Prof. Maria Nicola GADALETA
E-mail: [email protected]
Facoltà di Scienze Biotecnologiche
Corso di Laurea in
Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche
Biochimica e Biotecnologie Biochimiche
DISPENSA N. 11
MIOGLOBINA ED EMOGLOBINA :
CINETICA DI DISSOCIAZIONE DI O2
EFFETTORI ALLOSTERICI
EFFETTO BOHR
INTERAZIONI PROTEINA : LIGANDO
• Proteine: molecole flessibili: subiscono modificazioni della loro conformazione
(NMR)
• Queste modificazioni sono fisiologicamente importanti: da esse deriva la
funzionalità della proteina (es. l’emoglobina “respira”)
• Queste modificazioni sono spesso indotte (induced fit o adattamento indotto) dalla
loro interazione con altre molecole piccole (es. O2, S, ATP) o grandi (es. altre
proteine) che prendono il nome di LIGANDI
• Interazioni proteina–ligando: reversibili, di natura transitoria, permettono risposte
rapide a variazioni ambientali e metaboliche: sono regolate
• Interazioni proteina-ligando: specifiche, la proteina discrimina tra le migliaia di
molecole o viceversa: Siti # per Ligandi #
• Sito di legame del ligando: regione circoscritta della proteina, complementare al
ligando per dimensione, forma, carica, natura idrofilica e/o idofobica
• Una proteina può avere: più siti per lo stesso ligando o più siti per ligandi diversi
M.N. Gadaleta
Ligando della mioglobina (Mb) è l’O2 : L = O2
ma O2 è un gas quindi [L] = pO2 in mmHg (Torr) o kPa (1 mm Hg = 0,13 KPa)
Equilibrio di dissociazione: MbO2
[Mb] [O2]
Kd = -------------- [1]
[MbO2]
quando [Mb] = [MbO2]
Mb + O2
[MbO2]
siti occupati
θ = ------------------ = ----------------- [2]
siti totali
(o y) [Mb]+[MbO2]
0≤θ≤1
0≤Y≤1
Kd = [O2] e θ = 0.5
Combinando [1] e [2] si ottiene:
pO2
θ = ----------- [3]
(y) pO2 + Kd
θ = funzione iperbolica di pO2 (vedi fig. 7.4b)
Kd = P50 esprime la pressione parziale di O2 quando Mb = MbO2 e quindi Mb è
saturata al 50%
M.N. Gadaleta
da: Nelson & Cox
0,13 kPa*
* Per kPa vedi Appendice A di Nelson & Cox
M.N. Gadaleta
y
1.0
0.9
CURVE DI DISSOCIAZIONE
0.8
dell’O2 della mioglobina (iperbolica)
0.7
e dell’emoglobina (sigmoide).
0.6
Mioglobina
Emoglobina
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
10
1
20
30
40
50
26
pO2 mmHg
M.N. Gadaleta
LA CURVA DI DISSOCIAZIONE DELLA MIOGLOBINA HA FORMA DI
IPERBOLE, QUELLA DELLA EMOGLOBINA E’ SIGMOIDE. QUESTO
COMPORTA CHE LA MIOGLOBINA HA UNA MAGGIORE AFFINITA’
PER O2:
a valori uguali di pO2 i valori di y sono più alti per la MIOGLOBINA
Affinità espressa da P50 a pH 7.2:
MIOGLOBINA
P50 =1 mmHg
EMOGLOBINA
P50 = 26 mmHg
cinetica sigmoide descritta da Hb→ particolarmente adatta al ruolo di
trasportatore di O2 nel sangue .
M.N. Gadaleta
CURVA DI DISSOCIAZIONE DELL’O2 DALL’EMOGLOBINA =
OTTIMIZZAZIONE DELLA FUNZIONE
Y
(θ)
1.0
0.5
P50=26
0
20
40
60
80
100
pO2 mmHg
pO2
nei capillari
dei muscoli
in attività
pO2
negli alveoli
polmonari
In condizioni fisiologiche la P50
dell’emoglobina è 26, valore
compreso tra pO2 in tessuti
periferici in attività (20 mm di Hg)
e pO2 in alveoli polmonari (100 mm
di Hg).
Importante la pendenza della curva
nel tratto rettilineo: questa pendenza
fa si che per piccole variazioni di δx
(ossia di pO2) si abbiano grandi
variazioni di δy (ossia di affinità di
Hb per O2).
Il tratto rettilineo della curva
corrisponde alla variazione di pO2
che si ha a livello dei tessuti
periferici dove la maggior parte di
O2 deve essere rilasciato.
M.N. Gadaleta
EQUAZIONE DI HILL
pO2
y = -----------------pO2 + P50
(3)
grafico IPERBOLE
È utile ricavare una relazione che dia come grafico una retta,
facendo il reciproco della (3)
y
pO2
------- = ------1-y
P50
da cui ricavando il log di entrambi i termini
y
log ------- = log pO2 – log P50
1-y
y = mx + q
si ha l’equazione di una retta con pendenza = 1
La relazione (3) non può descrivere il comportamento dell’emoglobina la cui cinetica
di legame all’O2 è descritta da una curva sigmoide e non iperbolica.
M.N. Gadaleta
E’ stato visto che se si considera l’equilibrio di dissociazione dell’emoglobina in un
sistema improbabile in cui le uniche specie presenti siano la deossiemoglobina e
l’emoglobina con 4 molecole di O2 l’equilibrio è:
Hb (O2)4
Hb + 4O2
da cui
[Hb] [O2]4
KD = -----------------[Hb (O2)4]
e
(pO2)4
Y = -----------------(pO2)4 + (P50)4
da questa relazione si ottiene una curva sigmoide molto più ripida di quella
descritta dall’emoglobina.
M.N. Gadaleta
Nel 1913 Hill ha dimostrato che la curva di dissociazione della Hb è in accordo con
l’equazione che deriva dall’equilibrio ipotetico
Hb(O2)n
in questo caso
Hb + nO2
(pO2)n
y = -----------------(pO2)n + (P50)n
y
che si può scrivere anche come
ponendo in grafico i valori log pO2 e
n
------- = ------1-y
e ricavando il logaritmo
y
log ------- = n log pO2 – n log P50
1-y
pO2
P50
y= mx + q
y
log ------- si può disegnare la retta
1-y
e ricavare la pendenza della retta = n
nH coefficiente di Hill = esprime il grado di cooperatività di una molecola
M.N. Gadaleta
da: Voet & Voet
M.N. Gadaleta
Diagarmma di Hill
Y
log ------1-Y
per il legame di O2 alla mioglobina ed emoglobina
0
log pO2
Per la mioglobina nH=1.0 → le molecole di O2 si legano
indipendentemente l’una dall’altra
Per la emoglobina nH=2.8 → valore intermedio tra 1 e 4 che
indica l’effetto cooperativo massimo di Hb
M.N. Gadaleta
A differenza della mioglobina:
L’EMOGLOBINA E’ UNA PROTEINA ALLOSTERICA:
allosterico: da “allos” = altro
è cioè regolata da piccole molecole che si legano a siti
diversi dal sito di legame del substrato (O2);
effettori omotropi ed eterotropi;effetto cooperativo.
ciò è dimostrato da:
1) curva di dissociazione in funzione di pO2
MIOGLOBINA → iperbolica;
EMOGLOBINA → sigmoide
Sigmoide → legame dell’O2 a Hb è COOPERATIVO
O2 EFFETTORE ALLOSTERICO OMOTROPO POSITIVO di Hb
2)Regolazione da effettori allosterici eterotropi :
⇒ affinità per O2 dipende da 2-3 DPG, da pH e [CO2]
MIOGLOBINA → NO ;
EMOGLOBINA → SI
M.N. Gadaleta
DPG , H+ , CO2 : EFFETTORI ALLOSTERICI ETEROTROPI NEGATIVI
da: Nelson & Cox
13kPa = 100 mm Hg
4 kPa = 31,1 mm Hg = muscolo a riposo
2,6 kPa = 20 mm Hg = muscolo in attività
M.N. Gadaleta
Il legame cooperativo dell’emoglobina con l’O2 la rende capace di rilasciare il
doppio dell’O2 che rilascerebbe se i suoi siti fossero indipendenti: rende
l’emoglobina un trasportatore più efficiente.
Esempio specifico:
1)
pO2 muscolo = 20 mm Hg
pO2 alveoli = 100 mm Hg
P50
= 26 mm Hg
n = 2.8
y alveoli = 0.98
y muscoli = 0.32
∆Y = 0.66
(pO2)2.8
y = ----------------------(pO2)2.8 + (P50)2.8
2)
pO2 muscolo = 20 mm Hg
pO2 alveoli = 100 mm Hg
P50
= 26 mm Hg
n=1
y alveoli = 0.79
y muscoli = 0.43
∆y = 0.36
pO2
y = -------------pO2 + P50
M.N. Gadaleta
H+ e CO2: effettori eterotropi negativi di Hb
Nel muscolo che lavora (tessuto periferico) si producono:
per la glicolisi aerobia : CO2
per la glicolisi anaerobia : acido lattico
L’acido lattico è dissociato: CH3CH2OHCOO- H+
H+ aumenta; il pH ambientale diminuisce: questo fa diminuire
l’affinità di Hb per O2 e favorisce la dissociazione di O2 da Hb O2.
Anche l’aumento di CO2 : diminuisce l’affinità di Hb per O2 e
favorisce la dissociazione di O2 da HbO2
M.N. Gadaleta
1) L’affinità di Hb per O2 dipende dal pH e da CO2
Il pH del sangue nei polmoni è 7.6 e nei tessuti scende a 7.2
Le misure sperimentali di legame dell’ossigeno all’emoglobina
sono spesso effettuate a pH 7.4
M.N. Gadaleta
L’acidità aumenta il rilascio di O2 dall’emoglobina:
la diminuita affinità di Hb per O2 in seguito all’ abbassamento di pH si esprime
cineticamente con lo spostamento della sigmoide verso destra e con l’ aumento
della pendenza del suo tratto rettilineo.
(mm Hg)
M.N. Gadaleta
Alte [CO2] e [H+] sono caratteristiche dei tessuti ad elevato metabolismo come il
muscolo che si contrae
Es.Tessuto muscolare a riposo
Es.Tessuto muscolare in attività
66
%
Quando
l’emoglobina
raggiunge una regione a
pH più basso rispetto a
quello
dei
polmoni,
la sua tendenza a
rilasciare
ossigeno,
imputabile alla minore
pO2 locale , aumenta.
A) Nei tessuti periferici una diminuzione del pH da 7,4 (curva
rossa) a 7,2 (curva blu) determina il rilascio di O2 nei capillari.
Anche l’aumento della pressione parziale di CO2 da 0 a 40 mmHg
(curva viola) favorisce il rilascio di O2.
M.N. Gadaleta
B) Nei capillari alveolari si ha l’effetto opposto:
• l’aumento di [O2] fa staccare H+ e CO2.
L’insieme di A) e B) si chiama EFFETTO BOHR
da: Stryer
M.N. Gadaleta
Hb TRASPORTA CO2 ,COME?
RESPIRAZIONE: per ogni O2 consumata → 0.8 CO2 prodotta
Due meccanismi di trasporto:
a) la CO2 è trasportata dalla Hb sotto forma di CARBAMMATO
- i gruppi α-aminici privi di carica (25% a pH 7.4) delle catene β sono in
grado di reagire reversibilmente con la CO2
R-NH2 + CO2
R-NHCOO- + H+
I carbammati formano legami salini che ulteriormente stabilizzano la
forma T
⇒ Il legame con la CO2 abbassa l’affinità di Hb per O2, viceversa la CO2 si
lega più fortemente alla deossiemoglobina che alla ossiemoglobina
M.N. Gadaleta
b) la maggior parte della CO2 è trasformata in bicarbonato all’interno dei globuli
rossi da un enzima: l’Anidrasi Carbonica (E)
E
CO2 + H2O
HCO3- + H+
La maggior parte degli H+ che si formano è legato dalla deossiemoglobina.
Il pka di alcuni gruppi deve aumentare (diventano più basici) nel passaggio da ossi
a deossi Hb per permettere il legame con H+.
Questo legame contribuisce a tamponare il pH dei tessuti metabolicamente attivi.
M.N. Gadaleta
Basi chimiche dell’ effetto Bohr
Nella deossiemoglobina, qui rappresentata, tre residui amminoacidici formano due
ponti salini che stabilizzano la struttura quaternaria T. La formazione di uno dei due
ponti salini dipende dalla presenza di un protone addizionale sull’istidina β 146. La
prossimità della carica negativa sull’aspartato 94 favorisce la protonazione
dell’istidina β 146 nella deossiemoglobina.
M.N. Gadaleta
Ricordiamo i legami salini che irrigidiscono e rendono più compatta la forma T :
8 legami di cui
- 4 coinvolgono i gruppi COO- terminali:
2 intercatena e 2 intracatena
Figura 7.9 (b)
M.N. Gadaleta
2) L’affinità di Hb per O2 dipende da DPG (polifosfato organico)
L’affinità dell’Hb per l’O2 all’interno del globulo rosso è molto minore di quella
dell’Hb in soluzione.
Nell’uomo e in molte altre specie nei globuli rossi il DPG è presente ad una [ ]
molare molto simile alla [Hb].
1.0
- DPG
y
+ DPG
0.5
0
20
40
- DPG
P50 = 1 mm Hg
+ DPG
P50 = 26 mm Hg
60 80 100
pO2 mmHg
M.N. Gadaleta
Ha una enorme importanza fisiologica:
in sua assenza l’Hb rilascerebbe pochissimo
O2 ai tessuti dove pO2 = 20 mm Hg
2-3 difosfoglicerato
Il DPG si lega alla deossi Hb (cavità centrale della molecola) e non alla ossi
Hb (cavità centrale ristretta)
Il legame di O2 e di DPG si escludono a vicenda:
Hb – DPG + 4O2
Hb (O2)4 + DPG
La scoperta del ruolo del DPG nel trasporto dell’O2 ha permesso di chiarire molte
osservazioni, per es. l’adattamento ad alta quota.
M.N. Gadaleta
da: Nelson & Cox
Adattamento ad
alta quota.
20 mmHg=
2,6 kPa
L’adattamento consiste
nell’aumento di DPG con
conseguente aumento
della sigmoidicità della
curva = aumento della
ripidità del tratto
rettilineo = aumentato
rilascio di O2
M.N. Gadaleta
L’emoglobina fetale Hb F (α2γ2)
L’emoglobina fetale ha alta affinità per O2.
In condizioni fisiologiche ha una maggiore affinità per O2 della Hb A.
Ciò rende possibile il passaggio dell’O2 dal sangue materno a quello fetale, a livello
della circolazione placentare.
Spiegazione: l’Hb F lega il DPG più debolmente della Hb A per cui ha una affinità
per O2 più alta: infatti in assenza di DPG le curve delle due Hb si invertono. Perché?
M.N. Gadaleta
perché nella Hb F (γγ) His 143
Ser: il legame col DPG è più debole per 2
Su
bu
ni
tà
β
Su
bu
ni
tà
β
cariche positive in meno
da: Styer L.
M.N. Gadaleta
MODELLI PER SPIEGARE L’EFFETTO COOPERATIVO
MODELLO CONCERTATO O SIMMETRICO O DI MONOD, 1965
1. In assenza di O2 esistono le forme T ed R in equilibrio:
2. L’equilibrio è spostato verso la forma T che è la meno affine a O2
3. Il legame di una molecola di O2 a una subunità di T trasforma tutto il tetramero in R:
questo significa che è possibile solo un effetto cooperativo positivo
Da: Strayer L.
M.N. Gadaleta
MODELLO SEQUENZIALE O DI KOSHLAND
1. In assenza di O2 esiste solo la forma T
2. Il legame di una molecola di O2 a una subunità di T altera la conformazione solo
di quella subunità
3. La subunità che ha subito un cambio conformazionale stabilisce nuovi contatti
con le altre subunità che possono favorire o sfavorire il legame del ligando (sono
possibili effetti cooperativi positivi e negativi)
può far
Da: Strayer L.
M.N. Gadaleta
Nelson & Cox: Appendica A pag. 1149
1Atm = 758 torr = 758 mm Hg = 1,01 x 105 Pascal = 1,01 x 102 kPa
1,01 x 102 kPa = 0,1333 kPa
758 torr
quindi:
1 mm Hg = 0,13 kPa
M.N. Gadaleta
da: Voet & Voet 2007
Descrizione in termini quantitativi della interazione:
(P) PROTEINA – LIGANDO (L)
All’equilibrio
P+L
[ PL ]
[1] Ka = ----------[P] [L]
PL
la cui Ka è
Ka = costante di associazione
Ka misura l’affinità del L per la P; Ka si esprime in M-1
Ka elevato = grande affinità di L per P;
Quando [L] è >> [P]
sempre nella cellula.
[PL]
Ka [L] = ----[P]
[L] si può assumere resti costante; ciò avviene quasi
Equilibrio di legame:
definiamo
siti di legame occupati
[PL]
[2] θ = ----------------------------- = ------------siti di legame totali
[PL] + [P]
M.N. Gadaleta
Sostituendo
avremo:
Ka [P] [L] a [PL] e dividendo per [P] e Ka
Ka [L] [P]
Ka [L]
[L]
[3] θ = -------------------- = ------------- = -----------Ka [L] [P] + [P]
Ka [L]+1
[L] +
Il grafico di
[L]
θ = ----------[L] + ----1
Ka
1
Ka
descrive un’ iperbole rettangolare (vedi fig. 7.4)
θ è una funzione iperbolica di [L]
M.N. Gadaleta
Molto spesso in biochimica è più utile considerare la dissociazione
di un ligando:
[PL]
[P] [L]
e di conseguenza, Kd ossia la K di dissociazione
[P] [L]
[4] Kd = ----------[PL]
cioè Kd =
1
---Ka
si esprime in M
Quando [PL] = [P]
da [2]
[PL]
[P]
θ = ------------- = ------ = 0.5
[PL] + [P]
[2P]
da [4]
Kd = [L]
Kd è il valore di [L] quando θ = 0.5 [5]
(vedi fig. 7.4a)
M.N. Gadaleta
