Prof. Maria Nicola GADALETA
E-mail: [email protected]
Facoltà di Scienze Biotecnologiche
Corso di Laurea in
Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche
Biochimica e Tecnologie Biochimiche
DISPENSA N. 16
ENZIMI IV: Inibizione reversibile: competitiva, incompetitiva,
non competitiva .
Inibizione irreversibile: uso di inibitori irreversibili
per la rivelazione dei siti attivi degli Enzimi
Inibizione enzimatica
Una sostanza che diminuisce la velocità di una reazione biochimica
è detta inibitore.
M.N. Gadaleta
L’Inibizione può essere:
Reversibile: attività catalitica ripristinata dopo la rimozione
dell’inibitore(I)
1. competitiva
2. incompetitiva
3. mista o non competitiva e non competitiva pura
I+E
EI
analisi cinetica di I possibile mediante Michaelis e Menten
I + ES
ESI
Irreversibile:
1. inattivazione
M.N. Gadaleta
1. Inibizione reversibile di tipo competitivo
α = 1 + [I]
KI
Caratteristiche:
1. L’inibitore ha struttura simile al substrato e compete con esso per il sito attivo
dell’E.
2. Viene sempre rimossa da un aumento di [S]. A una [S] abbastanza elevata si
raggiunge la stessa Vmax che si ha in assenza dell’Inibitore.
3. Aumento di Km apparente = Km aumenta di un fattore pari ad α = apparente
diminuzione dell’affinità E S
4. Vmax invariata = efficienza catalitica invariata (non cambia il n° di turnover
dell’E)
Esempio di farmaci che agiscono da inibitori competitivi: statine, sulfamidici,
metotrexato, AZT.
M.N. Gadaleta
Gli inibitori competitivi sono inibitori reversibili che si legano al sito attivo,
alterando la Km ma non la Vmax.
da: P.C Champe
M.N. Gadaleta
Farmaci come inibitori competitivi: 1)statine
Statine: analoghi strutturali di S.
Agenti antiiperlipidemici, inibiscono la
tappa di controllo (committed step) della
sintesi del colesterolo rallentandone la
sintesi e quindi riducendone il livello
plasmatico.
da: P.C Champe
HMG CoA = idrossimetilglutarilCoA
M.N. Gadaleta
2)AZT
L’AZT agisce da inibitore competitivo del dTTP nella sintesi del DNA:
viene inserito nella catena di nuovo DNA ma la interrompe non avendo l’OH
disponibile per l’aggancio del nuovo trifosfato.
La trascrittasi inversa del virus è molto più affine all’AZT delle DNA polimerasi
cellulari per cui viene preferenzialmente bloccata la replicazione virale.
La somministrazione di AZT può,però , avere effetti collaterali.
(sintesi dell’acido
folico nei batteri,
importante per
riproduzione e
accrescimento)
3)
Sulfamidici: con essi iniziò la moderna
chemioterapia.
Innocui per l’uomo che assumono acido folico
dall’esterno.
(sintesi dell’acido folico)
Ac. 4 aminoN10metilfolico
1000 volte più affine di S. Blocca divisione cellule leucemiche
da: Ritter
M.N. Gadaleta
L’inibizione competitiva può essere sfruttata anche per curare per es.
soggetti che abbiano ingerito metanolo, solvente industriale e componente
delle miscele anticongelanti, o glicoletilenico, anticongelante dei radiatori
delle automobili. La loro tossicità è dovuta alla tossicità dei loro prodotti
di ossidazione, aldeidi e acidi organici (formaldeide).
Nel metabolismo di questi solventi alcolici è coinvolta
l’alcooldeidrogenasi. L’etanolo compete efficacemente con il metanolo o
con il glicoletilenico come substrato dell’enzima alcooldeidrogenasi,
evitando la trasformazione di questi composti in metaboliti tossici.
M.N. Gadaleta
Gli studi sugli inibitori competitivi hanno dato anche informazioni sulla
conformazione del sito attivo degli enzimi (vedi es.succinico deidrogenasi)
Glutarato,malonato e ossalacetato hanno 2 cariche negative alle estremità
della molecola come il substrato:
ciò ha suggerito l’esistenza di due cariche positive,opportunamente
distanziate, all’interno del sito attivo dell’enzima succinico deidrogenasi
M.N. Gadaleta
2. Inibizione incompetitiva
L’inibitore non si combina con l’enzima libero e non influenza la reazione E +
S
ES. Il sito per I compare solo dopo la formazione del complesso ES
formando un complesso inattivo ESI
E+S
ES + I
ES
ESI
E+P
α′= 1 + [I]
K′1
Caratteristiche:
1. L’inibitore distorce il sito attivo dell’enzima inattivandolo.
2. Un aumento di [S] non rimuove gli effetti dell’inibitore.
3. Aumenta all’aumentare di S.
4. Diminuiscono Km e Vmax entrambe di un fattore α′.
5. È rara nelle reazioni a un S ma comune in quella a due S.
M.N. Gadaleta
3. Inibizione mista o
non competitiva
α = 1 + [I]
K1
α′ = 1 + [I]
K′1
Caratteristiche:
1. L’inibitore non è correlato a S dal punto di vista della struttura.
2. L’inibitore si combina con l’E in un punto diverso dal sito attivo; si può legare a E
o a ES
3. Non è rimossa da un aumento di [S].
4. La Vmax risulta diminuita di un fattore α′ = efficienza catalitica diminuita =
diminuzione costante e apparente di [Et].
5. La Km può aumentare o diminuire dipende da α o α′
6. Quando α = α’ Km non varia e si parla di inibizione non competitiva pura.
M.N. Gadaleta
da: P.C Champe
M.N. Gadaleta
Esempi di inibizione non competitiva
In generale, agiscono da inibitori non competitivi i reagenti che
possono combinarsi reversibilmente con qualche gruppo
funzionale dell’E, essenziale per la catalisi.
Ioni di metalli pesanti come il Pb2+ e Hg2+, comunemente presenti
nell’ambiente, inibiscono reversibilmente alcuni enzimi che possiedono gruppi
SH: per es. Pb sulla ferrochetalasi, enzima importante per la biosintesi
dell’EME che contiene un gruppo SH.
M.N. Gadaleta
I reagenti che si usano negli studi in vitro, se non sono
estremamente puri, possono contenere, in tracce, ioni di
metalli pesanti sotto forma di impurezze.
• Per prevenire la loro azione inbitoria sull’attività degli
enzimi,si aggiungono alla miscela di incubazione chelanti
come l’EDTA .
•
I chelanti però possono danneggiare enzimi che
richiedono metalli come cofattori (per es. Mg2+ e Ca2+ ):in
questo caso il metallo che serve da cofattore viene aggiunto
all miscela di incubazione in modo che risulti in eccesso
rispetto all’EDTA(EtilenDiaminaTetraAcetato)
EDTA
Inibizione non competitiva pura: quando α è uguale ad α′; viene alterata solo la
Vmax mentre Km non viene alterata
da: P.C Champe
M.N. Gadaleta
M.N. Gadaleta
da: Vote & Voet
da: Nelson & Cox (IV ed.)
INIBIZIONE IRREVERSIBILE
1. E’ detta anche INATTIVAZIONE e consiste in una modificazione
permanente dell’E. Il complesso EI non può più dissociarsi dopo la sua
formazione.
2. Corrisponde ad una diminuzione costante di [E]
3. Può essere causata da:
a) ioni metallici o molecole che si legano covalentemente a E
b) agenti fisici, come radiazioni e calore
4. Si instaura lentamente per cui è incompleta all’inizio, ma aumenta
continuamente nel tempo, in seguito alla modificazione di una frazione
sempre crescente di E.
5. Agiscono in questo modo gli alogeni, l’H2O2, l’alcool, l’etere, le formaline e
in genere tutti gli antisettici, gli agenti alchilanti come l’acido iodoacetico, la
iodoacetamide e gli agenti fosforilanti: DIFP.
6. Una classe speciale di inibitori irreversibili sono gli inibitori suicidi.
M.N. Gadaleta
• Va ricordato che i gruppi funzionali degli E, necessari per
l’attività catalitica ,sono normalmente i gruppi chimici più
accessibili dall’esterno,dovendo venire a contatto con il
substrato
M.N. Gadaleta
L’aspirina come inibitore irreversibile delle cicloossigenasi
salicilico
L’acido acetilsalicilico (aspirina,) antinfiammatorio,
modifica covalentemente e inibisce in maniera
irreversibile la cicloossigenasi I (COX I, costitutiva,
presente nelle piastrine, nello stomaco e nel rene) e la
COX II, inducibile, responsabili della sintesi di
prostaglandine infiammatorie.
L’aspirina acetila le COX sulla Ser530 bloccando
l’accesso dell’arachidonato al sito attivo dell’enzima,
mentre i farmaci non steroidei (NSAID, non steroid anti
inflammatory drugs) come l’indometacina inibiscono le
COX bloccando reversibilmente il canale dell’enzima
per l’arachidonato. Poiché il blocco delle COX blocca
anche la sintesi del trombossano A2, un potente
vasocostrittore e un agonista che stimola l’aggregazione
piastrinica, l’aspirina è usata nella profilassi degli eventi
trombotici che possono portare all’attacco di cuore e
all’infarto.
Essa riduce il rischio di reinfarto del 15%. L’aspirina è
somministrata anche nell’infarto acuto del miocardio
per inibire la partecipazione delle piastrine allo sviluppo
del trombo nell’arteria coronarica.
M.N. Gadaleta
Inibitori irreversibili (inattivatori) e identificazione di
residui di AA essenziali per la catalisi.
Molti gruppi funzionali essenziali per la catalisi sono stati
identificati grazie al fatto che essi sono i gruppi più
accessibili dall’esterno,dovendo venire a contatto con il
substrato :essi,di conseguenza,sono anche i primi a
venire a contatto con sostanze chimiche che li
modificano in maniera irreversibile: la proteina
modificata viene quindi idrolizzata a peptidi e,
attraverso la cromatografia , si identifica l’AA che ha
reagito.
1)Azione agente alchilante:
es. acido iodoacetico
R-H + I-CH2-COOH HI + R-CH2-COOH
es. RNasi: a pH 5.5
alchilazione ----> perdita dell’attività catalitica
AlchilazioneIstidina 119
2 forme inattive di RNasi
nell’anello imidazolico
AlchilazioneIstidina 12
Solo questi AA sono alchilati si è concluso che solo questi AA sono coinvolti
nell’atttività catalitica della RNasi
Con l’acido iodoacetico reagisce anche l’SH della cisteina
M.N. Gadaleta
2) Azione agente fosforilante :
diisopropilfosfofluoroidrato
DIPF = composto organofosforico tossico: analogo dello stato di transizione dei
serin-enzimi (tripsina, chimotripsina, elastasi,
fosfoglucomutasi e
acetilcolinaesterasi).
DIPF reagisce con la serina attiva dell’E formando un derivato fosforilato
inattivo.
Il Pi tetraedrico somiglia allo stato di transizione tetraedrico di molti E idrolitici.
La Ser195 della chimotripsina è stata individuata attraverso questo inibitore.
M.N. Gadaleta
M.N. Gadaleta
L’acetilcolinaesterasi idrolizza
l’acetilcolina,un neurotrasmettitore,
in acetato e colina.
Con DIPF si ha un blocco dell’E
che porta a una costante
stimolazione neuronale.
gas nervini:
neurotossine
Acetilcolina
impulso nervoso acetilcolinaesterasi
M.N. Gadaleta
Inibitori suicidi
Gli inibitori suicidi sono molto specifici (spesso specifici per un
solo enzima).
Son poco reattivi da soli, diventano attivi solo dopo aver occupato
il sito attivo di un E e aver formato il complesso ES.
Sono detti anche:
inattivatori basati sul meccanismo;
agiscono da cavalli di Troia per l’enzima (che li riconosce come
propri Substrati)
Questi inibitori hanno permesso il disegno razionale dei
farmaci:
farmaci basati sul meccanismo, molto efficaci e privi di
effetti collaterali.
Penicillina = molecola naturale che agisce come un inibitore suicida.
Inibisce la glicopeptide transpeptidasi,un enzima coinvolto nella sintesi della
parete cellulare batterica.
M.N. Gadaleta
• Normalmente la glicopeptide-transpeptidasi
batterica scinde il legame peptidico tra 2 residui di
D-alanina.
• La penicillina nel suo anello beta-lattamico contiene
un legame peptidico stirato che assomiglia allo stato
di transizione della normale reazione di
scissione,per cui la penicillina si lega molto
saldamente nel sito attivo dell’enzima.
• Appena l’enzima batterico tenta di rompere questo
legame peptidico della penicillina,quest’ultima si
lega covalentemente alla Serina del sito attivo
dell’enzima,inattivando così l’enzima stesso.
TPCK (tosil-L-fenilalaninaclorometilchetone) : un inibitore suicida
sintetizzato in laboratorio.
Analogo dello stato di transizione del substrato naturale della chimotripsina:
•gruppo di posizionamento sul sito di legame del sito attivo dell’E: simile
•legame sensibile -CO-CH2-Cl (agente alchilante) invece di -CO-NH
Legame di TPCK al sito attivo: alchilazione di His 57 invece di idrolisi
di S
M.N. Gadaleta
Analoghi dello stato di transizione sintetici: sono costruiti
• per inattivare gli enzimi
e
• per identificare i gruppi coinvolti nella catalisi (marcatura
per affinità)
L’essenza della catalisi sta nel legame selettivo dello stato di transizione:
chimotripsina: O- del C carbonilico nello stato tetraedrico.Gli stati di
transizione dei S tuttavia non possono essere isolati perché
instabili.Invece si possono sintetizzare, in laboratorio, molecole simili
allo stato di transizione del substrato che per definizione devono legarsi
all’enzima più fortemente di S.
Sono stati utilizzati per dimostrare che gli E sono più affini allo stato di
transizione di S che a S o come farmaci.
Pauling anni ’40 previde la progettazione razionale di
farmaci: sintesi di analoghi dello stato di transizione dei substrati che
si legano più fortemente dei S agli E e inibiscono la reazione.
M.N. Gadaleta
Gli analoghi dello stato di transizione sintetizzati in
laboratorio:
a) Sono modelli che forniscono informazioni sui meccanismi catalitici
b) possono servire come inibitori potenti e specifici degli enzimi
c) possono essere utilizzati come immunogeni per produrre un’ampia
gamma di nuovi catalizzatori: abzimi (antibody enzyme) usando come
antigeni gli analoghi dello stato di transizione di S.
Un anticorpo che si lega a un analogo dello stato di transizione di S
dovrebbe poter catalizzare la reazione S
P (Gemks 1969).
Sono stati sintetizzati anticorpi monoclonali contenenti analoghi dello
stato di transizione di esteri o di carbonati i quali hanno dimostrato
una efficienza catalitica di 107 volte.
M.N. Gadaleta
Gli studi sugli inibitori hanno dato le seguenti informazioni:
- sequenza delle reazioni metaboliche
- meccanismo e intermedi di catalisi
- specificità degli E per S
- natura dei gruppi funzionali del sito attivo
- partecipazione di certi gruppi funzionali al mantenimento
conformazione attiva dell’E
della
Importanza “in vivo” dell’inibizione:
l’inibizione di certi enzimi da parte di metaboliti specifici costituisce un
elemento importante nella regolazione del metabolismo intermedio.
Inibitori come farmaci:
almeno la metà dei 10 farmaci più prescritti negli USA agiscono come inibitori
enzimatici: statine,AZT, aspirina,penicilline, ACE inibitori, ecc.
M.N. Gadaleta
• FINE
M.N. Gadaleta
M.N. Gadaleta
Il Captoril è un farmaco che inibisce l’enzima di
conversione dell’angiotensina (ACE). Dopo 5 giorni di
trattamento la pressione sanguigna ritorna a livelli normali.
M.N. Gadaleta
