Mutazioni geniche

Mutazioni geniche
MUTAZIONE
Cambiamento ereditario, raro e
casuale che provoca
un’alterazione qualitativa e/o
quantitativa dell’informazione
genetica, non dovuto a
segregazione o ricombinazione
di geni preesistenti
Individuo mutante
Gene normale -> il cambiamento mutazionale
può essere valutato rispetto ad uno standard
che chiamiamo “normale” rappresentato dal
genotipo selvatico, che puo’ essere la forma
genica piu’ diffusa in natura o presente in uno
stock standard di laboratorio
Tipi di mutazioni
• Geniche
-puntiformi
- delezioni
-inserzioni
si verificano all’interno di un singolo gene creando varianti
alleliche diverse o alleli ipoattivi, inattivi o iperattivi
• Cromosomiche
si verificano nell’ambito di segmenti di cromosomi o di cromosomi
interi e possono determinare disorganizzazione genica
• Genomiche
Anomalie cariotipiche, si verificano quando un organismo presenta
dei cromosomi in più o in meno rispetto al normale. Se sono
presenti interi corredi cromosomici in più o in meno si parla di
euploidia aberrante ; se invece è solo una parte del corredo in
eccesso o in difetto l'anomalia è chiamata aneuploidia
La mutazione
1. Crea variabilità sulla quale agisce
la selezione naturale nel processo
evolutivo,
promuovendo
le
mutazioni
favorevoli
dalle
sfavorevoli o letali
2. Permette l’analisi genetica
3. È alla base del miglioramento
genetico di piante ed animali di
interesse agronomico
Reversione
selvatico
mutante
Mutazione in avanti
Retromutazione
mutante
selvatico
Mutazioni puntiformi
- Sostituzioni di basi
- Inserzioni di basi
- Delezioni di basi
Sostituzioni di basi
Sostituzioni di basi
Sostituzioni di basi
Frameshift -> spostamento dello schema di lettura;
vengono persi completamente la struttura e la funzione
della proteina normale
Mutazioni nelle sequenze regolative
Il promotore non viene riconosciuto per la trascrizione
La mutazione nei siti accettori e donatori dello splicing
compromette il corretto splicing degli introni
Influenzano la quantita’ di prodotto proteico ma non la
struttura della proteina
La mutazione è un cambiamento
ereditabile del materiale genetico
Somatica
Ereditata solo dai
discendenti di
una cellula
Germinale
trasmessa
attraverso
le generazioni
Individuo/i mutati
Mutazioni somatiche
-Avvengono nelle
cellule del tessuto
somatico o mitotico o
post-mitotico
- Non vengono
trasmesse alla
progenie
- La cellula in cui
avviene la mutazione e’
detta capostipite e può
dare origine ad un
CLONE di cellule
mutate o SETTORE
- La mutazione si
manifesta se
dominante rispetto al
WT
Cloni di cellule mutate
Proto-oncogeni e cancro
I proto-oncogeni codificano per una classe di proteine attive
in modo selettivo, ovvero solo se opportunamente stimolate e
che sono coinvolte nella regolazione della divisione cellulare.
Se l’evento mutazionale disaccoppia la proteina dalla sua via
regolativa, la sua attivazione può diventare continua ed
incontrollata
Proto-oncogene-> gene coinvolto nella
regolazione della divisione cellulare
mutazione
Oncogene
-divisione incontrollata della cellula
-diffusione di cellule tumorali
L’oncoproteina Ras
GRasV12 G->T
L’oncoproteina
Ras e melanoma
Fenotipi delle mutazioni
-Mutazioni morfologiche
determinano nuove caratteristiche fenotipiche visibili
-Mutazioni letali
effetto sulla sopravvivenza
-Mutazioni condizionali
comparsa del fenotipo solo in un ambiente particolare detto
restrittivo
-Mutazioni auxotrofiche
incapacita’ di sintetizzare uno specifico nutriente
-Mutazioni con perdita di funzione (Loss of function)
è recessiva se l’allele selvatico e’ sufficiente a sopperire alla
mancanza dell’altro allele che è mutato; è dominante se l’allele
selvatico non è sufficiente a sopperire alla mancanza dell’allele
mutato
-Mutazioni con acquisto di funzione (Gain of function)
la mutazione conferisce acquisto di funzione per cui si comporta
da dominante
Loss of function
Gain of function
Quanto sono frequenti le mutazioni?
Frequenza delle mutazioni in alcuni loci del mais
Gene
Number of
gametes tested
Number of
mutations
Average number of mutations
per million gametes
R→r
554,786
273
492.0
I→i
265,391
28
106.0
Pr → pr
647,102
7
11.0
Su → su
1,678,736
4
2.4
1,745,280
4
2.2
2,469,285
3
1.2
Y→y
Sh → sh
Tasso di mutazione = numero delle mutazioni che
si verificano in una certa unità di tempo
(generazione di cellule o individui)
Frequenza di mutazione = frequenza con cui una
mutazione compare in una popolazione di cellule o
individui (la popolazione può essere costituta da
gameti o qualsiasi altro tipo cellulare)
Tasso di mutazione = 1/7 divisioni cellulari
Frequenza di mutazione= 2/8 cellule
Rilevazione delle mutazioni
Poiché la mutazione è un evento “raro”, è necessario
disporre di un sistema di screening opportuno
Sistemi di screening di mutazioni
Reversione degli auxotrofi
- retromutazione nello stesso gene
- soppressione in un altro gene
Auxotrofo per
l’adenina
Su terreno
minimo
cresceranno solo
i prototrofi per
l’adenina
Si fanno crescere i mutanti auxotrofi in terreno
permissivo e poi si passano in terreno selettivo, su
cui cresceranno solo i prototrofi
Nella maggior parte delle reversioni si genera una
mutazione in un locus genico diverso con funzione
di soppressore dell’auxotrofia
Mutazione soppressore
E’ una seconda mutazione nello stesso locus genico
che sopprime l’effetto della prima, almeno in parte
esempio
Delezione della C
Inserzione della A
L’inserzione della A ripristina
in parte lo schema di lettura
corretto delle parole
Mutazione non senso
Codoni di stop della traduzione
UAG o codone amber, UAA o codone ochre, e UGA o codone opal
Mutazione soppressore intergenico amber
Mutazione
nell’anticodone nel
t-RNA
Arricchimento per filtrazione (selezione di mutanti
auxotrofici)
Neurospora, Aspergillus
Cellule di E. Coli resistenti
all’infezione da fago T1
Crescita di colonie isolate resistenti al fago T1
La natura della mutazione
Nei cellule di E. Coli resistenti
al fago T1 si genera una
mutazione o si determina un
adattamento fisiologico alla
presenza del fago?
Teorie sulla resistenza ai fagi
Cambiamento o adattamento fisiologico costante per tutte le cellule
Evento raro di mutazione casuale variabile nel tempo
Test di fluttuazione
Bulk culture
individual culture
I batteri vengono piastrati su
piastre che contengono i fagi T1
Le cellule resistenti, già presenti nella popolazione,
vengono selezionate dall’agente ambientale (fago)
Esperimento di
Replica-Plating
(Lederberg, 1952)
Piastra master con
terreno non selettivo
Repliche esatte della piastra
master su terreno selettivo
Le cellule che crescono su terreno
selettivo avevano la mutazione già
presente prima della selezione
Piastra madre
Piastre di
selezione
Se le mutazioni si fossero verificate dopo
l’esposizione al fago ogni replica sarebbe stata
diversa quanto a distribuzione delle colonie
resistenti
Ricerca di mutazioni letali associate al
cromosoma X di Drosophila: il cromosoma ClB
(Muller)
X
ClB
Allele recessivo
letale, l
Regione C invertita
soppressore del
crossover
Allele B
dominante per
l’occhio Bar
Cromosoma bilanciatore: cromosoma
marcato con allele dominante (B) e con
inversione (C)
Determinazione di mutazioni letali recessive
X-linked
x
♀2:♂1
x
Solo ♀
Mutazione
spontanea
sull’X che
produce un
gene letale
La frequenza delle mutazioni
spontanee è di circa 1.5 per
1000 cromosomi
Il trattamento con
raggi X determina
un aumento di oltre
10
volte
nella
frequenza
di
mutazioni
letali
X-linked
I raggi X sono mutageni in tutti gli organismi
Mutazioni indotte per selezionare varietà
vegetali con caratteri desiderati
Mutagenesi di
polline o semi
Mutazioni spontanee -> si
verificano naturalmente
Mutazioni indotte-> si formano in
seguito ad esposizione di un
organismo ad agenti mutageni
Mutazioni spontanee
Si verificano per:
- Errori nella replicazione del DNA
Malappaiamento di basi a causa dell’oscillazione tautomerica
Fedeltà della replicazione: 1 errore/ ~ 109 nt copiati
Lesioni spontanee
-Depurinazione
-Deaminazione
Riparato da parte
dell’Uracile-DNA glicosilasi
Transizioni GC->AT
HOT SPOTS non riparti
dall’Uracile-DNA glicosilasi
Danni da ossidazione del DNA
da parte di radicali superossidi (O2., da perossido di idrogeno
(H2O2) e radicali ossidrili (OH.)
Si appaia erroneamente con A
generando trasversione C->A
Mutazioni indotte
Mutageni-> chimici, radiazioni
-Incorporazione di
analoghi delle basi
-5-Bromouracile (5-BU)
analogo della timina ma può
appaiare con la guanina
-2-Amminopurina (2-AP)
analogo dell’adenina (può
appaiare con la citosina)
-Agenti alchilanti
EMS (etilmetansulfonato)
NG (nitrosoguanidina)
-Agenti intercalanti
- Proflavina
- Arancio di acridina
- Bromuro d’etidio
Hanno strutture planari piatte che imitano la coppia di basi, per cui
riescono ad inserirsi fra le basi azotate impilate del DNA, causando
inserzioni o delezioni di singole coppie di basi
Bromuro d’etidio
Radiazioni UV
Generano fotoprodotti
Dimero ciclobutilico di pirimidine
TEST DI AMES
Test per valutare il potenziale mutagenico/cancerogeno
di un composto
Stimolazione a produrre enzimi
epatici (il fegato di mammiferi può
convertire composti apparentemente
non tossici in composti tossici)
La presenza
di revertenti
indica che il
composto
chimico è
mutageno
Meccanismi di riparazione del DNA
Sistemi enzimatici che riparano i danni subiti dal DNA
Se questi sistemi non funzionano adeguatamente insorgono
mutazioni, quindi malattie, quindi cancro
Meccanismo SOS
meccanismo di emergenza attivato per impedire la morte della
cellula procariotica in seguito al danno
Fotodimero
TC
Le proteine
UmuD/C
riducono la
fedeltà del
processo di
replicazione del
DNA
Riparazione per escissione
Riparazione da DNA glicosilasi
Endonucleasi
AP
Sito AP
(apurinico/apirimidinico)
lasciato dalla glicosilasi
Riparazione postreplicativa
Il DNA
neosintetizzato
non e’ metilato
Riparazione postreplicativa per ricombinazione
Xeroderma Pigmentoso
Difetto nel meccanismo di riparazione per
escissione di nucleotidi. Le persone affette
sviluppano tumori della pelle con estrema
facilità, indotti da radiazioni UV, in seguito
all’esposizione alla luce solare