XX ciclo di Dottorato di Ricerca in Neuroscienze
Indirizzo Neurologia, Psichiatria e Neurogenetica
Massimo Acquaviva
Relazione III anno
Docente tutor: Dott.ssa Emilia Bellone
Titolo del progetto - Malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2: analisi molecolare di geni
responsabili delle forme a trasmissione autosomica dominante e autosomica recessiva.
Scopo del progetto: formalizzazione di una analisi genetico-molecolare sistematica dei geni
responsabili della malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2.
Abstract - La forma assonale della malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT2) è geneticamente
eterogenea con modalità di trasmissione sia autosomica dominante sia autosomica recessiva.
Diversamente dalla CMT1, per la quale sono ben noti i difetti molecolari alla base del
fenotipo demielinizzante, i geni associati alla CMT2 sono stati identificati solo recentemente.
In questo studio è stato effettuato l’analisisi mutazionale del gene MFN2, le cui mutazioni
sono responsabili del 25% circa dei casi di CMT2. Mutazioni in questo gene sono state
riportate in associazione a forme autosomiche dominanti di CMT2 ad insorgenza precoce e
tardiva; in alcuni casi è presente il coinvolgimento del sistema nervoso centrale.
In una coorte di 150 pazienti CMT2 privi di una definizione molecolare sono state, ad oggi,
identificate 6 mutazioni in 10 pazienti. Due di queste mutazioni sono già state descritte in
letteratura come associate a patologia. Le rimanenti quattro rappresentano nuove varianti non
ancora riportate come mutazioni associate a malattia. Viene discusso il possibile ruolo
patogenetico di queste varianti.
Risultati ottenuti nel III anno
L’attività di ricerca del candidato si è focalizzata principalmente sull’analisi molecolare
del gene mitofusin 2 (MFN2), le cui mutazioni rappresentano il 13-20% delle neuropatie
ereditarie sensitivo motorio di tipo assonale (CMT2) e per il quale non è stato ancora
riportato un dato preciso relativo alla frequenza di mutazione nella popolazione italiana.
Analisi molecolare gene MFN2
È stato recentemente riportato in diversi studi (K.W.Chung et al., 2006; Zuchner et al., 2006)
che mutazioni nel gene MFN2 hanno un ruolo significativo nella patogenesi della CMT2A e
della HMSN di tipo VI, in cui la neuropatia assonale è associata ad atrofia ottica.
Il gene nucleare MFN2 codifica per la proteina Mitofusina 2, coinvolta nel processo di
fusione mitocondriale. Il gene è costituito da 19 esoni, dei quali, i primi due sono trascritti ma
non tradotti.
La mitofusina è una proteina mitocondriale transmembrana conservata nell’evoluzione che
presenta un dominio N-terminale ad attività GTPasica e due domini coiled coil, dei quali uno
localizzato al C-terminale. La fusione mitocondriale è strettamente dipendente dall’attività
della mitofusina 2 ed è un processo indispensabile per la morfologia, la dinamica e la
localizzazione spaziale dei mitocondri nei distretti cellulari a maggiore richiesta energetica.
La maggioranza delle mutazioni descritte risiede nei tre domini e nelle regioni fiancheggianti .
Era stato precedentemente effettuato dal candidato il disegno dei primers in modo da ottenere
amplicons con temperatura di melting omogenea e di lunghezza tale (circa 300 bp) da poter
essere utilizzati sia per l’analisi con DHPLC sia per il successivo sequenziamento automatico
(vedi tabella 2). Il DHPLC lavora in condizioni di parziale denaturazione e il frammento di
DNA in analisi deve essere mantenuto in tali condizioni per tutta la sua lunghezza. Questo ha
reso necessario una scelta dei primers mirata a definire la lunghezza degli amplicons in modo
da utilizzare il minor numero possibile di temperature di melting per l’analisi.
Risultati ottenuti nel III anno
1. Ampliamento del database, già definito nel corso del primo anno, grazie al
reclutamento di nuovi pazienti con neuropatia assonale (CMT2). Tale
reclutamento è stato effettuato tramite l’Ambulatorio Integrato per lo studio delle
Neuropatie periferiche dell’Università di Genova e tramite la collaborazione con
l’Unità Operativa di Neuropsichiatria Infantile dell’Istituto Gaslini di Genova.
2. L’analisi molecolare è stata effettuata in 150 casi indice con una neuropatia
assonale, sia isolati sia familiari e privi di una definizione molecolare.
3. L’analisi ha riguardato, ad oggi, gli esoni 1-10 (numerati 3-12, come da
nomenclatura ufficiale)
4. L’analisi mutazionale è stata effettuata secondo le seguenti fasi:
a. Isolamento della regione codificante di ciascun gene incluse le giunzioni
introne-esone, mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
b. effettuazione dello screening mediante Denaturing High Performance Liquid
Chromatography (DHPLC).
c. sequenziamento diretto delle varianti cromatografiche su sequenziatore
automatico
Varianti dell’esone 4
In quattro pazienti si è osservata un’alterazione nel profilo di eluizione dell’esone 4. L’esone
4 rappresenta un hot spot di mutazione, localizzato nella regione immediatamente adiacente
agli esoni che codificano per il dominio GPTasico.
Il successivo sequenziamento delle varianti ha evidenziato la stessa mutazione
(c.281G→A), già descritta in letteratura (Verhoeven et al., 2006), in due pazienti non
correlati. Questa variante nucleotidica porta al cambiamento amminoacidico Arg94Gln.
Entrambi i pazienti presentano un esordio precoce di malattia (3 e 7 anni) con disturbi
della deambulazione e frequenti cadute. In entrambi i casi la malattia presenta una
progressione lenta con iniziale coinvolgimento degli arti superiori. L’analisi molecolare
effettuata in entrambi i genitori dei probandi non ha dimostrato la presenza della
mutazione Arg94Gln. In entrambi i casi si tratta quindi di una mutazione de novo.
In due pazienti appartenenti alla stessa famiglia è stata invece identificata la mutazione
c.280 C→T, già descritta in letteratura (Zuchner et al, 2004; Zuchner et al, 2006), che
interessa sempre il residuo di Arginina in posizione 94, determinando il cambio
amminoacidico Arg94Trp. Questa variante è stata descritta in associazione ad atrofia
ottica.
Anche in questo caso i pazienti presentano un esordio precoce dei sintomi (5 e 13 anni)
con disturbi della deambulazione. Il paziente più giovane, all’età dell’ultima osservazione
(28 anni), presentava un quadro clinico più grave del fratello, con coinvolgimento degli
arti superiori e necessità di tutori rigidi per la deambulazione. In entrambi i casi non sono
stati osservati segni di atrofia ottica, che peraltro esordisce di solito più tardivamente. La
trasmissione è presumibilmente di tipo autosomico dominante ma non è stato possibile
effettuarne la conferma.
Varianti dell’esone 8
Sono state identificate due differenti varianti dell’esone 8 in due pazienti non correlati.
L’esone 8 codifica per parte del dominio GTPasico della mitofusina, regione indispensabile
per la sua funzione, con sequenza e struttura molto conservata nel corso dell’evoluzione.
In un paziente è stata identificata una variante (c.746 C→G ) non ancora descritta in
letteratura che porta al cambiamento amminoacidico Ser249Cys.
La sostituzione di un residuo piccolo e polare come la Serina con un residuo di Cisteina in
grado di formare ponti disolfuro e di conseguenza alterare la conformazione della
proteina, è verosimilmente patogenetica.
Si tratta di un paziente con esordio a 16 anni con algie agli arti inferiori. Il quadro clinico
è caratterizzato da una progressione rapida e da una maggiore compromissione sensitiva
rispetto a quella motoria.
La trasmissione della patologia all’interno della famiglia è compatibile con una
trasmissione autosomica dominante ma non è stato possibile verificare la segregazione
della mutazione all’interno del nucleo familiare.
In un altro paziente è stata identificata una variante non descritta in letteratura (c.810
G→A) che porta alla sostituzione amminoacidica Met270Ile. Si tratta di un paziente con
probabile trasmissione dominante della malattia (viene riferita affetta la madre del
probando,deceduta), con esordio della neuropatia a 9 anni con difficoltà della
deambulazione e faticabilità muscolare. Il decorso clinico è lentamente progressivo.
Entrambe le varianti dell’esone 8 di MFN2 rappresentano mutazioni nuove, non
precedentemente riportate in letteratura. Entrambe non sono state identificate in 200
cromosomi normali di controllo.
Entrambi i residui interessati risultano estremamente conservati nell’evoluzione, sia nella
mitofusina 2 che nella mitofusina 1, essendo presumibilmente indispensabili all’attività
GTPasica della proteina.
S249C
MFN2_HUMAN
MFN2_RAT
MFN2_MOUSE
MFN1_RAT
MFN1_MOUSE
MFN1_HUMAN
M270I
FHKVSERLSRPNIFILNNRWDASASEPEYMEEVRRQHMERCTSFLVDELGVVDRSQAGDR
FHKVSERLSRPNIFILNNRWDASASEPEYMEEVRRQHMERCTSFLVDELGVVDRAQAGDR
FHKVSERLSRPNIFILNNRWDASASEPEYMEEVRRQHMERCTSFLVDELGVVDRAQAGDR
FHKVNERLSKPNIFILNNRWDASASEPEYMEDVRRQHMERCLHFLVEELKVVSPLEARNR
FHKVNERLSKPNIFILNNRWDASASEPEYMEDVRRQHMERCLHFLVEELKVVSPSEARNR
FHKVNERLSKPNIFILNNRWDASASEPEYMEDVRRQHMERCLHFLVEELKVVNALEAQNR
Varianti dell’esone 9
In due pazienti appartenenti alla stessa famiglia è stata identificata una variante non ancora
descritta in letteratura (c.929 T→C) che porta al cambiamento amminoacidico Leu310Pro.
La variante si trova in una zona al di fuori dei domini funzionali noti della proteina ma situata
in prossimità del dominio GTPasico.
Questa zona è tuttavia molto conservata nell’evoluzione e la Leucina in posizione 310 è tra i
residui rimasti invariati persino in specie molto distanti dall’uomo.
L310P
Homo Sapiens
Mouse
Gallus
Anofeles gambiae
IFFVSAKEVLSARVQKAQGMPE
IFFVSAKEVLSARVQKAQGMPE
IFFVSAKEVLNARIQRAQGMPE
VFFVSARETLQARLKEQEGLPA
La variante c.929 T→C è stata identificata in due fratelli con una neuropatia assonale ad
esordio precoce, associata ad atrofia ottica ed atrofia cerebellare. Si prevede di verificare la
segregazione della variante all’interno del rimanente nucleo familiare.
Varianti dell’esone 11
In due pazienti non correlati è stata identificata la variante c.1148 C→T, descritta
recentemente in letteratura ( Muglia et al.,2007) che comporta la sostituzione Ala383Val.
Nel lavoro di Muglia et al., la variante è stata descritta in due famiglie non correlate
provenienti dalla stessa regione del sud Italia. L’analisi dell’aplotipo ha dimostrato un
possibile effetto fondatore per questa mutazione..
Anche se l’esone 11 non si trova in un dominio funzionale conosciuto, la zona in cui si trova
la variante è altamente conservata e situata vicino al primo dominio coiled-coil , nella quale
sono state identificate altre varianti associate a CMT2 : Q386P, L379 M381-del, M376I (
Verhoeven et al. 2006).
A383V
KQIAEAVRLIMDSLHMAAREQQVYCE
KQIAEAVRLIMDSLHIAAQEQRVYCL
KQIAEAVRLIMDSLHIAAQEQRVYCL
KHIAEVLRQIMESVHVAAQLCLVYCL
Homo Sapiens
Rat
Mouse
Xenopus Laevis
Inoltre, l’alanina in posizione 383 è, insieme all’alanina 382, tra i residui più conservati della
regione. Questo suggerisce un ruolo importante del residuo nella stabilità e nella funzionalità
della proteina.
Entrambi i pazienti con la mutazione c.1148 C→T provengono dall’Italia Meridionale,
presentano familiarità per neuropatia ma non è stato possibile, al momento, verificare la
segregazione della mutazione nelle rispettive famiglie.
I risultati relativi all’analisi molecolare del gene MFN2 sono stati presentati alla XI
Riunione del Gruppo di Studio sul Sistema Nervoso Periferico, Siena 12-14 Aprile 2007
(comunicazione orale).
