UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PADOVA
FACOLTA’ DI SCIENZE MM.FF.NN
CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA MOLECOLARE
ELABORATO DI LAUREA
Gestione di analisi genomiche e biochimiche in
Medicina Personalizzata
TUTOR: Prof.ssa Fernanda Rigoni
Dipartimento di Biologia
CO-TUTOR: dott. Alessandro Buriani
Data Medica Padova
LAUREANDA: Sonia Keppel
ANNO ACCADEMICO 2008/2009
1
2
INDICE
1
Abstract
Pag. V
2
STATO DELL’ARTE
Genomica predittiva
Discipline –omiche
La Medicina Personalizzata
La Medicina Personalizzata nella prevenzione e nella gestione del
rischio trombotico
Pag. 1
Pag. 1
Pag. 2
Pag. 2
3
APPROCCIO SPERIMENTALE
Database informatici
Preparazione dei campioni biologici
Estrazione del DNA
Genotipizzazione degli SNP
Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)
Determinazione quantitativa della proteina C nel plasma e
Resistenza della proteina C attivata
Tempo di protrombina
Tempo di tromboplastina parziale attivata
Tempo di trombina
Dosaggio dell’Antitrombina III
Test enzimatico per il dosaggio quantitativo dell’omocisteina (HCy)
4
5
Pag. 2
Pag. 5
Pag. 5
Pag. 5
Pag. 6
Pag. 6
Pag. 7
Pag. 7
Pag. 7
Pag. 7
Pag. 7
RISULTATI E DISCUSSIONE
Creazione del pannello di genomica predittiva per la trombofilia
Creazione del pannello di farmacogenomica per la Terapia
Anticoagulante
Gestione di analisi genomiche e biochimiche in Medicina
Personalizzata per valutare il rischio trombotico
Conclusioni
Pag. 8
Pag. 10
BIBLIOGRAFIA
Pag. 16
Ringraziamenti
Pag. 17
Pag. 12
Pag. 15
3
4
Abstract
Nell’era post-genomica si sono sviluppate nuove discipline scientifiche e
mediche, tra le quali la Medicina Personalizzata. Essa rappresenta un nuovo
approccio bio-medico che, grazie all’utilizzo diagnostico dei polimorfismi a
singolo nucleotide (SNP), è in grado di fornire pannelli analitici personalizzati di
genomica predittiva e di farmacogenomica.
Applicato a malattie multifattoriali, come la trombofilia, tale approccio scientifico
è stato utilizzato in particolare nella ricerca delle suscettibilità genetiche al rischio
trombotico. La selezione degli SNP è stata condotta attraverso un’indagine
bioinformatica nei principali database di riferimento. Gli SNP individuati sono
stati quindi utilizzati per la formulazione di un pannello di genomica predittiva e
di farmacogenomica, la cui applicabilità clinica è stata sperimentata attraverso
l’analisi di un paziente affetto da trombosi venosa profonda. I risultati hanno
indicato la presenza di due fattori di rischio genetici e fornito un quadro
farmacogenomico importante nella gestione della terapia anticoagulante orale. La
validità dei risultati dell’indagine di genomica predittiva è stata anche confermata
dalle analisi biochimiche.
Applicato in soggetti sani, in un contesto di Medicina Personalizzata, il pannello
messo a punto è in grado di individuare soggetti a rischio trombotico, permettendo
l’attuazione di strategie di prevenzione pro-attiva e di monitoraggio diagnostico.
5
STATO DELL’ARTE
Genomica predittiva
Le numerose scoperte derivate dal sequenziamento del Genoma Umano hanno
permesso di determinare le caratteristiche e le peculiarità dell’organizzazione del
nostro genoma, scoprendo un’identità di sequenza del 99.9% in tutti gli individui.
La variabilità individuale, presente nel restante 0.1% della sequenza, si manifesta
sotto diverse forme di variabilità nucleotidica: microsatelliti, regioni
moderatamente ripetute, sequenze Alu e soprattutto, in frequenza molto maggiore,
polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). Le variazioni del DNA, nel loro
complesso, oltre a costituire il fingerprint genetico di ogni persona, possono avere
un importante impatto su come un individuo risponde ad una malattia o a
determinati fattori ambientali, come batteri, virus, tossine e agenti chimici,
compresi i farmaci.
La maggior parte dei caratteri umani è determinata dall'intervento di più geni che
spesso interagiscono tra loro e con l'ambiente. Attraverso l’analisi funzionale dei
geni presenti nel genoma umano (genomica funzionale) è stato possibile
individuare le caratteristiche genetiche implicate nella patogenesi di molte
malattie. Molti difetti congeniti e malattie dell'uomo sono il risultato infatti
dell'interazione tra fattori genetici, spesso multipli, e fattori ambientali. Tali
patologie prendono il nome di malattie multifattoriali: sono provocate da più
fattori, compresi quelli ambientali, biologici, psicologici e sociali, al contrario
delle malattie monogeniche come l’emofilia, la talassemia, la fibrosi cistica e il
daltonismo provocate invece solo da fattori genetici. La possibilità di ricercare
marcatori molecolari nel DNA sottoforma di SNP mette a disposizione della
medicina un importante metodo per risalire alle suscettibilità specifiche di un
individuo.
L’analisi diagnostica degli SNP permette infatti di individuare suscettibilità
genetiche a sviluppare determinate malattie, tale disciplina prende il nome di
Genomica Predittiva [1]. Una branca della genomica predittiva, di grande
importanza clinica, è la Farmacogenomica, che attraverso l’analisi degli SNP
implicati nei meccanismi di farmacocinetica (assorbimento e metabolismo dei
farmaci) e farmacodinamica (attività biologica dei farmaci), permette di
caratterizzare la capacità individuale di risposta ai farmaci [2]. Questo ha portato
enormi benefici nella prevenzione delle malattie, sia per trovare il farmaco giusto,
alla dose giusta e nei tempi più appropriati per ogni soggetto.
Discipline –omiche
Il settore della genomica funzionale ha aperto nuovi orizzonti che promettono nel
prossimo avvenire di poter monitorare le patologie in fase pre-clinica con
crescente precisione attraverso l’analisi globale di classi di molecole. Grazie alle
discipline cosiddette “-omiche”, che si sono aggiunte alla genomica, è possibile
studiare specifiche categorie di molecole all’interno di determinati contesti
biologici (cellule, tessuti, organi, o interi organismi). Queste comprendono: la
proteomica (studio delle proteine), la trascrittomica (studio dei trascritti), la
metabolomica (studio dei piccoli metaboliti), la lipidomica (studio degli acidi
grassi) ed altre [3].
6
Il termine proteomica indica l’analisi delle proteine espresse in un determinato
sistema biologico che nel loro insieme formano il proteoma. E’ una disciplina più
complessa della genomica a causa del fatto che il proteoma differisce da cellula a
cellula.
La metabolomica o studio del metaboloma, analizza i piccoli metaboliti presenti
nei liquidi organici, nei tessuti o nelle cellule, rivelando il profilo metabolico e
riportando precise informazioni sulle funzioni dei sistemi biologici in esame.
La lipidomica è lo studio dell’assetto lipidico, la cui variazione può fornire
importanti informazioni sul funzionamento dei sistemi biologici candidati ad
identificare determinate malattie, anche a livello pre-clinico [10].
Infine devono essere menzionate l’interattomica, comprendente la totalità delle
interazioni molecolari che hanno luogo in un organismo, la trascrittomica
incentrata sull'insieme degli mRNA trascritti nell'intero organismo, tessuto o
cellula, ed in fine la microbiomica che ha il fine di caratterizzare gli organismi
microbici presenti nell’organismo umano, capaci di interagire con lo stato di
salute dell’uomo. Caratteristica comune di queste nuove discipline è la visione
d’insieme rivolta ai sistemi biologici, considerati non come entità a sé, ma visti
nel loro insieme, anche attraverso le interazioni dinamiche delle parti di cui sono
composti, grazie ad un’impostazione propria della Biologia dei Sistemi (Systems
Biology) [3].
La Medicina Personalizzata
Proprio grazie alla capacità della genomica predittiva, della farmacogenomica e
delle altre discipline –omiche, di adattare la diagnosi e la terapia all’individuo in
analisi, è stato coniato il termine Medicina Personalizzata, per indicare questo
nuovo approccio della medicina verso il paziente [4]. Attraverso lo studio dei
fattori di rischio di ciascun individuo, la Medicina Personalizzata si pone non solo
l’obiettivo di curare, ma soprattutto di mantenere l’equilibrio dello stato di salute,
attuando due strategie: una rivolta a ridurre i fattori di rischio ambientali e
comportamentali, favorendo i fattori protettivi nell’alimentazione o nelle strategie
terapeutiche; l’altra attraverso il monitoraggio diagnostico di specifici parametri
che caratterizzano la fase pre-clinica della malattia di cui sia stata individuata una
suscettibilità genetica, permettendone l’individuazione precoce. Nel caso in cui la
malattia raggiunga lo stato clinico, la Medicina Personalizzata, grazie alla
farmacogenomica, è poi in grado di individuare la terapia più efficace e con meno
effetti collaterali.
La Medicina Personalizzata nella prevenzione e nella gestione del rischio
trombotico
Il termine trombofilia indica una condizione patologica in cui si verificano
alterazioni della coagulazione del sangue che, a causa dello squilibrio in senso
iper-coagulante, inducono la formazione di coaguli nei vasi sanguigni,
ostacolando il flusso del sangue e provocando trombosi.
La trombofilia non è una malattia ma piuttosto una condizione che predispone alla
trombosi, capace di aumentare l’indice di rischio trombotico a seconda del tipo di
alterazione presente. La maggior parte delle alterazioni trombofiliche oggi note,
sono congenite e trasmissibili ai figli da parte del genitore affetto, grazie ad una
7
trasmissione ereditaria nella quale la condizione omozigote è molto rara e
comporta un maggior rischio trombotico rispetto alla condizione di eterozigosità
[5]. I principali fattori di rischio, oltre alla componente genetica, sono l’obesità,
l’ipertensione, il fumo, la dislipidemia, il diabete, l’uso di contraccettivi orali e
una prolungata immobilità fisica.
La ricerca scientifica degli ultimi anni ha permesso di effettuare notevoli progressi
nella conoscenza dei meccanismi molecolari e cellulari responsabili dei fenomeni
trombotici, mentre uno dei principali progressi della biologia molecolare è stata
l’identificazione dei geni responsabili della predisposizione alla trombosi.
Dai dati dell’Istituto Nazionale di Statistica ISTAT risulta che tra il 2006 e il 2007
le malattie cardiovascolari hanno provocato il 35% dei decessi registrati in Italia
(vedi Figura 1), risultando la principale causa di morte nella popolazione.
Figura 1.
Rappresentazione grafica
dei dati ottenuti dai
registri pubblici ISTAT.
Riporta le cause dei
decessi in percentuale,
registrati nell’anno 20062007 nella popolazione
italiana. Sono escluse le
morti avvenute al di sotto
del primo anno di vita.
La possibilità di limitare l’incidenza e i danni delle malattie cardiovascolari è un
obiettivo medico e scientifico altamente significativo. Grazie alla Medicina
Personalizzata, ed in particolare alla Genomica Predittiva e alla
Farmacogenomica, questo obiettivo è oggi sempre più vicino.
In questo studio verranno progettati pannelli diagnostici di Medicina
Personalizzata, in particolare un pannello di Genomica Predittiva per la
rilevazione delle suscettibilità ed anche un pannello di Farmacogenomica per
individuare terapie personalizzate. A questi pannelli ne verranno aggiunti altri di
tipo biochimico, in grado di rilevare altri fattori di rischio trombotico e di dare un
quadro attuale della condizione trombotica del paziente.
APPROCCIO SPERIMENTALE
In questo lavoro sperimentale sono stati usati due differenti tipologie di materiali:
materiale informatico (database di carattere medico-scientifico) e materiali
analitici (esami di laboratorio).
Database bioinformatici
Per individuare i polimorfismi da inserire nei pannelli di diagnostica predittiva, si
è fatto ricorso ad una ricerca bioinformatica. Questa ha richiesto l’uso e la
comprensione funzionale di diverse banche dati scientifiche internazionali, nelle
quali si sono ricercate tutte le informazioni relative ai polimorfismi e alle
correlazioni degli SNP con la patologia di interesse. Tra i numerosi database
presenti nel web si è limitata la ricerca a soli quattro di essi, ritenuti i principali.
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National Center for Biotechnology Information (NCBI): risorsa
informatica di indirizzo biologico e molecolare di pubblica consultazione,
comprendente a sua volta diversi database tra i quali PubMed dove è possibile
consultare interi articoli di ricerca pubblicati nelle riviste scientifiche, e il database
Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) contenente i geni scoperti nel
genoma umano e le malattie genetiche. (www.ncbi.nlm.nih.gov)
Il database OMIM è un catalogo di geni umani e di malattie genetiche, che
fornisce numerosi e dettagliati link alla letteratura, alle mappe, alle sequenze
geniche e agli altri database ad esso collegati. Nato inizialmente come un catalogo
dei fenotipi umani, intitolato Mendelian Inheritance in Man, è ora presente in
versione online costantemente aggiornata. La ricerca di informazioni può
svolgersi su tre diversi livelli: base (vedi Figura 2), avanzato e con gli operatori
Booleani AND, OR, NOT.
Figura 2. Pagina web del sito NCBI. Rappresenta la ricerca base ottenuta digitando il termine
“thrombosis” nel motore di ricerca OMIM.
GeneCards: banca dati che fornisce dettagliate informazioni genomiche,
proteomiche e funzionali sui geni umani. Permette di ottenere informazioni su
mutazioni, SNP, espressione genica e processi biologici, compresi i dati sulla
sequenza nucleotidica, le varianti alleliche presenti nelle diverse popolazioni, dati
statistici e numerose correlazione tra geni e patologie (www.genecards.org). Per
ciascun gene sono annotate informazioni sui domini proteici, le modificazioni
post-traduzionali, la funzione genica, la localizzazione genomica e il ruolo
funzionale noto in condizioni fisiologiche e patologiche.
Figura 3. Densità genica del cromosoma 1, con il locus del gene FV evidenziato in rosso; le
bande sono state definite in accordo con Ensembl, la localizzazione con GeneLo. Figura prelevata
dal DataBase GeneCard.
VegaHuman: raccoglie tutte le informazioni presenti sul genoma umano,
mettendo a disposizione numerosi collegamenti ipertestuali tra diversi motori di
ricerca (GenBank, EMBL, DDBJ, UCSC). Per ciascuna voce ricercata, visualizza
lo specifico accession number (ID) identificativo nei diversi collegamenti a cui fa
riferimento, compreso il visualizzatore ExPASy della struttura proteica. Viene
aggiornato manualmente. (http://vega.sanger.ac.uk/Homo_sapiens/index.html)
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Hugo (HUman Genome Organization): database contenente informazioni
su più di 28.000 geni, la maggior parte codificanti proteine ma anche pseudogeni.
È probabilmente il database di maggior rilevanza clinica, nato da una
collaborazione mondiale di numerosi istituti di ricerca che mettono in rete, in
tempo reale, aggiornamenti sulle associazioni tra SNP e malattie, la cui finalità è
proprio quella di facilitare e velocizzare il trasferimento delle conoscenze
genomiche alla pratica clinica. Fornisce numerosi collegamenti ipertestuali a tutti
gli altri database internazionali. (www.genenames.org)
Preparazione e gestione dei campioni biologici
I campioni di sangue analizzati vengono raccolti tramite venipuntura e collocati in
provette. Le analisi biochimiche dell’ematologia vengono svolte su campioni di
plasma trattato con l’anticoagulante citrato di sodio 0,109 mol/l. Le analisi
genomiche e di quantificazione dell’omocisteina necessitano invece di campioni
di sangue intero trattato con l’anticoagulante EDTA.
In entrambi i casi, i campioni subiscono centrifugazione a 1500g per 15 minuti, e
vengono analizzati entro quattro ore, altrimenti vengono congelati e conservati per
un massimo di due settimane.
Il laboratorio Data Medica Padova è dotato di sistemi altamente robotizzati e
automatizzati che in seguito alla preparazione dei campioni biologici, ne
permettono la manipolazione pre-analitica ed analitica.
Estrazione del DNA
Nell’estrazioni del DNA è stato utilizzato il kit Eurogold Blood Kit DNA®. Tale
kit è ottimizzato per un’emolisi e una rimozione efficiente di emoglobina e
fornisce un metodo rapido e semplice per l'isolamento fino a 30 µg di DNA
genomico.
Per la lisi delle cellule si è utilizzato: 400 µl CL Buffer per 1 x 107 cellule e 25 µl
OB™ Protease. Poiché in seguito a centrifugazione, il surnatante ottenuto
contiene DNA genomico ed RNA, viene aggiunto RNase A (20 mg/ml). Per
caricare il DNA estratto su colonna si è aggiunto: 200 µl CL Buffer, alcool
isopropilico, 220 µl di etanolo. Vengono caricati 750 µl della soluzione ottenuta
(compreso i precipitati) in una provetta 2 ml. Segue l’aggiunta di Buffer leganti il
DNA e di lavaggi. L’efficienza dell’estrazione è leggermente migliore se la
colonna, prima della centrifugazione, viene incubata a 70°C piuttosto che a
temperatura ambiente. L’estrazione ottiene in media 8-30 µg di genomico in
1x107 cellule.
Genotipizzazione degli SNP
La PCR viene eseguita in un volume di 50 µl con il kit Duplica Real time
Genotyping Kit®, e con un unità di Taq polimerasi. Ogni kit contiene un primer 5’3’, un primer 3’-5’ specifico per l’allele wildtype, un primer 3’-5’ specifico per
l’allele mutato.
Nel caso degli SNP associati alla trombosi, si è utilizzato il seguente protocollo di
genotipizzazione: aggiungere 45 µl di Master Mix (22,5 µl di Amplification Mix,
22,5 µl di Oligo Mix) e 5 µl di DNA. Dopo un’iniziale denaturazione (94°C per 5
min) seguono 30 cicli: denaturazione (94°C per 15 sec.), annealing (58°C per 30
sec.), estensione (72°C per 30 sec.) segue l’estensione finale (72°C per 5 min).
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I frammenti di DNA amplificati sono: per la mutazione del Fattore II l’allele
wildtype di 177 bp, l’allele mutato 199 bp, per lo SNP in posizione 1691 del
Fattore V l’allele wild type è di 123 bp mentre quello mutato di 148 bp, per lo
SNP del gene MTHFR in posizione 677 il wild type è di 148 bp mentre il
frammento con lo SNP è di 173 bp.
Successivamente all’amplificazione, l’individuazione degli SNP avviene con
metodo RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) per i geni FV, FII,
MTHFR, FBG, ITGβ e CYP2C9 in gel di agarosio al 3%. Nella genotipizzazione
del gene VKORC1 viene invece utilizzato sequenziamento diretto.
Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)
Tali variazioni della sequenza nucleotidica sono evidenziabili nel genoma ogni
300 basi circa, sia nelle regioni non codificanti, che in quelle codificanti. Spesso
sono associati con alterazioni delle funzioni cellulari, talvolta predisponendo la
persona a manifestare particolari fenotipi patologici, oppure influenzando la
risposta all’assunzione di farmaci.
Gli SNP scelti come marcatori nel presente studio, sono polimorfismi dei geni
codificanti i principali fattori che partecipano al processo coagulativo. Essi
possono essere semplicisticamente suddivisi in “loss-of-function mutations” degli
anticoagulanti naturali, “gain-of-function mutations” dei fattori procoagulanti e in
anomalie responsabili di una generalizzata “decreased fibrinolytic function.
Determinazione quantitativa della proteina C e Resistenza della proteina C
attivata
Lo strumento utilizzato per questi test di coagulazione e per i successivi, esclusa
l’analisi quantitativa dell’omocisteina, è l’analizzatore automatico Sysmex CA1500 con metodiche coagulative, cromogeniche ed immunologiche.
Il dosaggio della proteina C in campioni di plasma umano viene monitorato
mediante metodo cromogenico grazie al kit Spectrolyse Protein C®. Tale kit
contiene i seguenti reagenti: anticorpo anti-proteina C umana di pecora, attivatore
liofilizzato da veleno di vipera Agikistrodon Contortix, substrato della proteina C
e additivo del substrato. La procedura consiste in: aggiungere 100 µl di anticorpo
anti-proteina C, 100 µl di campione di plasma e incubare la soluzione a 37°C per
2 minuti; aggiungere 200 µl di attivatore e incubare a 37°C per 5 minuti;
aggiungere 200 µl di substrato e incubare a 37°C per 10 minuti. In una cuvetta da
1cm viene letta l’assorbanza a 405 nm, dopo aver azzerato sul bianco lo
spettrometro con acqua deionizzata. L’assorbanza ottenuta in presenza
dell’anticorpo viene sottratta dall’assorbanza ottenuta in assenza dell’anticorpo
per correggere l’eventuale attività amidolitica indipendente dalla proteina C.
Il test funzionale che determina l’attività della proteina C è denominato APC e
utilizza il kit Pefakit APC-R FactorV Leiden®. Il campione di plasma in esame
viene diluito con plasma carente del fattore V fornito dal Kit, in modo tale da
ottenere un risultato strettamente correlato alle alterazioni del fattore V, in
particolar modo alla mutazione di Leiden. La coagulazione del campione viene
innescata attraverso l’aggiunta di un attivatore della protrombina estratto dal
veleno di serpente Notechis scutatus in assenza di calcio, eliminando le
interferenze da parte dell’eparina grazie all’aggiunta di particolari reagenti. Si
registra il tempo della formazione del coagulo alla presenza dei due diversi
reagenti della proteina C e si calcola la Ratio tra i due tempi ottenuti.
11
Tempo di protrombina
Il test PT misura il tempo di coagulazione del plasma e utilizza il kit
TROMBOPLASTINA-S®.. Tale test misura la coagulazione del plasma dopo
aggiunta di tromboplastina liofila estratta da cervello di coniglio contenente
Calcio Cloruro. Il reagente fornisce tromboplastina tessutale che attiva la cascata
coagulativa. Il valore che si ottiene in seguito a lettura foto-ottica
foto ottica è espresso in
INR (Rapporto Internazionale Normalizzato) per standardizzare i risultati del test
in soggetti in terapia con farmaci anticoagulanti orali.
Tempo di tromboplastina parziale attivata
Il test APTT misura il tempo di coagulazione del plasma. Si è utilizzato il kit
APTT-EA®,, ed è stata seguita la seguente procedura: aggiungere 0,1 ml di
reagente APTT-EA
EA in 0,1 ml di plasma, incubare a 37°C per 3 minuti; aggiungere
0,1 ml di calcio cloruro preriscaldato e rilevare il tempo di formazione di coaguli,
in secondi. Il valore ottenuto è espresso in secondi e Ratio.
Tempo di trombina
Il TT misura ill tempo di coagulazione indotto da trombina bovina in presenza di
calcio nel plasma e permette di analizzare l’attività dell’antitrombina. La
procedura del test consiste nell’incubare 100 µll di plasma intero a 37 °C per 3
minuti e aggiungere 50 µl del reagente
reagente trombina bovina. Il valore deriva da una
lettura foto-ottica
ottica e viene espresso in secondi o Ratio.
Dosaggio dell’Antitrombina III
Il dosaggio cromogenico per la determinazione quantitativa dell’antitrombina III
misura l’assorbanza a 405 nm. 15 µll di plasma intero vengono diluiti in rapporto
1:8 con 105 µll di tampone diluente. Segue una seconda diluizione 1:40. Vengono
aggiunti 50 µl di reagente trombina e prima della lettura a 405 nm viene incubata
la soluzione a 37 °C per un minuto con 50 µl di substrato trombina.
Test enzimatico per il dosaggio quantitativo dell’omocisteina (HCy) nel siero
L'omocisteina è un aminoacido solforato che si forma in seguito a perdita di un
gruppo metilico da parte della metionina. Le alterazioni del metabolismo della
metionina sono provocate da diverse cause di base genetica, nutrizionale,
endocrina o farmacologica. Un livello elevato di omocisteina nel
ne sangue
(iperomocisteinemia) è considerato un fattore
fattore di rischio accertato per le malattie
cardiovascolari,, compresa la trombosi [5].
Il test enzimatico Homocystein T(Hcy) Minias prevede il dosaggio quantitativo
dell’omocisteina (HCy) attraverso una cascata di reazioni enzimatiche che portano
ad una diminuzione di assorbanza a 340 nm dovuta all’ossidazione del NADH a
NAD+ rilevabile spettrofotometricamente. Il campione analizzato è costituito da
15 µll di sangue intero trattato con EDTA il quale dopo l’aggiunta di 30 µl di
reagente R2, viene incubato per 2 minuti. Prima della lettura allo
spettrofotometro, vengono aggiunti 25 µll di R3 e incubati per 3 minuti. I risultati
sono espressi
ssi in micromoli/litro (µmol/l).
(
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RISULTATI E DISCUSSIONE
Creazione del pannello di genomica predittiva per la trombofilia
Il pannello genomico messo a punto in questo studio definisce quali SNP
rappresentano un aumentato rischio trombotico nella popolazione caucasica
europea. La precisazione della provenienza geografica dei pazienti a cui è
destinata tale indagine, risulta essere un dato di primaria importanza poiché la
correlazione tra un dato SNP e la patologia, dipende strettamente dalle frequenze
dei polimorfismi [6]. Tali frequenze possono infatti variare in base alla
provenienza geografica e all’etnia.
I criteri utilizzati per la selezione dei geni inseriti nel seguente pannello hanno
considerato: la presenza degli SNP nei database di maggior riferimento
nell’ambito genomico, l’affidabilità statistica degli studi usati per definire le
frequenze degli SNP, la quantità di informazioni presenti sulle più importanti
riviste scientifiche, il numero e la qualità degli studi di associazione e di metaanalisi svolti per confermare l’associazione tra SNP e manifestazione trombotica
ed infine la particolare prevalenza della mutazione nella popolazione caucasica
europea.
La correlazione tra patologia trombotica e sequenze geniche riguarda singoli
nucleotidi, ed ha permesso la realizzazione della seguente lista di polimorfismi:
GENE
Fattore V
SNP Ricercato
G1691A
Il polimorfismo del gene Fattore V determina la sostituzione di una guanina con
un’adenina, in posizione 1691 del gene, e la traduzione, in posizione 506, di una
glutammina al posto della normale arginina, all’interno di uno dei siti proteolitici
su cui agisce la proteina C attivata. Questo polimorfismo provoca una maggiore
attività pro-coagulante del fattore V attivato, causata dall’impossibilità da parte
della proteina C di tagliare il fattore a livello del sito 506, determinando una
resistenza alla proteina C attivata (APC) che predispone al rischio trombotico. La
variante G1691A, definita variante di Leiden (località in cui fu scoperta) ha una
frequenza genica del 1,4 - 4,2% in Europa con un gradiente decrescente da nord a
sud. La frequenza di portatori eterozigoti in Italia è pari al 2-3% della
popolazione, mentre l’omozigosità per tale mutazione ha un’incidenza di 1 su
5000. I soggetti eterozigoti hanno un rischio 8 volte superiore rispetto alla norma
di sviluppare una trombosi venosa, mentre gli omozigoti hanno un rischio pari ad
50-100 volte [5].
GENE
Fattore V
SNP Ricercato
A4070G
Il polimorfismo A4070G nell’esone 13 del gene FV, determina la sostituzione di
un’ arginina al posto di un’istidina nella posizione 1299 del dominio B del Fattore
V. Diversi studi hanno confermato una sua associazione con il fenotipo
“Resistenza alla proteina C attivata” e con fenomeni trombotici.
GENE
Fattore V
SNP Ricercato
A5279G
Il polimorfismo A5279G consiste nella sostituzione di un’adenina con una
guanina in posizione 5279 del gene, ed è piuttosto frequente nella popolazione
13
italiana. Questo SNP comporta la sostituzione a livello proteico di una tirosina
con un residuo di cisteina nella posizione amminoacidica 1702. Evidenze cliniche
associano la mutazione A5279G ad un rischio trombotico aumentato di 3-4 volte.
GENE
Fattore II
SNP Ricercato
G20210A
In posizione 20210 della regione 3’ non trascritta del gene della protrombina, è
stato descritto uno SNP caratterizzato dalla sostituzione di una guanina con una
adenina. Questo polimorfismo è coinvolto nella regolazione genica posttrascrizionale, conferendo stabilità all’mRNA, ed è associato ad un aumento di
circa il 30% dei livelli plasmatici di protrombina. La modalità di trasmissione
ereditaria è di tipo autosomico dominante. Questa variante ha una prevalenza in
Europa del 3-5%, con un gradiente crescente da nord (2-5%) a sud (3-7%), mentre
è molto rara in Africa e Asia. E’ stata misurata una presenza del 18% dello SNP
negli individui affetti da trombosi [5]. La frequenza degli omozigoti è
estremamente bassa. I soggetti eterozigoti hanno un rischio circa 3 volte superiore
rispetto alla popolazione generale di sviluppare una trombosi venosa.
GENE
Beta-fibrinogeno
SNP Ricercato
G455A
Il polimorfismo presente all’interno del promotore del gene codificante il
fibrinogeno, consiste nella sostituzione di una adenina al posto di una guanina
nella posizione nucleotidica 455 ed è associato ad un maggior rischio di
manifestare trombosi venose profonde, conseguente al legame costitutivo del
fibrinogeno all’endotelio.
GENE
Integrina beta-3
SNP Ricercato
T1565C
Nell’esone 2 del gene ITGB3 si è individuato un polimorfismo direttamente
associato con eventi trombotici. Tale gene codifica per un recettore di membrana
che media l’interazione tra piastrine e fibrina, determinando la formazione del
tappo piastrinico. Il polimorfismo T1565C determina la sostituzione di una
prolina in posizione 33 al posto della leucina.
GENE
MTHFR
SNP Ricercati
C667T
A1298C
Il polimorfismo in posizione 667 del gene MTHFR rappresenta una variante
termolabile dell’enzima codificato, con una sostituzione di una citosina a timina,
ed una alanina con una valina nella sequenza amminoacidica.
Il polimorfismo in posizione 1298 consiste nella sostituzione dell’adenina in
citosina e di un glutammato con una alanina.
Entrambi questi polimorfismi hanno una trasmissione autosomica recessiva e si
associano ad una ridotta attività dell’enzima MTHFR che determina un aumento
dei livelli plasmatici di omocisteina. La prevalenza dello SNP C667T in Europa è
del 3-3,7%.
14
Fattori di cui si sono selezionati i polimorfismi nel pannello di Genomica
predittiva:
Il Fattore V attivato è un cofattore essenziale per l'attivazione della protrombina
a trombina. Il suo effetto pro-coagulante è normalmente inibito dalla Proteina C
attivata, che taglia il fattore V in tre parti, degradandolo;
La Protrombina, o Fattore II della coagulazione, svolge un ruolo fondamentale
nella cascata coagulativa in quanto la sua attivazione a trombina, porta alla
trasformazione del fibrinogeno in fibrina e quindi alla formazione del coagulo;
Il beta-Fibrinogeno, precursore della fibrina, è presente nel plasma sanguigno
sotto forma di proteine dimeriche. Il fibrinogeno è essenziale nella coagulazione
del sangue poiché, attraverso un processo di polimerizzazione, viene convertito
in fibrina dalla trombina, inducendo così la formazione del trombo emostatico;
Figura 4.
Rappresentazione
schematica
della cascata coagulativa del
sangue. I fattori coagulanti sono
indicati da un numero romano o
da un nome. Le frecce in rosso
evidenziano
i
fattori
anticoagulanti, le frecce in verde
la via fibrinolitica.
L’Integrina beta-3 è una glicoproteina integrale delle membrane cellulari, che
lega le proteine della matrice extracellulare. Svolge un ruolo fondamentale
nell’adesione delle piastrine durante la loro attivazione, stabilizzando il tappo
piastrinico grazie alla salda interazione con il collagene e il fibrinogeno;
Il Metilenetetraidrofolatoreduttasi è un enzima coinvolto nella conversione del
5,10-metilenetetraidrofolato in 5-metiltetraidrofolato. Tale reazione enzimatica
permette la conversione dell’omocisteina a metionina grazie al trasferimento di
gruppi metile, risultando fondamentale per impedire l’accumulo di omocisteina
nel sangue.
Figura 5. Rappresentazione
schematica
del
processo
metabolico dell’omocisteina nel
sangue.
Creazione del pannello di farmacogenomica per la Terapia Anticoagulante
La Terapia Anticoagulante Orale (TAO) viene prescritta in seguito alla
manifestazione di un evento trombotico e il suo dosaggio deve essere
attentamente monitorato per scongiurare sovradosaggi con un aumentato rischio
emorragico, o sottodosaggi con conseguente inefficacia nella profilassi anti15
trombotica. La metabolizzazione del farmaco warfarin, è molto variabile e
soggettiva e dipende spesso dalla presenza di determinati polimorfismi. La
presenza e/o la combinazione dei polimorfismi nel gene del citocromo P450-2C9
e del gene della vitaminaK-Epossido Reduttasi, determinano variazioni importanti
nella risposta terapeutica al warfarin, perciò risulta molto utile sottoporre i
pazienti ad un’indagine farmacogenomica.
GENE
SNP Ricercati
CYP2C9
C3608T (*2)
A42614C (*3)
Il gene CYP2C9, localizzato nel locus cromosomico 10q24, codifica per il
complesso del citocromo P450-2C9 e presenta numerose mutazioni puntiformi. Il
polimorfismo C3608T determina, in posizione 144, una sostituzione di un residuo
di arginina con una cisteina, mentre il polimorfismo A42614C è caratterizzato da
una isoleucina in posizione 359 al posto di un residuo di leucina. Tali
polimorfismi sono associati ad una ridotta metabolizzazione del warfarin, che ha
quindi un’emivita più lunga e richiede un dosaggio più basso per non esporre i
soggetti a complicazioni emorragiche [9].
Esistono precise correlazioni genotipo-fenotipo per una migliore gestione delle
cure farmacologiche prescritte al singolo paziente. Data l’elevata frequenza dei
polimorfismi del CYP2C9, l’analisi del genotipo trova un ruolo fondamentale
nella messa a punto del trattamento farmacologico con il warfarin.
GENE
VKORC1
SNP Ricercati
G1639A
C1173T
G3730A
Nel gene VKORC1 la cui corsa elettroforetica è riportata come esempio nella
figura sottostante, sono presenti
decine di polimorfismi e tra i più
frequenti ci sono lo SNP G1639A e lo
SNP C1173T associati ad una minor
espressione ed attività dell’enzima.
La presenza di questi tre SNP è
considerata predittiva della variabilità di risposta al trattamento con warfarin,
poiché ne altera la sensibilità al farmaco.
Fattori proteici di cui si sono selezionati i polimorfismi nel pannello di
Farmacogenomica
Il CYP2C9, uno dei membri della famiglia dei Citocromi P-450, è responsabile
del metabolismo di circa il 16% dei farmaci attualmente in commercio, ed ha
funzione di ossidazione ed eliminazione di sostanze endogene ed esogene. E’
importante per il metabolismo di molti farmaci aventi un range terapeutico
ristretto, come gli anticoagulanti Warfarin e Acenocumarolo.
L’enzima vitamina K-Epossido Reduttasi è implicato nella sintesi di fattori
coagulativi vitaminaK-dipendenti e costituisce il bersaglio proteico del warfarin.
La vitamina K agisce come coenzima di questa ossido-reduttasi durante la
carbossilazione di residui di acido glutammico, determinando l’attivazione di
proteine, tra le quali la protrombina.
16
Gestione di analisi genomiche e biochimiche in Medicina Personalizzata,
per valutare il rischio trombotico
Una volta messi a punto i pannelli di Genomica predittiva e di Farmacogenomica,
sono stati utilizzati per creare un profilo diagnostico di Medicina Personalizzata,
con lo scopo di caratterizzare l’individuo, in modo da valutarne complessivamente
lo stato di salute o il rischio di malattia e al tempo stesso di poter valutare le
corrispondenze funzionali alle eventuali alterazioni geniche. A tal fine, ai pannelli
di genomica sono stati aggiunti altri parametri di tipo biochimico, che vengono
oggi utilizzati per il monitoraggio patologico. Queste analisi valutano un noto
fattore di rischio trombotico, l’omocisteina, un pannello di lipidomica, che può
essere associato al rischio trombotico, e gli altri esami di routine, che in
diagnostica ematologica sono normalmente usati su pazienti trombofilici.
L’insieme di tutti i pannelli analitici fornisce il profilo di rischio trombotico e, al
tempo stesso, una valutazione attuale del rischio per il monitoraggio diagnostico.
Il profilo diagnostico di Medicina Personalizzata è stato quindi eseguito su un
paziente già noto aver subito un evento trombotico, per verificarne l’efficacia e
fornire un esempio di gestione di indagine diagnostica di questo nuovo approccio
di Medicina Personalizzata.
La gestione delle analisi eseguite in seguito ad un improvviso fenomeno
trombotico, in un paziente al di sotto dei 50 anni, con un’anamnesi familiare
positiva a tali eventi, non ha quindi avuto alcun scopo predittivo, ma piuttosto ha
confermato il sospetto clinico delle concause genetiche. Tale paziente è stato
sottoposto all’individuazione dei polimorfismi presenti nel pannello di Genomica
Predittiva sopra descritto, confermando, in questo caso, l’associazione tra
manifestazione trombotica e presenza di SNP, indici di una specifica suscettibilità.
Si è ottenuto la seguente conclusione diagnostica:
REFERTO GENOMICA PREDITTIVA
GENE
GENOTIPO
Fattore V G1691A
GG
Wild type
Fattore V A4070G
AA
Wild type
Fattore V A5279G
AA
Wild type
Fattore II G20210A
GG
Wild type
Beta Fibrinogeno G455A
GA
Eterozigote mutato
Integrina Beta3 T1565C
TT
Wild type
MTHFR C677T:
TT
Omozigote mutato
MTHFR A1298C
AA
Wild type
Sulla base degli studi presenti in letteratura, un tale profilo genetico positivo per
due polimorfismi, non è considerato raro [5]: presenta il polimorfismo in
posizione 455 del gene FBG in eterozigosi e il polimorfismo in posizione 677 del
gene MTHFR in omozigosi. I due polimorfismi causano l’alterazione di vie
metaboliche diverse: uno altera la cascata coagulativa con il legame costitutivo del
fibrinogeno all’endotelio, e l’altro l’ossidoriduzione dell’omocisteina con una
ridotta attività enzimatica del Metilenetetraidrofolato Reduttasi. Entrambi i
polimorfismi presenti, sono associati ad un aumentato rischio trombotico.
Le analisi del DNA non sono però l’unico strumento della Medicina
Personalizzata usato per individuare una suscettibilità trombotica al fine di ridurne
17
o ritardarne la manifestazione. A tale scopo quindi è stata condotta l’analisi
quantitativa dell’omocisteina nel sangue, mediante Cromatografia ad Alta
Risoluzione (HPLC) [8]. L’esame ha dato i seguenti risultati:
VALORE OMOCISTEINA
29.6 µmol/l
VALORE NORMALITA’
3 – 15 µmol/l
Il valore al di sopra della soglia di normalità, manifesta pienamente il genotipo
omozigote per la mutazione 677 del gene MTHFR. Il fenotipo si manifesta quindi
in un’incapacità di riconvertire l’omocisteina a metionina, determinando così
elevati livelli di omocisteina circolante nel sangue (iperomocisteinemia), che
determina un fattore di rischio per eventi trombotici.
Un altro importante parametro che è associato ad un aumentato rischio
trombotico, è stato individuato dall’analisi lipidomica, in particolare dall’analisi
dell’Ossidazione lipidica delle membrane eritrocitarie. La composizione di questa
membrana è infatti rappresentativa dello stato di salute dell’organismo, fornendo
una misura dello stato ossidativo delle membrane [8, 10]. Questo esame
biochimico è stato condotto e gestito dal laboratorio di lipidomica Lipinutragen
Srl, che ha fornito il seguente pannello lipidomico:
ACIDI GRASSI
Valori trovati (%)
Valori normali (%)
Palmitico (16:0)
23.3
17 - 27
Palmitoleico (16:1)
0.2
0.2 - 0.5
Stearico (18:0)
18.7
13 - 20
Oleico (18:1)
17.6
9 - 18
Vaccenico (18:1)
1.5
0.7 - 1.3
Linoleico omega6 (18:2)
10.4
9 - 16
Eicosatrienoico omega6
(20:3)
Arachidonico
omega6(20:4)
1.7
1.9 - 2.4
18.8
13 - 17
EPA omega3 (20:5)
0.9
0.5 - 0.9
DHA omega3 (22:6)
6.8
5-7
Tot. saturi (SFA)
42.0
30 - 45
Tot. monoinsaturi (MUFA)
19.3
13 - 23
Tot. poliinsaturi (PUFA)
38.6
28 - 39
Trans 18:1
0.1
0 - 0.3
Trans-ARA
0.1
0 - 0.4
TotalTRANS
0.2
0 - 0.4
INDICE DI SQUILIBRIO NELLA BIOSINTESI LIPIDICA
SFA / MUFA
2.2
1.7 - 2
omega6 / omega3
4.0
3.5 - 5.5
EFA deficiency
0.6
0 - 0.4
Il risultato ottenuto ha messo in evidenza una condizione specifica, indicativa
dell’aumento di rischio trombotico, in quanto gli acidi saturi sono in eccesso
18
rispetto ai monoinsaturi, come anche il valore di acido arachidonico. Questa
condizione complessiva può associarsi ad un aumento dei livelli di colesterolo
sierico e dello stato infiammatorio, che rappresentano importanti fattori di rischio
cardiovascolare. I risultati della lipidomica sono coerenti con i dati provenienti
dall’analisi sierica dell’assetto lipidico, in cui sono risultati elevati i valori di
colesterolo totale e LDL (Low Density Lipoproteins) [dati non riportati].
L’indagine diagnostica si completa infine con l’analisi dei fattori della
coagulazione. Anche in questo caso, i risultati ottenuti, piuttosto che un valore
predittivo, hanno avuto lo scopo di confermare l’efficacia e la predittività del
pannello genomico messo a punto, ed hanno permesso di trovare riscontri
biochimici coerenti con i polimorfismi trovati.
ESAMI DI LABORATORIO
VALORI
TROVATI
ANTIGENE PROTEINA C
82,6%
75,5% – 108,9%
APC-R
TEMPO
TROMBOPLASTINA
TEMPO DI TROMBINA
TEMPO DI PROTROMBINA
ANTITROMBINA III
3.2 Ratio
27 sec
0.9 Ratio
22 sec
1 INR
86.2%
530 mg/dl
>2.2
25 – 40 sec
0.8 – 1.2 Ratio
15 – 20 sec
INR 0.9 – 1.15
75%- 125%
230 – 450 mg/dl
FIBRINOGENO
VALORI DI
RIFERIMENTO
Complessivamente le indagini biochimiche hanno confermato le indagini
genomiche, evidenziando un aumento del fibrinogeno, causato evidentemente
dalla mutazione del gene FGB e dimostrando l’efficacia del sistema
nell’individuare importanti fattori di rischio che possono essere utilizzati nella
prevenzione anti-trombotica. Considerati assieme alla mutazione dell’enzima
dell’omocisteina, i risultati dell’indagine di Medicina Personalizzata forniscono
un esauriente quadro in grado di giustificare l’evento trombotico.
GENE
VKORC1 G1639A
VKORC1 C1173T
VKORC1 G3730A
CYP2C9 C3608T
CYP2C9 A42614C
REFERTO GENOMICA PREDITTIVA
GENOTIPO
GA
Eterozigote mutato
CT
Eterozigote mutato
GG
Wild type
CT
Eterozigote mutato
AA
Wild type
I risultati di Farmacogenomica indicano che sono presenti tre polimorfismi: uno
sul gene CYP2C9 2* e due sul gene VKORC1. La positività in eterozigosi del
polimorfismo C3608T (*2) sul gene CYP2C9, si associa ad una ridotta attività
dell’enzima citocromo P450-2C9 [9], e questo si traduce in un lento metabolismo
della classe di farmaci, che come il warfarin, vengono metabolizzati attraverso
questa via enzimatica. La positività in eterozigosi di due polimorfismi (G1639A e
C1173T) sul gene VKORC1 si associa ad un’alterata sensibilità dell’enzima
19
vitaminaK-Epossido Reduttasi all’azione degli anticoagulanti orali [9]. Nel
contesto del trattamento, questo genotipo può complessivamente influenzare la
corretta determinazione della dose terapeutica iniziale e, per i farmaci con un
ristretto profilo terapeutico come gli anticoagulanti, può dar luogo ad un
iperdosaggio o ad un’incapacità di mantenere l’efficacia terapeutica. La dose
terapeutica iniziale deve quindi essere calcolata sulla base di questo assetto
genetico.
Conclusioni
Attualmente la Medicina Personalizzata non ha ancora avuto un’ampia
applicazione nel sistema sanitario italiano, ma le strutture di ricerca più avanzate e
alcuni centri sanitari privati hanno già cominciato ad applicare questa nuova
disciplina, nonostante la radicata diffidenza presente nell’ambiente medico.
I risultati diagnostici ottenuti nel presente studio confermano che la ricerca
condotta ha permesso di ottenere risultati positivi riguardo alla validità clinica dei
geni considerati per il rischio trombotico. Lo stesso pannello genomico eseguito
su un paziente non ammalato, avrebbe quindi potuto predire un alto grado di
suscettibilità alla malattia trombotica e raccomandare adeguate cure terapeutiche
nell’ambito di un quadro di Medicina Personalizzata.
I test genetici utilizzati per valutare la suscettibilità a patologie, vengono condotti
prima della comparsa dei sintomi clinici, e grazie alla multi-fattorialità della
patologia, è eventualmente possibile ridurre i fattori di rischio non genetici e
adottare regimi specifici di monitoraggio diagnostico per iniziare tempestivamente
eventuali terapie antitrombotiche .
La predizione alla suscettibilità trattata, conferisce utilità clinica unicamente alla
patologia trombotica e agli specifici polimorfismi dichiarati.
La nuova era della Medicina Personalizzata ha inoltre consentito lo sviluppo di un
ruolo innovativo della figura del Biologo Molecolare, che affiancando il medico,
contribuisce alla corretta comprensione dell’approccio globale alle problematiche
del paziente.
20
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genomics of cardioembolic stroke. Stroke. 40(3 Suppl): S67-70.
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Journal of proteome research. 3(2):179-96.
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[10] Wakelam, Pettitt, Postle, 2007. Lipidomic analysis of signaling pathways.
Methods in Enzymology. 432:233-46.
21
Ringraziamenti
Ringrazio la Data Medica Padova Spa per aver permesso la realizzazione di
questo studio, fornendo supporto logistico, strumentazione, metodi e soprattutto il
sostegno e la competenza di personale specialistico, in particolare del medico
responsabile del servizio di Medicina Personalizzata, dott. Stefano Fortinguerra.
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