Document

Anno Accademico 2010/2011
Laurea Magistrale in
CHIMICA
Analisi degli alimenti
(LMC-2: CARBOIDRATI)
Giorgio Bonaga
COMPOSIZIONE CHIMICA E ANALISI
DEI CARBOIDRATI
MONOSACCARIDI: D-aldosi
CHO
H C OH
CH2OH
D-gliceraldeide
(+)-gliceraldeide
CHO
CHO
H C OH
HO C H
H C OH
CHO
H C OH
CH2OH
D-eritrosio
(-)-eritrosio
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
CH2OH
CHO
CHO
H C OH HO C H
H C OH
HO C H
H C OH
CH2OH
CH2OH
D-arabinosio
D-ribosio
(-)-ribosio
D-xilosio
(+)-xilosio
(-)-arabinosio
CHO
H C OH
CHO
CHO
CHO
HO C H
H C OH HO C H
HO C H
H C OH
H C OH
H C OH HO C H
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH HO C H
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
CH2OH
D-allosio
(+)-allosio
CH2OH
D-altrosio
(+)-altrosio
(-)-treosio
CHO
CHO
HO C H
CH2OH
D-treosio
CHO
HO C H
HO C H
H C OH
CH2OH
D-lixosio
(-)-lixosio
CHO
H C OH
H C OH HO C H
HO C H
H C OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
D-glucosio
D-mannosio
(+)-glucosio
(+)-mannosio D-gulosio
(-)-gulosio
H C OH
CH2OH
D-idosio
(-)-idosio
HO C H
H C OH
CHO
H
HO C OH
HO C OH
H
HO C OH
H
H C OH
CH2OH
CH2OH
D-galattosio
D-talosio
(+)-galattosio
(+)-talosio
MONOSACCARIDI: D-chetosi
CH2OH
C O
CH2OH
diidrossiacetone
diidrossiacetone
CH2OH
C O
H C OH
CH2OH
CH2OH
D-eritrulosio
(-)-eritrulosio
CH2OH
C O
C O
H C OH
HO C H
H C OH
H C OH
CH2OH
CH2OH
D-xilulosio
(+)-xilulosio
D-ribulosio
(+)-ribulosio
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
C O
C O
C O
C O
H C OH
HO C H
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH2OH
D-fruttosio
(-)-fruttosio
D-sorbosio
(+)-sorbosio
D-tagaosio
(-)-tagatosio
D-psicosio
(+)-psicosio
HO C H
HO C H
H C OH
HO C H
H C OH
DISACCARIDI
maltosio
(4-O-a-D-glucopiranosil-b-D-glucopiranosio)
lattosio
(4-O-a-D-glucopiranosil-b-D-galattopiranosio)
cellobiosio
(4-O-b-D-glucopiranosil-b-D-glucopiranosio)
saccarosio
(1-O-a-D-glucopiranosil-b-D-futtofuranosio)
POLISACCARIDI
AMIDO
È il materiale di riserva energetica dei vegetali. È costituito dal polimero
lineare amilosio (20%) e dal polimero ramificato amilopectina (80%). L’amilosio
è una catena lineare, avvolta ad elica, di molecole di a-glucopiranosio unite
con legami glucosidici di tipo a-1,4; le doppie eliche sono stabilizzate da
legami a H. Nell’amilopectina la catena lineare ha anche delle ramificazioni
di tipo a-1,6 con formazione di una struttura a grappolo.
OH
O
HO
O HO
O
1a
HO
OH O 4a
HO
O
OH
amilosio
O
OH
O
O
HO
OH
O
HO
O
HO
O
OH HO
1a
OH
O
punto di ramificazione
6a O
OH
O
HO
OH
O
OH
HO
O
O
amilopectina
CELLULOSA
È il componente principale delle fibre alimentari che derivano dal tessuto
fibroso delle pareti cellulari dei vegetali. È una catena lineare di molecole di
b-glucopiranosio unite con legami b-1,4 (b-cellobiosio). I legami a H si
formano all’interno di una catena o tra due catene diverse. L’aggregazione
di 50-100 molecole forma una fibrilla elementare (micella), quella di circa 20
fibrille elementari forma una microfibrilla e quella delle microfibrille una
macrofibrilla.
OH
HO
O
O
HO
HO
O
OH
1b
4b
OH
O
O
HO
OH
cellulosa
macrofibrilla
microfibrilla
microfibrilla
fibrilla
fibrille
elementare
elementari
O
OH
O
STRUTTURA DELLA PARETE CELLULARE DI UN VEGETALE
++
Ca++
Ca
++++
Ca
Ca
pectinapectina
emicellulosa
emicellulosa
estensina
microfibrilla
microfibrilla
estensina
di cellulosa
di cellulosa
EMICELLULOSA
È un altro componente del tessuto fibroso delle pareti cellulari dei vegetali
ed è costituita da un polimero misto, di 20-100 molecole, ramificato,
costituito da aldoesosi (glucosio, mannosio e galattosio) e aldopentosi (xilosio e
arabinosio). Le molecole si legano prevalentemente con legami a-1,4, ma
anche a-1,6 e a-1,3. La struttura dell’emicellulosa conferisce alla sostanza
una spiccata idratabilità.
ESTENSINA
È una glicoproteina (glicano) nella cui catena proteica alcuni residui
amminoacidici della idrossiprolina si legano a 10-100 molecole di zuccheri
(glucosio, galattosio, xilosio, mannosio, fucosio). È questa struttura che
determina l’elevata elasticità della estensina.
LIGNINA
È un altro componente del tessuto fibroso delle pareti cellulari dei vegetali.
È costituto da una complessa e variabile polimerizzazione di numerosi
derivati del p-idrossifenilpropano.
CH2OH
CH2
CH2
OH
CH3
CH
CH
OCH3
CH3O
O
H C CH CH2OH
O
CH
CH
CH2OH
H C OH
O
HC
CH2OH
O
OCH3
OH
HO C H
HC
H2C
O
CH3O
OH
CH3O
HC
HC
CH2
O
O
CH2OH
CH
CH
O
OCH3
CH2
CH
CH
Carboidrato
CH3O
O
OCH3
CH3O
O
CH
CH
CH2OH
O
OCH3
O
C O
CH
CH2OH
CH2OH
CH
HO CH
CH2OH
CH3O
CH
HC
OH
OCH3
O
OH
GLICOGENO
È il polisaccaride di riserva delle cellule animali del fegato e dei muscoli
scheletrici. È costituito da catene lineari di glucopiranosio unite da legami
glucosidici di tipo a-1,4 e da ramificazioni di tipo a-1,6. Il glicogeno ha
dunque una struttura simile a quella dell’amilopectina, ma più ramificata.
OH
O
O
HO
OH
OH
O
O
OH
O
HO
OH
O
OH
O
O
HO
O
OH
OH
O
HO
O
OH
glicogeno
O
L’enzima a-1,4-fosforilasi idrolizza i legami a-1,4 delle catene lineari,
liberando una molecola di glucosio (in forma di a-D-glucopiranosil-1fosfato) per volta a partire dalle estremità terminali, fino al 4 unità di
zucchero dal punto della ramificazione. L’enzima transferasi veicola 3
molecole di zucchero in coda all’altro ramo della ramificazione ed infine
l’enzima a-1,6-glucosidasi stacca l’ultima molecola di glucosio con
formazione di una catena lineare che, ora, può essere idrolizzata dalla a-1,4fosforilasi.
Le molecole di glucosio prodotte dal glicogeno formano, per glicolisi, acido
piruvico. In ambiente aerobico l’acido piruvico viene ossidato a CO2+H2O
ma, in ambiente povero di ossigeno, viene ridotto d acido lattico. Alcuni
lieviti anaerobici lo convertono in etanolo (bioetanolo).
O2
H2O + CO2
CH3
H C OH
C
O
OH
CH3
C O
C
O
OH
lieviti
CH3CH2OH
REAZIONI ENZIMATICHE
DEL GLICOGENO
a-1,4-fosforilasi
a-1,6-glucosidasi
transferasi
CELLULA VEGETALE
lamella mediana
(pectine, gomme)
parete primaria
(cellulosa, emicellulosa, lignina)
membrana
citoplasmatica
vacuolo
nucleo
amiloplasto
cloroplasto
amido
parete secondaria
(cellulosa, emicellulosa, cutina, suberina, lignina, CaCO3)
CELLULA ANIMALE (FEGATO)
membrana
citoplasmatica
glicogeno
RUOLO BIOLOGICO DEI CARBOIDRATI
HO
O
HO
O
OH O
OH
HO
O HO
OH
O
O
HO
pectina
++
++
Ca
Ca
OH
O
O
HO
emicellulosa
O
1a
HO
4a
estensina
microfibrilla
di cellulosa
OH
O
O
O
OH HO
OH
O
HO
OH
O
OH
HO
O
O
CELLULOSA, EMICELLULOSA, ESTENSINA
elementi strutturali
AMIDO E GLICOGENO
riserve energetiche
OH
O
POLIOLI
Sono composti poliossidrilici a 5 o 6 atomi di carbonio, diffusi in natura, ad
azione edulcorante.
H
HO
H
H
CH2OH
C OH
C H
C OH
C OH
CH2OH
D-(-)-sorbitolo
H
HO
H
H
CH2OH
C OH
C H
C OH
C OH
CH2OH
D-(-)-mannitolo
CH2OH
H C OH
H C OH
H C OH
CH2OH
D-xilitolo
CH2OH
H C OH
HO C H
H C OH
CH2OH
D-(-)-ribitolo
POLIOLI (SINTETICI)
Sono edulcoranti sintetici nei quali una molecola di monosaccaride è legata
ad una molecola di un poliolo. Sono zuccheri ipocalorici, non-cariogeni.
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
HO
OH
OH
CH2OH
HO C H
H C OH
HO
O
C H
O
HO C H
CH2OH
OH OH
a-glucopiranosil-1,4-sorbitolo
maltitolo
C H
O
HO C H
CH2OH
a-galattopiranosil-1,4-sorbitolo
lattitolo
HO
CH OH HO
O
H
+
H
OH
HO
O
OH
2
a-glucopiranosil-1,6-D-sorbitolo
(anidro)
CH OH
H
H
OH
OH
CH2
2
CH OH
OH
H
OH
OH
CH2
2
2
H
CH OH HO
O
H
H
OH
HO
O
OH
HO C H
H C OH
a-glucopiranosil-1,1-D-mannitolo
(diidrato)
isomalto
CARBOIDRATI NEGLI ALIMENTI
L’Istituto Nazionale di Ricerca per gli Alimenti e la Nutrizione (INRAN) ha
suddiviso gli alimenti nelle seguenti categorie:
• Cereali e derivati
• Legumi
• Verdure ed ortaggi
• Frutta
• Carni fresche
• Carni trasformate e conservate
• Fast-food a base di carne
• Frattaglie
• Prodotti della pesca
• Latte e yogurt
• Formaggi e latticini
• Uova
• Oli e grassi
• Dolci
• Prodotti vari
• Bevande alcoliche
All’indirizzo: http://www.inran.it, cliccando “Banche dati” e poi “Banca
Dati di composizione degli alimenti”, si possono consultare le composizioni
medie dei nutrienti di tutte le categorie di alimenti elencate.
CORNFLAKES
(100 g)
•
•
•
•
acqua
proteine
lipidi
carboidrati
5,00 g
6,60 g
0,80 g
87,30 g
• minerali
0,24 g
• vitamina A
0,3 mg
amido:
70,0 g
zuccheri: 13,5 g
fibre:
3,8 g
Na:
K:
Ca:
Fe:
P:
11 mg
99 mg
74 mg
3 mg
58 mg
CARBOIDRATI E POLIOLI IN MATERIE PRIME DESTNATE
ALL’ALIMENTAZIONE UMANA
MONOSACCARIDI
• glucosio
frutta, verdura, ortaggi, miele, uva
• fruttosio
frutta, miele, uva
• galattosio
uva
DISACCARIDI
• saccarosio
frutta, canna da zucchero, barbabietola da zucchero, uva
• lattosio
latte, prodotti lattiero-caseari (formaggi, burro, yogurt)
• maltosio
cereali, frutta (datteri), tuberi (patata americana), miele
POLISACCARIDI
• amido
semi di cereali, legumi, tuberi, frutta (noci., castagne)
• cellulosa
frutta, legumi, verdure, ortaggi, soia
POLIOLI
• sorbitolo
• mannitolo
• xilitolo
frutta (mele, pere, prugne, ciliegie, sorbo), bacche, alghe
alghe, funghi, betulla, frassino da manna
frutti di bosco (fragole, lamponi), frutta (prugne), ortaggi
ANALISI DEI CARBOIDRATI NEGLI ALIMENTI
La determinazione qualitativa e quantitativa dei carboidrati è importante
per 5 motivi:
1.
2.
3.
4.
5.
controllo della qualità delle materie prime, dei semilavorati e dei
prodotti finiti;
controllo della genuinità degli alimenti;
controllo della conformità degli alimenti rispetto le leggi vigenti;
identificazione di dolcificanti, addensanti, surrogati dei grassi negli
alimenti;
monitoraggio del processo di fermentazione (conversione degli
zuccheri in etanolo ad opera dei lieviti) nella produzione di bevande
alcoliche.
Le maggiori performances della HPLC rispetto quelle ottenute con la GC
hanno determinato, specialmente negli ultimi anni, la sostituzione quasi
completa della gascromatografia con la cromatografia liquida.
HPLC vs GC
HPLC
GC
idonea per carboidrati di peso medio-alto
idonea per monosaccaridi
tempi di analisi più brevi (circa 50%)
separa gli anomeri a e b
quali-quntitativa
più sensibile
non richiede derivatizzazioni
richiede derivatizzazioni
1. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
I campioni da analizzare possono essere di natura talmente complessa
(prodotti lattiero-caseari, succhi di frutta, ecc.) da richiedere 2 steps:
estrazione e purificazione
a) ESTRAZIONE
Viene fatta un’estrazione liquido-liquido evitando l’acqua come unico
solvente perché estrarrebbe una grande quantità di composti polari
(amminoacidi, proteine, acidi liberi a basso peso molecolare, ecc.). Nel caso
dei carboidrati a maggior peso molecolare l’estrazione più comune impiega
EtOH/H2O o MeOH/H2O (80/20) ad alta temperatura (a reflusso) o a
temperatura ambiente, per un numero di volte (4-5) sufficienti ad estrarre
tutti i carboidrati dalla matrice (assenza rivelata con saggio colorimetrico).
b) CLEANUP
Numerosi fattori condizionano la scelta della procedura di purificazione:
• solvente di estrazione
• concentrazione di carboidrati presenti in relazione alle sostanze
interferenti
• complessità della matrice di partenza
Le procedure più frequentemente utilizzate nell’analisi dei carboidrati
sono:
1. AGENTI CHIARIFICANTI
L’obiettivo è di fare precipitare le proteine e/o gli acidi grassi liberi che
potrebbero sovrapporsi ai carboidrati. L’eccesso di chiarificante deve essere
rimosso perché può interferire nella HPLC. È il caso dell’acetato di piombo,
molto utilizzato nell’analisi tradizionale degli zuccheri, il cui eccesso viene
eliminato mediante cromatografia di scambio ionico.
2. PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI
Quando il solvente di estrazione è soltanto acqua, l’estratto contiene anche
composti polari (sali, amminoacidi, ecc.) che vengono fatti precipitare, ad
esempio, con una miscela di (CH3COO)2Pb/CH3CN.
Anche le macromolecole idrosolubili che possono interferire con gli
zuccheri vengono rimosse per semplice precipitazione con un solvente
organico, per esempio CH3OH, sebbene una parte di carboidrati rimanga
adsorbita sul materiale precipitato, con una conseguente perdita di analiti.
L’ CH3CN viene impiegato nell’analisi dei mono- e disaccaridi nel latte e
nei prodotti lattiero-caseari, ma in generale è il solvente organico più
utilizzato nelle determinazioni degli zuccheri negli alimenti.
3. SCAMBIO IONICO
Negli alimenti possono essere presenti specie ioniche a basso ed elevato
peso molecolare che si trasferiscono nell’estratto idroalcolico. Il rischio di
picchi di overlapping è considerevole quando sono presenti sali e
amminoacidi, che eluiscono con tempi di ritenzione molto simili a quelli dei
carboidrati, mentre le proteine possono legarsi irreversibilmente alla fase
stazionaria, con conseguente più rapido deterioramento della colonna
cromatografica. In questi casi è sufficiente l’impiego di una resina a
scambio ionico che consente la rimozione di tutte le specie interferenti, ma
non dei carboidrati. Questa purificazione è adottata nell’analisi dei prodotti
a base di frutta (vini e succhi di frutta) perché non rimuove soltanto le
proteine e gli amminoacidi, ma anche gli acidi organici (tartarico, malico,
succinico, lattico, citrico, ecc.)
4. SPE
La silice funzionalizzata C18 (Sep-Pak) è un altro frequente metodo di
purificazione dell’estratto. Le cartucce per la “Solid Phase Extraction”
vengono utilizzate nella purificazione degli estratti ottenuti da matrici
molto complesse (cereali e derivati, latte e derivati, ecc.), anche in
considerazione del costo relativamente elevato di una cartridge (~ 5 €).
5. PRECOLONNA (Guard Column)
Una precolonna di 4-6 cm., narrow bore (2,0-2,5 mm) impaccata con una fase
stazionaria pellicolare, è in grado di trattenere i composti con una selettività
che dipende dal maggiore o minore carattere idrofobico della fase
stazionaria. La precolonna è utilizzata in alternativa od anche in
accoppiamento con la SPE.
6. COLUMN SWITCHING
È l’accoppiamento di 2 colonne di tipo diverso: nella prima, basata sulla
filtratione su gel, eluisce l’estratto totale, i cui costituenti si separano in
funzione della dimensione molecolare; nella seconda, basata sulla
cromatografia di partizione, viene introdotta ed eluita soltanto la frazione dei
carboidrati a basso peso molecolare.
COLUMN SWITCHING
gel filtration column
DETECTOR
impurezze
partition column
carboidrati
2. TECNICHE HPLC
La grande varietà di fasi stazionarie disponibili sul mercato consente di
utilizzare diverse tecniche HPLC:
a) FILTRAZIONE SU GEL
A causa dei tempi eccessivamente lunghi e della scarsa risoluzione, la GFC
viene utilizzata quasi esclusivamente nell’analisi dei polisaccaridi.
b) CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO
Le resine a scambio anionico e cationico sono state molto utilizzate in
passato; oggi, causa dei tempi eccessivamente lunghi dell’analisi e della
necessità di operare a temperature elevate, si è imposta la cromatografia di
partizione a fase legata.
c) CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE
• NPC con silice funzionalizzata NH2 (3-amminopropiltrietossisilano),
e fase mobile CH3CN/H2O. Questa tecnica è molto selettiva per i monoe disaccaridi, ma comporta la formazione di basi di Schiff con i gruppi
carbonilici degli zuccheri che rendono instabile la fase stazionaria.
• RPC con silice funzionalizzata C18 e fase mobile H2O. Questa tecnica è
poco efficace per i mono- e disaccaridi, ma è ideale per la separazione
degli anomeri degli oligosaccaridi.
2. RIVELATORI
a) A LUCE ULTRAVIOLETTA (UVD)
Le lunghezze d’onda a cui i carboidrati mostrano una assorbanza accettabile
(190-210 nm) coincidono con le lunghezze d’onda a cui assorbono anche
molti altri composti presenti negli alimenti e molti solventi impiegati come
fase mobile. Pertanto il rivelatore UV è di scarso impiego nell’analisi dei
carboidrati.
b) INDICE DI RIFRAZIONE (RID)
Nonostante la scarsa sensibilità, l’incompatibilità con l’eluizione a
gradiente, le possibili interferenze delle impurezze (se non è stato fatto un
buuon clean-up) e la notevole dipendenza della risposta dalla temperatura,
pressione e aria disciolta, il RID è ancora utilizzato.
c) A LUCE DIFFUSA IN EVAPORAZIONE (ELSD)
In considerazione dell’elevata sensibilità, della compatibilità con l’eluzione
a gradiente, della risposta lineare molto simile di tutti i carboidrati e della
risposta poco influenzata dalla temperatura e dalla velocità di flusso,
l’ELSD è attualmente il rivelatore più utilizzato nell’analisi dei carboidrati.
PRINCIPALI TECNICHE HPLC PER L’ANALISI DEI CARBOIDRATI
FASE MOBILE
FASE STAZIONARIA
MECCANISMO
DETECTOR
NaOH & H2O
resina a scambio
anionico
IEC
PAD
CH3CN/H2O
silice-NH2
NPC
RID
ELSD
• selettività per mono- e disaccaridi
H2O
silice-C18
RPC
RID
ELSD
• selettività per oligosaccaridi
• stabilità della colonna
H2O
resina a scambio
cationico
SEC
DPC
RID
ELSD
• selettività per monosaccaridi
IEC =
NPC =
RPC =
SEC =
PAD =
RID =
ELSD =
VANTAGGI
• selettività per mono- e disaccaridi
• sensibilità
ion exchange chromatography
normal phase chromatography
reverse phase chromatography
size exclusion chromatography
pulsed amperometric detector
refractive index detector
evaporative light-scattering detector
ANALISI DEGLI ZUCCHERI DI SUCCO DI MELA
3
1
1.
2.
3.
4.
2
oligosaccaridi
saccarosio
glucosio
fruttosio
4
0
8
16
24
min
COLONNA: 300 mm x 7,8mm, CARBOSep 0,5 mm
FASE MOBILE: eluizione isocratica con H2O
VELOCITA’ FLUSSO: 0,6 mL/min
TEMPERATURA: 90°C
DETECTOR: ELSD
ANALISI DEGLI ZUCCHERI DI SUCCO DI ARANCIA
2
3
4
1.
2.
3.
4.
1
0
6
12
min
COLONNA: 300 mm x 7,8mm, CARBOSep 0,5 mm
FASE MOBILE: eluizione isocratica con H2O
VELOCITA’ FLUSO: 0,6 mL/min
TEMPERATURA: 85°C
DETECTOR: ELSD
saccarosio
glucosio
fruttosio
sorbitolo
ANALISI DEI CARBOIDRATI DI CIPOLLA BIANCA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
COLONNA: 250 mm x 4,6 mm, HP Carbohydrate 0,4 mm
FASE MOBILE: eluizione isocratica con ACN:H2O = 75:25
VELOCITA’ FLUSSO: 1,0 ml/min
TEMPERATURA: 40°C
DETECTOR: ELSD
unknown
fruttosio
glucosio
saccarosio
kestosio
nistosio
ANALISI DI ZUCCHERI E POLIOLI (miscela standard)
12
3
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
5
4
7
6
8
9
0
10
20
raffinosio
saccarosio
lattosio
glucosio
galattosio
fruttosio
ribitolo
mannitolo
sorbitolo
min
COLONNA: 300 mm x 7,8 mm, CARBOSep COREGEL-87C 0,5 mm
FASE MOBILE: eluizione isocratica con H2O
VELOCITA’ FLUSSO: 0,6 mL/min
TEMPERATURA: 85°C
DETECTOR: ELSD