Espressione genica, proteine, enzimi

ESPRESSIONE GENICA,
PROTEINE,
ENZIMI
PRINCIPALI COMPARTIMENTI della CELLULA ANIMALE
LA MEMBRANA PLASMATICA
costituisce e delimita la superficie esterna della cellula. !
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è contenuto fra la membrana citoplasmatica e il nucleo. IL CITOPLASMA
La porzione fluida è detta citosol: al suo interno sono presenti vari tipi di organuli, ed è la sede della sintesi proteica
!
!
è l’organulo in cui è contenuto il DNA e in cui avviene la trascrizione del IL NUCLEO
mRNA
LA CELLULA ANIMALE
Perossisoma
Mitocondrio
Reticolo endoplasmatico liscio
Nucleo
Lisosoma
Ribosoma (polisomi)
Apparati di Golgi
Reticolo endoplasmatico ruvido (RER)
Endosoma
L’ESPRESSIONE GENICA
L’ESPRESSIONE GENICA dogma DNA -­‐ proteina
GENOMA (DNA)
Nucleo
mRNA
Citosol
PROTEINE
Codone Start
start
RNA Polimerasi
Filamento di DNA Filamento singolo mRNA
Interazioni elettrostatiche
(gene)
Sequenza di triplette nucleotidiche
Codone stop
Catena polipeptidica
L’ESPRESSIONE GENICA trascrizione e traduzione
Trascrizione
Durante la trascrizione il DNA viene usato come stampo per la formazione dell’RNA messaggero (mRNA)
Trascritto di mRNA
Filamento antisenso
Amminoacido
Catena 3’
nascente polipeptidica
Legame Complesso RNA Polimerasi
tRNA
peptidico
Filamento senso
Traduzione
Codone-­‐anticodone
mRNA
Durante la traduzione, l’mRNA dirige la sequenza degli amminoacidi del polipeptide che deve essere costruito
Ribosoma
LA TRADUZIONE i ribosomi
RER
Polisomi
Limite risolutivo del microscopio elettronico: 2 nm
Cristallografia NMR: risoluzione a livello atomico !
(Angstrom, A = 0.1 nm)
LA SINTESI PROTEICA ribosoma -­‐tRNA -­‐ mRNA -­‐ polipeptide
Polisoma
I ribosomi hanno un sito di legame per l’mRNA e tre siti di legame per il tRNA. Quando un ribosoma si sposta lungo una molecola di mRNA, il polipeptide in formazione si allunga di un amminoacido alla volta. Molti ribosomi sono associati e in fase di traduzione dello stesso mRNA. L’intero complesso di traduzione è detto polisoma. LA SINTESI PROTEICA fasi della traduzione
1. Inizio
L’inizio è la fase che mette insieme tutti i componenti necessari alla traduzione. Il codone di inizio è AUG. Ogni ribosoma ha 3 siti di attacco per i tRNA: sito E (da exit), sito P (da peptide) e sito A (da amminoacido). Il primo tRNA-­‐amminoacido entra nel sito A ed il legame peptidico si compie nel sito P.
2. Allungamento
Ogni volta che un tRNA-­‐amminoacido si aggancia al sito A, il peptide in via di formazione sarà trasferito a questo tRNA-­‐amminoacido. In seguito alla traslocazione l’mRNA si sposta in avanti, in modo che il tRNA che porta agganciato il peptide si trovi ora al sito P del ribosoma. Infine, il tRNA usato fuoriesce dal sito E.
3. Terminazione
Il processo di allungamento e traslocazione si ripete più volte, con il tRNA usato che fuoriesce dal sito E mentre sul sito A si aggancia un nuovo codone, pronto a ricevere un altro tRNA-­‐amminoacido. Quando il ribosoma raggiunge un codone di terminazione (STOP), la traduzione si conclude con la fase terminazione, in cui il polipeptide viene rilasciato. MODELLINO DI TRADUZIONE codone e anticodone
tRNA trasferisce gli amminoacidi che si trovano nel citoplasma ai ribosomi, dove l’mRNA viene trasformato nella sequenza di amminoacidi che corrisponde a una determinata proteina
Traduzione nei ribosomi
mRNA
Catena polipeptidica
+
NH3
Amminoacido
H
A
U
R
C
(Metionina)
Metionina
0
C
G
H2O
H
Peptide
0
C
A
R
A
(Metionina)
U
C
O
A
-
N
G
+
NH3
G
Leucina
H
0
STOP
H
R
C
(Leucina)
C
O
-
IL CODICE GENETICO gli amminoacidi
Codone - Amminoacido
La sequenza di nucleotidi del DNA (il codice genetico) specifica l’ordine degli amminoacidi di un polipeptide. !
Il codice genetico è basato su una tripletta di basi, ossia un codone (contenuto nel mRNA), che è una sequenza precisa di tre basi nucleotidiche indicate da tre lettere, per esempio UUU, e corrisponde a un amminoacido (fenilalanina). !
Il codone di inizio (start) è AUG e codifica anche per l’amminoacido metionina !
Metionina
Il codice genetico è degenerato: più codini codificano per lo stesso amminoacido !
Il codice genetico è universale
LE MUTAZIONI cambiamento della funzione proteica
Mutazione nucleotidica
Una mutazione genica è un cambiamento permanente nella sequenza di basi del DNA. Le mutazioni possono alterare l’espressione genica.
Mutazione germinale
Le mutazioni germinali avvengono nelle cellule sessuali e possono essere trasmesse alla generazione successiva attraverso la riproduzione.
Mutazione somatiche
Le mutazioni somatiche avvengono nelle cellule del corpo e non vengono trasmesse alla progenie.
Mutazione di sfasamento Le mutazioni di sfasamento avvengono soprattutto per inserzione o delezione di uno o più nucleotidi nel DNA.
Mutazione puntiformi
Le mutazioni puntiformi rappresentano il cambiamento di un singolo nucleotide nel DNA di un gene, di conseguenza producono il cambiamento in uno specifico codone.
A T A
A T C
G T A
DNA (gene)
U A U
U A G
C A U
mRNA (codificante)
Tirosina Codone STOP Istidina (proteina normale)
(proteina tronca)
(proteina alterata)
Le mutazioni sono spontanee o indotte da agenti mutageni, fissate della RNA Polimerasi e trasmesse dal mRNA. Una mutazione in un gene è rilevante quando altera la funzione della proteina codificata dal gene. Le mutazioni sono particolarmente rilevanti se avvengono nella porzione genica che codifica il domino catalitico di un enzima
LE PROTEINE
LE PROTEINE struttura funzionale
Struttura Terziaria delle proteine
Legame idrogeno
Gruppo eme
Interazioni alfa elica
idrofobiche
Struttura terziaria
alfa elica
Catena polipeptidica
Struttura primaria
Legami idrogeno
Ponti disolfuro
Struttura secondaria
Struttura quaternaria
Legami ionici
Struttura quaternaria dell’emoglobina
LE PROTEINE funzione e tipologia
Le proteine rappresentano l’aspetto funzionale dell’espressione genica e concorrono a tutti i processi principali della cellula e alla costituzione di tessuti ed organi
Proteine strutturali
Sono fondamentali per l’integrità dei tessuti, come per esempio la cheratina dei capelli, delle unghie e dello strato corneo della cute; il collagene e l’elastina, che formano tessuto connettivo sottocutaneo.
Proteine contrattili
L’actina e la miosina sono le principali proteine contrattili della cellula muscolare; sono presenti anche in tutti gli altri tipi cellulari dove costituiscono il citischeletro (actina) e regolano il movimento degli organuli cellulari e della cellula stessa.
Ormoni
Alcuni ormoni sono piccoli peptidi secreti da cellule specializzate e rilasciati nel flusso sanguino per regolare a distanza l’azione degli organi e tessuti. Gli ormoni della crescita sono in genere peptidi.
Immunitaria
Gli anticorpi sono proteine particolarmente complesse in grado di riconoscere, in seguito a legame, selettivo molecole (antigeni) estranei e innescare la risposta immunitaria.
Enzimi
Sono proteine estremamente specializzate dotate di azione catalitica (sito attivo) che servono a tutte le funzioni metaboliche ed energetiche della cellula. Gli enzimi partecipano alla sintesi delle nuove molecole e delle proteine. Molti bersagli farmacologici sono enzimi.
LE PROTEINE saggi colorimetrici di rilevazione
Coomassie Brilliant Blue
Fenilalanina
Tirosina
Triptofano
Il colore del Blue di Coomassie dipende dall’acidità della soluzione: a PH molto acidi (<2) il colore è rosso per passare al marrone ed al blu a PH maggiori.
I cambiamenti di colore del Blue di Coomassie sono dovuti ai differenti stati di carica delle molecola: nella forma rossa gli atomi di azoto sono carichi positivamente; a PH 7 la molecola assume una carica netta negativa e il colore vira al blu.
Il Blue di Coomassie lega le proteine formando dei complessi che caricano negativamente la molecola producendo il colore blue. In soluzione, l’intensità del blu corrisponde alla concentrazione delle proteine. SEPARAZIONE delle PROTEINE metodi analitici Centrifugazione
Permette di separare i vari componenti cellulari in fase liquida grazie alla notevole accelerazione applicata. Le proteine rimangono sciolte nella fase acquosa mentre sono poco solubili in solventi organici come l’etanolo o l’acetone. Il principio si basa sul fatto che l’acqua (carica negativamente) mantiene in soluzione le proteine minimizzando le interazioni elettrostatiche.
Cromatografia
su strato sottile
Permette di separare le proteine in soluzione attraverso il passaggio in una matrice assorbente (fase stazionaria). Il principio frutta il fatto che proteine sciolte in un solvente che viene assorbito dalla fase stazionaria sono separate in base alla loro dimensione.
Campo
elettroforetico
Le proteine vengono denaturate e dotate di una totale carica negativa mediante l’utilizzo di composti intercalanti. In un campo elettrico applicato migreranno verso il polo positivo esclusivamente in base alla lunghezza della catena polipeptidica (proteine più grandi migreranno più lentamente).
SEPARAZIONE delle PROTEINE cromatografia su carta
La cromatografia è una tecnica semplice utilizzata per la separazione di una miscela di soluti, sfruttando la differente velocità di spostamento dei singoli soluti in seno ad un mezzo poroso, sotto l’azione di un solvente.
La carta assorbe per capillarità: il principio si basa sull’interazione tra le molecole del liquido e del solido; forze di adesione tra l'acqua e la cellulosa della carta sono maggiori delle forze di coesione tra le molecole d'acqua stesse.
Principio della cromatografia su carta
Separazione dei pigmenti vegetali
GLI ENZIMI
GLI ENZIMI meccanismo di azione
Gli enzimi rendono possibile la realizzazione di molti processi cellulari (come la sintesi di molecole e proteine) abbassando l’energia di attivazione necessaria al compimento di una reazione biochimica
Inibitore allosterico
Agonista
Inibitore competitivo
Tasca allosterica
Sito attivo
Enzima + Substrato
Complesso enzima-substrato
(cambio conformazionale)
Enzima + Prodotto
LE PROTEINE della BOCCA l’azione dell’amilasi
Proteine batteriche
Proteine della mucosa (epiteliali): cheratina
Immunoglobuline
Enzimi digestivi
Poli-Glucosio
Alfa-Amilasi (glicogenasi)
(amilosio)
Glucosio
Maltosio
H2O
Idrolisi
Cloro
Calcio
Acido dinitrosalicilico
H2O