A06
156
Maria Antonietta Lepore
Ruolo
delle proteine
nella diagnostica
di laboratorio
Copyright © MMXI
ARACNE editrice S.r.l.
www.aracneeditrice.it
[email protected]
via Raffaele Garofalo, 133/A–B
00173 Roma
(06) 93781065
isbn 978–88–548–4046–1
I diritti di traduzione, di memorizzazione elettronica,
di riproduzione e di adattamento anche parziale,
con qualsiasi mezzo, sono riservati per tutti i Paesi.
Non sono assolutamente consentite le fotocopie
senza il permesso scritto dell’Editore.
I edizione: giugno 2011
A Vladimiro, con l’immenso amore di sempre,
Mamma
Indice
9
Prefazione
11Introduzione
15 Capitolo I
Le proteine plasmatiche
21 Capitolo II
Elettroforesi delle sieroproteine
49 Capitolo III
Elettroforesi delle proteine su gel di agarosio
51 Capitolo IV
Elettroforesi dell’emoglobina
57 Capitolo V
Elettroforesi su gel di amido
59 Capitolo VI
Elettroforesi di affinità
7
8
Indice
61 Capitolo VII
Varianti proteiche
77 Capitolo VIII
Metodi di determinazione delle proteine totali
79 Capitolo IX
Enzimi e patologie. Metodi di diagnosi
87 Capitolo X
Struttura e funzioni
93 Capitolo XI
Reazioni enzimatiche accoppiate.
Metodi di misura
99 Capitolo XII
Enzimi specifici
117Conclusioni
121Bibliografia
Prefazione
Le proteine plasmatiche sono sintetizzate prevalentemente nel fegato, nelle plasmacellule, nei linfonodi, nella
milza e nel midollo osseo.
Nel corso di varie patologie, la concentrazione di proteine totali e la percentuale delle singole frazioni si diversificano in modo significativo rispetto ai valori normali.
L’ipoproteinemia può essere causata da ustioni gravi,
sindromi nefrosiche, epatopatie croniche.
L’iperproteinemia può essere rilevata nella disidratazione grave, nelle malattie autoimmuni, in alcune patologie, quale il mieloma multiplo.
Il rapporto albumina/globulina, viene universalmente utilizzato come indice della distribuzione delle frazioni delle due proteine.
Elevate variazioni di tale rapporto è stato osservato nella cirrosi epatica, nella sindrome nefrosica, nelle
epatiti acute, in presenza di varie infiammazioni acute
e croniche.
La determinazione delle proteine totali è impiegata
nella diagnosi e nel trattamento di patologie epatiche,
del rene, del midollo osseo e di varie alterazioni funzionali nutrizionali e/o metaboliche.
Gli enzimi sono proteine funzionali dotate di attività
catalitica. Essi sono catalizzatori specifici, cioè, catalizzano una sola reazione chimica oppure un gruppo di rea9
10
Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio
zioni affini, con la caratteristica peculiare di aumentare
la velocità delle reazioni catalizzate, rispetto alla velocità
con cui decorrerebbero senza di essi.
La funzione catalitica degli enzimi è legata strettamente alla loro struttura.
La parte della molecola enzimatica che partecipa
direttamente alla reazione chimica è denominata sito
attivo.
Gli enzimi sono classificati in sei gruppi, in relazione
al tipo di reazione catalizzata: deidrogenasi, transferasi,
idrolasi, ligasi, isomerasi, liasi.
Introduzione
Le proteine sono polimeri organici ad alto peso molecolare con struttura molto complessa, costituiti da circa
venti tipi diversi di aminoacidi, uniti tra loro da legami
peptidici per formare una o più catene ripiegate in vario modo, la cui organizzazione tridimensionale è legata
strettamente alla loro funzione.
Le proteine rivestono ruoli essenziali in molteplici
funzioni biologiche, come nel sistema coagulativo plasmatico, nella difesa verso le malattie e molte altre funzioni vitali.
Esse sono costituenti primari nella preparazione di
molti farmaci salva–vita.
Inoltre, per alcuni tipi di terapie, unitamente alle proteine estratte da plasma umano, vi è la tecnologia del
DNA ricombinante, che determina la sintesi di varie proteine in linee cellulari geneticamente modificate.
I farmaci di origine plasmatica sono diversi dai farmaci tradizionali. Infatti, il materiale di partenza è il plasma
umano e non un prodotto di sintesi.
Le proteine sono degli anfoliti, cioè sostanze che possono comportarsi sia come acidi sia come basi.
La ionizzazione del gruppo carbossilico dà luogo alla
formazione di cariche negative, mentre l’assunzione di
protoni sul gruppo amminico determina la presenza di
cariche positive.
11
12
Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio
L’intensità del fenomeno di ionizzazione dipende dal
pH del mezzo in cui sono disciolte le proteine.
Il comportamento elettroforetico delle proteine è in
relazione al rapporto tra il pH del mezzo e il punto isoelettrico delle proteine.
Il punto isoelettrico è quel valore di pH in cui la carica
netta è uguale a zero, cioè si ha uguale numero di cariche
positive e cariche negative ed il pH = 7.
Quando il pH > 7 predominano le cariche positive,
cioè la proteina si dissocia come catione e, in un campo
elettrico, migra verso il catodo.
Quando il pH < 7 predominano le cariche negative, la
proteina si dissocia come anione e, in un campo elettrico,
migra verso l’anodo.
Con il termine elettroforesi si definisce la migrazione attraverso un mezzo fluido sotto l’influenza
di un campo elettrico, di particelle dotate di cariche
elettriche.
Con questa tecnica si studia la migrazione delle macromolecole per ottenere la loro separazione qualitativa
e la loro analisi quantitativa. La separazione si realizza in
base alla diversa densità di cariche superficiali delle sostanze da separare.
L’elettroforesi trova la sua principale applicazione in
campo biochimico e biochimico–clinico, nello studio
qualitativo e quantitativo delle proteine.
L’elettroforesi delle proteine è detta zonale, perché la
separazione elettroforetica delle proteine poste in una
soluzione elettrolitica ad un pH costante in un campo
elettrico applicato, avviene in base alla loro carica elettrica, alle loro dimensioni e si separano in bande o zone,
che sono le bande elettroforetiche.
Nell’elettroforesi delle proteine viene universalmente
impiegato il tampone Veronal–Veronal sodico a pH 8. 6,
perché riduce i disturbi di diffusione.
Introduzione13
La diffusione è un fenomeno in cui le bande elettroforetiche si sovrappongono, non sono più nette e non si
separano distintamente.
Il tampone ha la doppia funzione di trasportare la corrente applicata e di determinare la carica elettrica delle
proteine.
Uno strumento per eseguire correttamente l’elettroforesi delle proteine è formato da un mezzo di supporto,
che sono le strisce di acetato di cellulosa, una camera di
migrazione e un alimentatore di corrente ad intensità o
voltaggio costanti.
La camera è divisa in due scomparti contenente il
tampone in uguale livello, con un elettrodo inserito in
ciascuno di essi.
Avvenuta la separazione, le proteine vengono rivelate
mediante bande colorate lette con adatti fotocolorimetri o densitometri, che traducono graficamente in picchi
l’intensità di colore e l’ampiezza delle bande e misurano
automaticamente l’area sottesa a ciascun picco.
L’area è proporzionale alla quantità di colore legato e,
quindi, alla concentrazione proteica.
Utilizzando il tampone di Michaelis, Veronal–Veronal
sodico a pH 8,6, le proteine vengono separate elettroforeticamente su supporto di acetato di cellulosa, in 5
frazioni denominate: albumina, α1–globuline, α2–globuline, β–globuline e γ–globuline, in relazione alla loro
mobilità elettroforetica decrescente.
Gli enzimi sono biocatalizzatori capaci di accelerare le reazioni chimiche che avvengono nell’organismo, aumentando la velocità di reazione senza alterarne le caratteristiche.
La maggior parte degli enzimi svolge la sua attività
dentro le cellule dove sono prodotti.
Perciò, le variazioni della loro concentrazione, misurata universalmente in Unità Internazionale (UI), riflettono
il danno relativo alle cellule o ai tessuti di provenienza.
14
Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio
Le misurazioni enzimatiche nel siero sono di grande
utilità per rilevare e valutare la gravità del danno tessutale.
Molti enzimi hanno una distribuzione ubiquitaria
nell’organismo e un elevato livello serico non indica in
modo specifico l’organo danneggiato.
Tuttavia, alcuni sono strettamente organo–specifici e,
in questo caso, si misurano i livelli degli enzimi più attivi
in alcune cellule o tessuti oppure si identificano gli isoenzimi.
Capitolo I
Le proteine plasmatiche
Il termine proteina deriva dalla parola greca “pròteios”
che significa di primaria importanza.
Infatti, le proteine hanno un ruolo fondamentale in
tutti i processi biologici.
Le molecole di aminoacidi che normalmente sono
presenti nelle proteine, sono disposte, in ogni catena polipeptidica, in una serie ordinata che si sussegue con accuratezza e precisione per ciascuna proteina.
Le proteine possono essere classificate in relazione
alla loro struttura e composizione oppure in base alla
loro funzione.
Le proteine plasmatiche si trovano disciolte nel plasma
e costituiscono circa il 6% del volume totale del sangue.
Esse rappresentano varie forme di proteine circolanti,
che rivestono numerose funzioni biologiche, tra le quali,
per esempio, il trasporto di molecole lipofile, che altrimenti non potrebbero veicolare se non legate a molecole
che ne consentono il trasporto e gli enzimi con la conseguente regolazione dell’attività catalitica.
Nel plasma sono contenuti 6–8 g/dl di proteine con
peso molecolare e funzioni eterogenee.
In relazione alla loro funzione sono classificate in:
—enzimi;
— proteine di trasporto;
15
16
Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio
— fattori della coagulazione e della fibrinolisi;
—immunoglobuline;
— frazioni del complemento;
—ormoni;
— funzione nutritiva;
— proteine di mantenimento della pressione osmotica.
Le proteine plasmatiche sono sintetizzate in gran parte dal fegato, ad eccezione delle immunoglobuline che
sono sintetizzate dalle plasmacellule; alcuni componenti
del complemento che sono sintetizzati dai macrofagi; alcune lipoproteine che sono sintetizzate dalle cellule intestinali; degli ormoni; di alcuni enzimi e degradate e/o
eliminate a livello epatico e gastrointestinale.
Il fegato, quindi, svolge un ruolo molto importante,
anche perché è capace di utilizzare gli aminoacidi sia per
la sintesi di numerose proteine sia di trasformarli in altri
composti azotati e/o in altri substrati fondamentali per
la vita dell’organismo.
Inoltre, il fegato può dirigere e distribuire le proteine
verso differenti destini, in base alle richieste dell’organismo.
Il fegato, pertanto, è l’organo chiave nella sintesi di
molte proteine plasmatiche; infatti, la loro concentrazione diminuisce, non a caso, nelle epatopatie.
La sintesi delle proteine plasmatiche è influenzata soprattutto dallo stato generale di salute dell’organismo,
dallo stato nutrizionale e da alcuni fattori ormonali.
Albumina e globulina rappresentano oltre il 90% delle
proteine plasmatiche circolanti nel sangue.
L’albumina, sintetizzata dalle cellule parenchimali del
fegato, ha una emivita di circa 20 giorni.
Il livello normale è 3,5–5,0 g/dl, corrispondente a circa il 60% delle proteine totali.
i. Le proteine plasmatiche17
Ha una importantissima funzione di mantenimento
della pressione colloide–osmotica del sangue e un’altrettanto importante funzione di trasporto di sostanze esogene ed endogene, quali bilirubina, lipidi, ormoni steroidei, farmaci, coloranti, metalli, vitamine.
Aumenta nei fenomeni di disidratazione, come vomito, diarrea e diminuisce nella denutrizione, nel malassorbimento, per diminuita sintesi, per aumentato catabolismo, per perdite esogene.
Le globuline rappresentano circa il 30% delle proteine
totali, hanno una struttura terziaria a simmetria sferica,
un elevato peso molecolare e si suddividono in tre frazioni: α, β, γ.
Le prime due hanno funzioni di trasporto, la terza
comprende le immunoglobuline con funzione di difesa
dell’organismo.
Il fibrinogeno è una glicoproteina prodotta dal fegato,
costituita da sei subunità e rappresenta il 5% delle proteine totali.
È la frazione quantitativamente più importante delle
plasmaproteine che non si ritrova nel siero.
Il fibrinogeno rappresenta un valido indice che concorre alla diagnosi di varie patologie, quali malattie epatiche, stati infiammatori, coagulazione intravascolare
disseminata (CID).
Un elevato valore di fibrinogeno si riscontra anche
durante la gravidanza oppure in relazione all’uso di contraccettivi orali.
Il siero è il plasma privo di fibrinogeno e quanto resta
del plasma dopo il processo coagulativo.
Il fibrinogeno, quindi, interviene nel processo di coagulazione del sangue.
Quando la sua concentrazione aumenta notevolmente nei processi infiammatori acuti di varia natura, il fibrinogeno viene definito “proteina della fase acuta”.
18
Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio
Diminuisce in presenza di una ridotta funzionalità
epatica, quali cirrosi o malattie croniche del fegato e/o
in tutte le gravi epatopatie, nella coagulazione intravascolare disseminata per l’eccessivo consumo a causa della formazione di numerosi trombi, per disordini
ereditari.
La diminuzione, solitamente, è associata ad una terapia trombolitica.
La determinazione quantitativa del fibrinogeno si valuta aggiungendo un eccesso di trombina al plasma diluito in esame, che converte il fibrinogeno in fibrina.
La velocità della reazione dipende dalla concentrazione di fibrinogeno del campione in esame.
Si utilizza trombina bovina liofilizzata, 35 UNIH/ml,
con aggiunta di albumina bovina, calcio cloruro 0, 025
M, tampone e stabilizzanti.
Il campione viene preparato aggiungendo nove parti
di sangue venoso fresco ad una parte di trisodio citrato.
La determinazione del fibrinogeno può essere influenzata da numerose variabili e soprattutto dalla presenza di
prodotti di degradazione della fibrina e del fibrinogeno.
I risultati dei valori possono essere riportati con varie
unità di misura:
—mg/dL;
—g/L;
—secondi.
È universalmente accreditata la prima delle tre unità
di misura, con valori di riferimento 200–460 mg/dL.
Le proteine sono classificate in proteine semplici, costituite da una sola catena lineare di aminoacidi e proteine coniugate, rispettivamente, polipeptide e struttura
primaria, struttura secondaria, struttura terziaria, struttura quaternaria.
i. Le proteine plasmatiche19
La composizione, costituita da quattro livelli, è così
formata:
— struttura primaria, formata solo da aminoacidi legati tra loro da legami peptidici;
— struttura secondaria, α–elica e struttura “β a foglietti ripiegati”, determinata dalla disposizione
nello spazio di residui aminoacidici vicini tra
loro;
— struttura terziaria, determinata dalla disposizione
nello spazio di residui aminoacidici lontani tra loro
e uniti da ponti disolfuro;
—struttura quaternaria, che riguarda solo le proteine costituite da due o più catene polipeptidiche e corrisponde al ripiegamento nello spazio
delle loro catene, come per esempio, l’emoglobina, costituita, nell’adulto, da due catene α e due
catene β nell’HbA, due catene α e due catene δ
nell’HbA2.
È importante ricordare che la distinzione tra struttura
secondaria e struttura terziaria non è netta.
Lo studio delle proteine del plasma è fondamentale
perché esse rivestono una posizione strategica nell’ambito del metabolismo proteico generale e consentono
di ottenere informazioni importanti sullo stato generale
del metabolismo organico.
Nella suddivisione che riguarda la composizione chimica, si distinguono:
—proteine semplici costituite solo da aminoacidi,
come l’albumina;
—proteine complesse coniugate ad altri composti,
quali zuccheri (glicoproteine), lipidi (lipoproteine)
oppure legate a metalli.
20
Ruolo delle proteine nella diagnostica di laboratorio
In relazione alla solubilità, l’albumina è solubile in acqua, le globuline sono solubili in soluzioni saline diluite.
La funzione catalitica è determinata dagli enzimi.
La funzione di trasporto è destinata al veicolo di sostanze esogene ed endogene, quali bilirubina, lipidi, farmaci, vitamine, ormoni steroidei, coloranti, metalli.
La funzione di difesa viene svolta dalle immunoglobuline o anticorpi e dai fattori del complemento.
Lo svolgimento della funzione nutritiva è destinato
prevalentemente all’albumina.
Nella funzione di coagulazione e di fibrinolisi sono
coinvolte le proteine che intervengono nell’evento coagulativo e fibrinolitico, in forma inattiva, come il fattore
II o protrombina oppure nella forma attivata, della via
intrinseca e della via estrinseca, che convergono nella via
comune per formare il fibrinogeno e la fibrina solubile,
poi stabilizzata dal fattore XIII attivato.
Le proteine plasmatiche deputate alla coagulazione
sono contenute anche negli α–granuli piastrinici dai quali fuoriescono quando le piastrine accorrono, emettendo
pseudopodi, nella lesione di un vaso con perdita ematica.
Le proteine del plasma si riscontrano anche negli spazi extravascolari, quali liquido interstiziale, liquido cefalorachidiano, liquido sinoviale nei quali, nel corso di
infiammazione, quando la concentrazione delle proteine
è contenuta, si forma il trasudato, quando, invece, la concentrazione delle proteine è molto alta, maggiore di 25
g/l, si forma l’essudato.
