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Biotecnologie Farmacologiche e Basi molecolari dell’azione del farmaco AA 2010/11 Lezione 19 Adriana Maggi FARMACI BIOLOGICI Per la Comunità Europea, un composto o un farmaco biologico è definito come: “una sostanza che è prodotta o estratta da una sorgente biologica che richiede per la sua caratterizzazione e controllo di qualità una combinazione di analisi fisiche-chimiche e biologiche, insieme al processo di produzione e suoi controlli” (Dir. 2003/63/EC, part I, Section 3.2.1 (b)). FARMACI BIOTECNOLOGICI Farmaci biologici prodotti da cellule procariote o eucariote opportunamente modificate per opera di ingegneria genetica Considerando l’origine da organismi viventi sono da considerare come composti/farmaci biologici molti antibiotici, ormoni, enzimi, immunoglobuline, emoderivati… e tutti i farmaci prodotti grazie a tecnologie di ingegneria genetica: IL MINIMO COMUNE DENOMINATORE DI TUTTI QUESTI COMPOSTI E’ LA COMPLESSITA’ STRUTTURALE I biofarmaci hanno dimensioni e struttura molto più complesse dei prodotti chimici Prodotti biotecnologici Prodotti di sintesi Aspirina peso molecolare: 180 Da Interferone beta: peso molecolare: 19000 Da Proteine terapeutiche - Svantaggi 1. 2. 3. 4. 5. 6. nuove metodologie di produzione riproducibilità nella produzione purificazione della macromolecola di sintesi contaminanti nella purificazione stabilità del prodotto finito vie di somministrazione e farmacocinetica Proteine terapeutiche – Vantaggi 1. Generalmente esercitano una attività estremamente mirata e specifica 2. Data la loro specificità hanno limitati effetti collaterali indesiderati 3. Data la loro alta specificità ed essendo di origine umana sono generalmente ben tollerati 4. Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi bersagli terapeutici 5. Il tempo di approvazione da parte delle autorità regolatorie è significativamente inferiore a quello di molecole di sintesi (1 anno per 33 proteine/ 294 piccole molecole approvate tra 1980 e 2002 ) 6. La protezione brevettuale può essere più lunga di altri composti per le difficoltà di ottenere prodotti biosimilari Proteine terapeutiche di I e II generazione Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane Proteine di II generazione modificate al fine di: - - Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc) Generare prodotti innovativi con funzioni diverse da quelle originarie Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione Proteine di II generazione TNFa (Fattore di Necrosi Tumorale) una citochina che gioca un ruolo chiave nel danno infiammatorio in malattie autoimmuni o nella malattia di Crohn La prima di queste, l’ Etanercept (Enbrel), è una proteina di fusione dal peso molecolare di 150 kDa tra la forma solubile del recettore per il TNFalfa umano e la porzione Fc delle immunoglobuline umane IgG. Farmaci con funzione analoghe sono l’Infliximab (Remicade), un anticorpo monoclonale “chimerico” cioè in parte umano (frammento Fc umano) e in parte di derivazione murina (domini della catena variabile VK e VH) Adalimumab (HUMIRA) sviluppato molto recentemente che consta di un anticorpo interamente umanizzato. MODIFICAZIONI SECONDARIE CHE CAMBINO IL PROFILO DI IDROFOBICITÀ Possono migliorare il legame con proteine di trasporto plasmatiche di trasporto e quindi la residenza nel circolo: Insulina detemir della Novo Nordisk), interferone alfa, peptide GLP1, desmopressina (legame di acidi grassi a residui attivi sulla superficie della proteina) AGGIUNTA DI POLIETILENGLICOLE (PEG) PER AUMENTARE LE DIMENSIONI DELLA PROTEINA E RIDURNE IL METABOLISMO E CLEARENCE RENALE Analoghi del GH : Pegvisomant Analogo ricombinante di hGH - lys 120 sostituita con una gly previene la dimerizzazione funzionale del recettore qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione: Promotore della crescita Þ antagonista GH - Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a 4 - 6 catene di polietilen-glicole Aumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorni Picco plasmatico 33 - 77 ore Ridotta immunogenicità la pegilazione maschera i determinanti antigenici Ridotta affinità di legame altri otto aminoacidi sostituiti La complessità strutturale dei biofarmaci richiede una complessità nella produzione Produzione di proteine terapeutiche Processi diversi danno luogo a prodotti non identici tra loro Il prodotto finale è il risultato di numerose scelte INIZIO FINE La scelta della sequenza genica La scelta del downstream processing Typical Protein Production Process La scelta del vettore La scelta dell’organismo per la produzione La scelta delle condizioni di fermentazione Difficoltà nella produzione di biofarmaci • Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. • Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento nell’impianto pilota • Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. • Controllo delle condizioni di produzione • Recupero e produzione • Caratterizzazione del prodotto CONTROLLO QUALITA’ Difficoltà nella produzione di biofarmaci Controllo di qualità di proteine terapeutiche Caratterizzazione della proteina Determinazione dello stato di purezza Saggio biologico SDS PAGE/Western Saggio immunologico HPLC SDS PAGE Western Presenza di proteine seriche Isoelectrofocusing Presenza di proteine cellulari HPLC Presenza pirogeni Mappa peptidica Presenza di DNA cellulare Sequenziamento N-terminale Spettrometria di massa Composizione in carboidrati Composizione in acido sialico Microeterogeneità di proteine terapeutiche collegate alla biologia del prodotto o al processo produttivo process related, undesired modifications of side chains (e.g.,carbamylation, citraconylation) artifical, desired modification (e.g. pegylation) process related, undesired modifications of amino acids (e.g., oxidation, deamidation pyroglutamate formation) biologic, undesired modifications (e.g., methylation, acetylation, formylation, proteolysis) biologic, desired modifications (e.g., glycosylation, phosphorylation, sulfatation, acylation) process related, undesired modifications of the tertiary and quaternary structure (e.g., partial denaturation, aggregation) L’esempio del : t-PA (527 amino-acid protein; 17 S-S bridges; 3 glycosylation sites) Eterogeneità determinate per via sperimentale Variability in N-linked carbohydrate side chains Oxidation of Cys or Met residues Deamidation of Asn residues Additional O-Glycosylation Proteolysis at Arg-X Single-chain and two-chain forms N-terminal sequence length variation NH2 References available COOH Total possible variants: 1.09 x 109 Spesso i farmaci biotecnologici sono costituiti da una miscela di isoforme Isoelectric Focusing: glycosylated product is subfraction of cell culture isoforms In-vivo Bioactivity 400000 14 13 12 11 10 350000 300000 [U/mg] Cell Pure Culture Bulk 250000 200000 150000 100000 50000 0 5 7 8 9 10 11 12 Isoform Number 13 14 Eritropoietina sintetizzata da diversi laboratori Different biophysical characteristics when compared to the innovator product (Eprex®) Source: Schellekens H, EJHP, 3/2004, Scientific Section, pp 43-47. Cosa sappiamo delle risposte cliniche a “piccole” variazioni nelle molecole sintetizzate da diversi laboratori? Experience from Innovators and manufacturing process changes Tissue Plasminogen Activator (tPA) - Genentech • Roller bottle to a fed batch process (new cell line, new downstream processing and new formulation) • Analytics showed different carbohydrate structures; clinical studies showed impact on PK and efficacy • This led to a delay in clinical development whilst differences were further investigated Lenercept - Genentech • Scaled-up the manufacturing process that led to less sialylation of the protein • In clinical studies, this was shown to impact the PK and increase the immunogenicity • The project was terminated Raptiva - Genentech • Scaled-up the process before conducting phase 3 clinical studies and found small analytical differences • No differences in nonclinical PK. In clinical studies AUC had increased by 30% and efficacy had decreased • Phase 3 study repeated Eprex – J&J • Formulation change; no analytical differences observed • Resulted in >180 cases of pure red cell aplasia (PRCA) in renal failure patients (175/191 Eprex) • SC route of administration contraindication; further drug product changes; 20,000 patient registry Due farmaci con meccanismo d’azione apparentemente identico Adalimumab e Infliximab : legame selettivo con il TNFa e conseguente blocco della interazione con i recettori del TNF, p55 e p75 Etanercept: inibizione competitiva del legame del TNF ai recettori di superficie, che previene le risposte cellulari mediate dal TNF rendendo il TNF biologicamente inattivo Due farmaci con meccanismo d’azione apparentemente identico Apparente maggiore efficacia di moAb anti-TNF vs Etanercept Ma risposta clinica a Etanercept in alcuni casi nonresponsivi a Infliximab Blocco TNFa e b vs a solo Dosaggi diversi? Effetto biologico diverso? (efficacia in m. granulomatose, i.e. Crohn) Biosimilari in quanto sono simili, non identici, ai prodotti originali copiati EMEA Guidelines • “It is not expected that the quality attributes … will be identical” • “Minor differences in the active substance, such as variability in post-translational modifications may be acceptable, however, must be justified” • “there may be subtle differences between biosimilars” These differences can have clinical implications eg. different efficacy or safety Perchè biosimilare e non generico • Biosimilar, Follow-on Biologic, Follow-on Protein, Subsequent Entry Biologic ……. • Prodotto biologico che vuole essere assimilabile a un prodotto biologici innovativo il cui brevetto è scaduto. Tuttavia, la produzione del biosimilare – Avviene da parte di ditte diverse dalla Ditta originaria detentrice del brevetto – Richiede un nuovo orgaismo per la produzione, un nuovo processo produttivo, nuovi metodi analistici • I primi biosimilari: – Omnitrope® (somatropin) in Australia, EU e USA – Valtropin® (somatropin) in EU – NON esistono prodotti-copia in Asia e in S. America Leggi e regolamenti L’European Medicines Agency (EMEA) nel 2004 ha elaborato una serie di direttive per l’approvazione di farmaci biosimilari : i primi tre farmaci biosimilari approvati in Europa sono stati: 1. Ormone della crescita 2. Eritropoietina 3. Granulocyte-colony stimulating factor Nell’ottobre 2010 i funzionari EMEA hanno iniziato a prendere in considerazione la legislazione per l’immissione sul mercato di anticorpi monoclonali (mercato globale 36,4 miliardi di US$): nel 2013 scade il brevetto del Rituximab (mercato globale 5,6 milioni di US$) Biosimilar views outside the EU Omnitrope® (somatropin) - Sandoz Different opinions in different regions Australia Genotropin • Children; GHD • Adults; GHD • Turner syndrome • Prader-Willi syndrome Omnitrope • Children; GHD • Turner syndrome • Growth disturbance; renal insufficiency Europe Genotropin • Children; GHD • Adults; GHD • Turner syndrome • Prader-Willi syndrome • Children small for gestational age • Growth disturbance renal insufficiency Omnitrope • Children; GHD • Adults; GHD • Turner syndrome • Prader-Willi syndrome • Children small for gestational age • Growth disturbance; renal insufficiency United States Genotropin • Children; GHD • Adults; GHD • Prader-Willi syndrome • Children small for gestational age Omnitrope • Children; GHD • Adults; GHD Omnitrope Clinical Programme • Phase 1 (PK/PD) • 3 studies in healthy volunteers; n = 60 • Phase 3 • 1 study in children with GHD; n = 89 Post- approval commitments (EU) • • • • Safety in children small for gestational age Safety in children with Prader-Willi syndrome Occurrence of malignancy Occurrence & impact of anti-GH antibodies United States Legal and Regulatory Status Legal basis for approval Food, Drug & Cosmetics Act (FDCA) • Several provisions for abbreviated approvals • eg. Hatch-Waxman for drugs • Biologics are specifically excluded • 505(b)2 offers a pathway for FDCA proteins eg. Omnitrope Public Health Service Act (PHSA) • Majority of biologics approved under this act • PHSA does not have provisions for abbreviated approvals • Congress discussing legislative pathway now (proposed legislation under debate) • FDA has published a “white paper” 4 and testified at Congressional hearings • Science allows a legal and regulatory pathway to be established • Generics principles cannot be applied • Data exclusivity provisions for innovators (proposals range from 0 to 14+ years) Outstanding issues Issues still being addressed in Europe Interchangeability (ie. automatic substitution) Pharmacovigilance & Traceability Prescribing Information Non-proprietary Names Should or can we adopt the same “automatic substitution” principles that we have in place for small-molecule generics? Generic principles are based on the active substance being identical – biosimilars will be similar, not identical “to support pharmacovigilance monitoring, the specific medicinal product given to the patient should be clearly identified” 1 Decisions/guidance on how this will work in practice still pending What information should be provided to healthcare providers and patients – should we follow the generic model? Transparency seems to be ultimate direction ie. not generic model eg. clinical data for approval, advice on substitution On-going debate at international level Questions centre on role of INN in clinical practice ie. prescribing/dispensing and pharmacovigilance WHO decision expected in late 2007 Conclusioni Conclusioni • Biosimilari sono una nuova classe di prodotti medicinali – Non sono generici come inteso per le piccole molecole di sintesi • L’ EMEA ha stabilito ottimi standard per l’approvazione – Una serie di importanti domande deve trovare una risposta solo dopo l’approvazione • Rimangono punti di discussione che riguardano l’introduzione dei biosimilari nella pratica clinica – Regole per la sostituibilità automatica – Farmacovigilanza – Labelling – Scelta del nome • La comunità medica deve avere la piena consapevolezza delle problematiche legate all’uso di biosimilari References 1. 2. 3. 4. EMEA guidelines for similar biological medicinal products. Available at http://www.emea.europa.eu/htms/human/humanguidelines/multidiscipline.htm European Public Assessment Report (scientific assessment) for Omnitrope. http://www.emea.europa.eu/humandocs/Humans/EPAR/omnitrope/omnitrope.htm European Medicines Agency Questions and Answers on recommendation for refusal of marketing application for Alpheon. http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/opinion/19089606en.pdf The FDA’s assessment of follow-on protein products: a historical perspective Nature Reviews Drug Discovery, published online 13 April 2007; doi:10.1038/nrd2307 http://www.nature.com/nrd/journal/vaop/ncurrent/pdf/nrd2307.pdf FARMACI INTELLIGENTI (TARGETED THERAPY) …..ogni terapia, per definizione, ha un bersaglio. forse ad oggi non abbiamo ancora compreso tutti i bersagli esatti da colpire, purtroppo i nostri pazienti soffrono ancora per questa mancanza… George W. Sledge, Jr; J Clin Oncol, 2005 Initiating event hyperproliferation inflammation resist. to deathECM remodeling migration angiogenesis invasion lynphoangiogenesis .. ma per molte neoplasie il bersaglio è ben definito estrogen receptor in an infiltrating ductal carcinoma Alterazioni della funzione di geni che giocano un ruolo importante nell’origine e patogenesi delle neoplasie umane. Tre categorie principali di alterazioni delle funzioni geniche sono alla base della progressione tumorale; queste comprendono • geni che codificano per proteine “sopressore” • geni che codificano enzimi per il riparo del DNA • oncogeni COSA SI INTENDE PER TARGETED THERAPY Una terapia con un bersaglio molecolare ben definito La “targeted therapy” dovrebbe agire su un processo biologico rilevante (generalmente, anche se non sempre, su una singola molecola) preferibilmente il processo caratteristico della patologia da curare. Il bersaglio dovrebbe poter essere misurabile clinicamente e la misura dell’effetto della terapia sul bersaglio dovrebbe correlare con lo stato di salute del paziente. TARGETED THERAPY – LE MOLECOLE Molecole di piccole dimensioni-farmaci più tradizionali • Imatinib mesylate (Gleevec, also known as STI–571) • Gefitinib (Iressa, also known as ZD1839), targets the epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase • Erlotinib (marketed as Tarceva). Erlotinib inhibits epidermal growth factor receptor • Bortezomib (Velcade) is an apoptosis-inducing drug that causes cancer cells to undergo cell death by interfering with proteins. • Newer BCL-2 antagonists (e.g. Gossypol). • The selective estrogen receptor modulator tamoxifen has been described as the foundation of targeted therapy Farmaci biologici – anticorpi monoclonali (chimerici-umanizzati-umani) • Rituximab targets CD20 found on B cells. • Trastuzumab (Herceptin) targets the Her2/neu (also known as ErbB2) receptor • Cetuximab (marketed as Erbitux) targets the epidermal growth factor receptor. • Bevacizumab (marketed as Avastin) targets circulating VEGF ligand Targeted therapy Un trattamento che utilizza farmaci o altre sostanze, quali anticorpi monoclonali, per identificare e agire selettivamente sulla cellula neoplastica …. …..non mirato a colpire tutte le cellule in mitosi (es. la chemioterapia più tradizionale) Targeted therapy deve avere minori effetti collaterali rispetto a trattamenti più tradizionali. Dictionary of Cancer Terms National Cancer Institute USA ALLA TERAPIA MIRATA OCCORRE AFFIANCARE METODI PRECISI: • PER L’IDENTIFICAZIONE DEL PAZIENTE • PER LA IMMEDIATA VERIFICA DELLA EFFICACIA DEL TRATTAMENTO FARMACOGENETICA Il prossimo obiettivo per le “targeted therapies” sarà l’identificazione dei pazienti che possono rispondere al meglio alla terapia. La via per l’identificazione di questesottopopolazioni sono marcatori e “molecole di misura” surrogati. Tecnologie per l’analisi dell’immagine applicabili alla verifica degli effetti positivi del trattamento in tempi reali IL COSTO DEI FARMACI INTELLIGENTI ricerca biologica trattamento di pazienti
