con il tiosemicarbazone
dell'uracile non sostituito studiati in precedenza. La struttura del composto 3 è costituita da cationi
complessi [Cu(Me-H3ut)(NO3)(OH2)2]+ e anioni nitrato. La geometria di coordinazione (4+2) è
una bipiramide allungata con gli atomi SNO del tiosemicarbazone neutro tridentato e una molecola
d'acqua nel piano di base, mentre le posizioni apicali sono occupate dall'ossigno dell'altra molecola
di acqua e dall'atomo O3 del gruppo nitrato monodentato più debolmente legati all'atomo di rame.
Legami di idrogeno tra O1W e O2W e gli atomi di ossigeno O4 ed O5 del gruppo nitrato coordinato
di una molecola in posizione x, y, z+1 creano catene di poliedri che si sviluppano nella direzione
dell'asse
z.
Il
corrispondente
complesso
con
il
legante
non
sostituito
di
formula
6
[Cu(H3ut)(OH2)2](NO3)2.H2O presenta invece geometria di coordinazione piramidale quadrata
(4+1) e i nitrati sono entrambi ionici. Legami di idrogeno tra le molecole d'acqua coordinate
appartenenti a poliedri centrosimmetrici determinano la formazione di dimeri.
Sui leganti ed i relativi complessi sono stati effettuati saggi biologici, in particolare prove di
inibizione della proliferazione cellulare, su linee cellulari leucemiche umane U937 in
collaborazione con l'Istituto di Patologia Speciale Medica dell'Università di Parma. Il legante libero
H3ut, sciolto in DMSO e addizionato al mezzo di cultura, immediatamente precipita, pertanto non è
stato possibile valutare la sua attività biologica. Entrambi i leganti, con uno o due gruppi metile
sull'azoto amminico Me-H3ut e Me2-H3ut, non inibiscono la proliferazione cellulare. Per quanto
riguarda i complessi è stato fatto un confronto della loro attività di inibizione con quella dei
corrispondenti
complessi
con
il
legante
non
[Cu(H3ut)Cl2].2H2O
sostituito
4
e
[Cu(H3ut)(OH2)2](NO3)2.H2O 5. Mentre i complessi 1, 2 e 3 non inibiscono la proliferazione,
entrambi i complessi con il legante H3ut presentano una inibizione maggiore del 50% della crescita
cellulare ad una concentrazione rispettivamente di 40 µg/ml per il cloruro e di 35 µg/ml per il
nitrato.
I N I B I Z I O N E D E L L A P R O L I F E R A Z I O N E C E L L U L A R E S U L L A L I N E A L E U C E M IC A U M A N A U 9 3 7
300
4
x 10 cells/ml
250
200
150
100
50
0
CTR
M e - H 3u t
M e 2- H 3 u t
1
2
3
4
5
Per questi composti attivi si è eseguito anche il saggio sulla linea cellulare leucemica CEM e
si è osservata una analoga attività, per il nitrato complesso già alla concentrazione di 30 µg/ml.
Questi risultati suggeriscono che il gruppo amminico terminale non sostituito sembra avere un ruolo
rilevante nel determinare un effetto di inibizione che però non si verifica attraverso un meccanismo
apoptotico.
In parallelo seguendo sempre un procedimento di screening, per valutare una possibile
attività biologica anche di leganti potenzialmente SN bidentati, sono stati sintetizzati diversi
tiosemicarbazoni di aldeidi naturali tra i quali il tiosemicarbazone del citronellale che, alla
concentrazione di 10 µg /ml inibisce del 75% la proliferazione cellulare ed è anche in grado di
indurre apoptosi sulla linea cellulare leucemica umana U937. Sulla base dei risultati ottenuti sono
stati studiati nuovi tiosemicarbazoni SN bidentati, aventi differente carattere idrofilo-lipofilo,
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derivati dalla condensazione della p-fluorobenzaldeide con tiosemicarbazidi variamente sostituite
con gruppi alifatici ed aromatici e sono stati caratterizzati per mezzo di spettroscopia IR ed NMR. Il
tiosemicarbazone della p-fluorobenzaldeide (Hfbt) ed il 4-feniltiosemicarbazone della pfluorobenzaldeide (Ph-Hfbt) sono stati anche caratterizzati mediante diffrazione ai raggi X. Per
verificare l'effetto della chelazione metallica sulle proprietà biologiche è stato pure studiato il
complesso di nichelio [Ni(fbt)2], tenendo presente che, pur essendo nota l'essenziale presenza di
questo metallo in enzimi batterici, non è ancora chiaro il ruolo che esso ha come elemento in tracce
negli esseri umani. I saggi biologici sulla linea cellulare U937 hanno evidenziato che il legante Hfbt
inibisce la proliferazione cellulare del 50% ad una concentrazione di 50 µg/ml, il legante, Ph-Hfbt
più attivo, inibisce del 50% già ad una concentrazione di 10 µg/ml, il complesso [Ni(fbt)2] a 30
µg/ml inibisce del 75%. Queste concentrazioni corrispondono alla massima inibizione senza
osservare effetto citotossico sulle cellule. Nessuno di questi composti è in grado di indurre apoptosi.
Anche il complesso di nichelio, che è costituito da molecole neutre [Ni(fbt)2], con il metallo su un
centro di simmetria, e presenta una coordinazione quadrata planare con i due leganti SN bidentati in
posizione trans non induce apoptosi. Questo indica che l'incompleta saturazione delle posizioni di
coordinazione osservata in complessi di rame studiati in precedenza è una condizione necessaria,
ma non sufficiente per rendere attivo il composto riguardo il meccanismo di apoptosi.
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