Il ruolo del laboratorio nella
diagnosi del diabete mellito
Anna Maria Eleuteri
Diabete mellito: definizione
Un gruppo di disordini metabolici causati da deficit
effettivo di insulina a livello tissutale.
La malattia può presentarsi in forme asintomatiche
oppure in forme via via più gravi fino al coma.
Metabolismo del glucosio
Apporto con
l’alimentazione
GLUCOSIO
Assorbimento
Deposito/ Biosintesi di altri composti
Glicogeno
Aminoacidi
Acidi grassi
Acidi nucleici
Ossidazione
Produzione di
energia
Controllo dell’omeostasi glicemica
•
•
•
•
•
•
Ormoni ipoglicemizzanti
Ormoni iperglicemizzanti
Insulina
Glucagone
Incremento dell’ingresso del glucosio nella
cellula (cellule muscolari striate, cellule
adipose)
Incremento dell’utilizzazione del glucosio
(conversione a trigliceridi, sintesi di acidi
nucleici)
Aumento della glicogenosintesi
Aumento della sintesi proteica
Inibizione della glicogenolisi e lipolisi
Inibizione della gluconeogenesi e della
chetogenesi
• Stimolazione della glicogenolisi e della
gluconeogenesi
Ormone della crescita
• Inibizione della assunzione di glucosio
da parte della cellula
• Inibizione della sintesi di acidi grassi
• Aumento della lipolisi
Glucocorticoidi
• Aumento della gluconeogenesi
• Inibizione della sintesi proteica
• Aumento della lipolisi
Adrenalina
• Inibizione della assunzione di glucosio
da parte della cellula
•Incremento della glicogenolisi
•Diminuzione del rilascio di insulina
Classificazione del diabete mellito
I. Diabete di tipo 1 (caratterizzato da distruzione delle β-cellule, solitamente
comportante un deficit assoluto di insulina). Frequenza: <10%.
A. Immuno-mediato
B. Idiopatico
II. Diabete di tipo 2 (può variare da predominantemente insulino-resistente e
relativamente insulino-deficente, a predominantemente insulino-deficente e
relativamente poco insulino-resistente) Frequenza: 80%.
III. Altri tipi specifici
A. Difetti genetici della funzionalità β-cellulare [compreso il Maturity Onset
Diabetes of the Young (MODY)]
B. Difetti genetici dell’azione insulinica
C. Malattie del pancreas esocrino
D. Endocrinopatie
E. Malattie indotte da farmaci o sostanze chimiche
F. Infezioni
G. Rare forme di diabete immuno-mediato
H. Altre sindromi genetiche a volte associate al diabete
IV. Diabete mellito gestazionale
Categorie non diabetiche di disordini del controllo glicometabolico
I.
Alterata glicemia a digiuno (IFG)
II.
Alterata tolleranza glucidica (IGT)
Eziopatogenesi del diabete mellito di tipo 1 (DM1)
PREDISPOSIZIONE GENETICA
Geni HLA-associati ed altri loci genici
INSULTO AMBIENTALE
Risposta immunitaria contro le cellule β
normali
E/O
Risposta immunitaria contro le cellule β
alterate
ATTACCO AUTOIMMUNITARIO
Distruzione delle cellule β
DIABETE DI TIPO I
Infezione virale
Parotite, rosolia,
mononucleosi, morbillo,
citomegalovirus
E/O
Danno alle cellule β
Eziopatogenesi del diabete mellito di tipo 2 (DM2)
PREDISPOSIZIONE GENETICA
AMBIENTE
Difetti genetici multipli
Obesità
DIFETTO PRIMARIO
DELLE CELLULE BETA
INSULINO-RESISTENZA NEI
TESSUTI PERIFERICI
Incontrollata secrezione di insulina
(all’inizio poi inadeguata)
Inadeguato utilizzo di glucosio
Iperglicemia
Esaurimento delle cellule β
DIABETE DI TIPO II
Diabete mellito gestazionale
- Intolleranza ai carboidrati, di variabile grado e severità con
inizio o primo riscontro durante la gravidanza.
- Stima della prevalenza del GDM in Italia intorno al 6%.
Complicanze del diabete mellito e
rischi associati al diabete mellito
Diabete mellito
rischio rispetto
ai non diabetici
Cecità
20 volte
Insufficienza
renale
25 volte
Amputazione
40 volte
Infarto del miocardio
Infarto miocardico
2 – 5 volte
Ictus
Ictus
2 – 4 volte
Nefropatia
Neuropatia
Retinopatia
Microangiopatia
Aterosclerosi
Diagnosi di Diabete mellito
Sintomatologia tipica del DM:
Poliuria
Polidipsia
Iperfagia
Calo ponderale
Altri sintomi che accompagnano l’iperglicemia sono:
suscettibilità a certi tipi di infezioni
diminuzione della crescita
vista offuscata
Diagnosi di Diabete mellito
Stati pre-diabetici: criteri diagnostici.
Intolleranza glucidica (IGT)
Glicemia post-carico a 2 ore ≥ 140 mg/dl (7.8 mmol/l) e < 200 mg/dl (11.1
mmol/l) oppure glicemia post-carico a 2 ore da 140 mg/dl (7.8 mmol/l) a 199
mg/dl (11.0 mmol/l)
Iperglicemia a digiuno (IFG)
Glicemia a digiuno ≥ 100 mg/dl (5.6 mmol/l) e < 126 mg/dl (7.0 mmol/l) oppure
glicemia a digiuno da 100 mg/dl (5.6 mmol/l) a 125 mg/dl (6.9 mmol/l)
Diabete mellito: criteri diagnostici
1. Sintomi di diabete e riscontro di glicemia casuale ≥ 200 mg/dl (11.1
mmol/l).
2. Glicemia a digiuno ≥ 126 mg/dl (7.0 mmol/l).
3. Glicemia plasmatica a 2 ore dal carico ≥ 200 mg/dl (11.1 mmol/l) nel corso di
un test da carico.
Diagnosi di diabete mellito gestazionale
Strategie proposte per la diagnosi delle condizioni di
iperglicemia in gravidanza
• Prima Visita in Gravidanza
Valutare FPG o RPG in tutte le donne
Se i risultati indicano un diabete manifesto:
Trattamento e follow-up come per diabete pre-gestazionale
Se i risultati non indicano un diabete manifesto, ma:
- FPG ≥ 92 e <126 mg/dl: diagnosi di diabete gestazionale
-FPG < 92 mg/dl: eseguire OGTT tra 24ma-28ma settimana
• 24ma – 28ma settimana di Gestazione
OGTT 2 ore 50 g: In tutte le donne non precedentemente
diagnosticate come GDM o diabete manifesto nel corso dell’attuale
gravidanza.
- GDM se 1 o più valori superano la soglia diagnostica
- Normale se tutti i valori dell’OGTT sono inferiori alla soglia
diagnostica
Screening di Diabete mellito
Popolazione a rischio di sviluppare precocemente stati prediabetici o diabete mellito conclamato.
Obesi (≥ 120% del peso corporeo desiderabile o con un indice di
massa corporea (BMI) ≥ 25 kg/m2 per la Società Italiana di
Diabetologia; BMI ≥ 27 kg/m2 per l’American Diabetes Association.
Parenti di primo grado di un paziente diabetico.
Appartenenti a gruppi etnici ad alto rischio (afroamericani, ispanici,
nativi d’America, americani di origine asiatica, abitanti delle isole
del Pacifico).
Madri di neonati macrosomici (peso alla nascita > 4 kg) o gravide con
diagnosi di diabete gestazionale.
Ipertesi (pressione arteriosa ≥ 140/90 mmHg).
Dislipidemici (valori di colesterolo HDL ≤ 35 mg/dl e/o livelli di
trigliceridi ≥ 250 mg/dl).
Riscontro a un precedente test diagnostico di uno stato prediabetico (intolleranza glucidica o iperglicemia a digiuno).
Portatori di altre condizioni cliniche associate a insulino-resistenza.
Glicemia - punti di attenzione
Digiuno overnight (da almeno 8 ore, massimo 16 ore)
Separare il plasma entro 60 min; altrimenti usare NaF per
inibire la glicolisi (10 mg/dL/ora)
Plasma: campione raccomandato per la diagnosi
Differenze tra plasma, sangue intero, sangue capillare
Interferenze da acido urico, bilirubina, acido ascorbico
(Trinder)
Glicemia – metodi più utilizzati
- Glucosio ossidasi/perossidasi/Trinder
- Esochinasi/glucosio-6-fosfato deidrogenasi
Forniscono valori sostanzialmente sovrapponibili nell’intervallo
di valori di concentrazione compreso tra 54 e 214 mg/dL.
Glicemia – metodi più utilizzati
- Glucosio ossidasi/perossidasi/Trinder
Glucosio + O2
GOD
Acido gluconico + H2O2
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenolo
Reazione di Trinder
POD
Chinoneimina + 4 H2O
Glicemia – metodi più utilizzati
Esochinasi/glucosio-6-fosfato deidrogenasi
1. Glucosio + ATP ——Esochinasi——> G-6-P + ADP
2. G-6-P + NAD+ —G-6-PDH—> 6-PG + NADH + H+
1. L’esochinasi catalizza la fosforilazione del glucosio da parte dell’ATP producendo ADP e
glucosio-6-fosfato.
2. Il glucosio-6-fosfato viene ossidato in 6-fosfogluconato con la riduzione di NAD+ in
NADH da parte di G-6-PDH.
La quantità di NADH formata è proporzionale alla concentrazione di glucosio nel campione e
può essere misurata mediante l’aumento dell’assorbanza a 340 nm.
Test ottico di Warburg: spettri di assorbimento di
soluzioni 0.1 nM rispettivamente di NAD, NADP (---)
e NADH2, NADPH2 (__). A 340 nm si ha il max di
assorbimento dei coenzimi ridotti.
Requisiti di qualità per la misura
del glucosio plasmatico
Metodi per la determinazione del glucosio mostrano bassa
imprecisione a valori di concentrazione pari a 126 e 200 mg/dL,
ma la relativamente alta variabilità biologica (CV: 5-7%) può
produrre errori di classificazione.
Tenendo conto della variabilità biologica le determinazioni del
glucosio dovrebbero avere una imprecisione non superiore al
3.3%, un errore del 2,5% ed un errore totale analitico
accettabile non superiore al 7.9%.
Oral glucose tolerance test (OGTT)
Considerazioni di tipo pre-analitico:
(a) il paziente deve assumere una dieta regolare di 100-150 g di
carboidrati al giorno per almeno tre giorni prima del test;
(b) deve essere generalmente in buona salute (un raffreddore non è una
controindicazione ma un’influenza con vomito sì);
(c) non deve essere stato ospedalizzato recentemente;
(d) non deve essere stato posto in regime di attività fisica limitata,
appositamente prima del test.
Efficacia dubbia dell’OGTT:
scarsa riproducibilità.
Nella nuova classificazione l’OGTT
ha un ruolo di minore importanza
rispetto alla misura della glicemia
(più facilmente standardizzabile ed
economica).
Emoglobina glicosilata
- Luglio 2009: un Comitato di Esperti nominati dall’American
Diabetes Association (ADA), dalla European Association for
the Study of Diabetes (EASD) e dall’International Diabetes
Federation (IDF) ha suggerito che l’HbA1c è più affidabile
della glicemia per la diagnosi di diabete a condizione che:
- la misurazione sia eseguita con un metodo allineato con lo
standard DCCT(Diabetes Control Complication Trial)/UKPDS (United Kingdom
Prospective Diabetes Study);
- non sussistano condizioni che ostacolano l’interpretazione
del valore di HbA1c misurato.
Emoglobina glicosilata
- HbA1c è un parametro più affidabile rispetto alla glicemia
nella diagnosi di diabete:
- ha una migliore standardizzazione (se allineata al sistema
IFCC e, di riflesso, al sistema DCCT/UKPDS);
- è espressione della glicemia media di un lungo periodo e non
di un singolo momento;
- ha una minore variabilità biologica;
- ha una minore instabilità pre-analitica;
-non ha necessità di un prelievo dopo 8 ore di digiuno;
- non soffre di alcuna influenza da parte di perturbazioni
acute (es. stress da prelievo);
- è lo stesso parametro usato per il monitoraggio clinico del
diabete.
Emoglobina glicosilata
- Principio: in un ambiente contenente glucosio, questo si lega
stabilmente alle proteine, che risultano “glicate”.
- L’entità della glicazione è proporzionale all’integrale della
concentrazione di glucosio per il tempo di contatto
- La glicazione è un processo lento: l’entità è limitata dalla vita
media della proteina
- La misura dell'emoglobina glicata (HbA1c) è molto utilizzata in
pazienti diabetici soprattutto al fine di monitorare il controllo glicometabolico a medio-lungo termine (gold standard).
Hb glicata: reazione di glicazione
reversibile
irreversibile
veloce
lenta
HbA1c
labile
HbA1c
stabile
Reazione non enzimatica di condensazione tra il gruppo
aldeidico del glucosio e il gruppo amminico N-terminale delle
catene della Hb.
Emoglobina glicosilata
-Globuli rossi liberamente permeabili al glucosio.
-L’entità della formazione della HbA1c è direttamente
proporzionale alla concentrazione di glucosio alla quale i
globuli rossi sono esposti durante tutta la loro permanenza
in circolo.
- La sua eliminazione avviene con la degradazione dei globuli
rossi.
- Vita media degli eritrociti circa 120 giorni.
- HbA1c riflette pertanto la concentrazione prevalente della
glicemia nei 2-3 mesi precedenti.
Hb glicata: limiti di riferimento e
livelli decisionali
HbA1c :
HbA1c
(%)
HbA1c
(mmol/mol)
- Limite decisionale (obiettivo terapia): <7%
4,0
20
- Limite decisionale per rivalutazione terapia:
5,0
31
>8%.
6,0
42
6,5
48
7,0
53
7,5
59
8,0
64
9,0
75
10,0
86
- Limiti di riferimento: 4-6%
I risultati di HbA1c tracciabili al metodo di
riferimento IFCC saranno espressi in mmol di
emoglobina glicata per mole di emoglobina totale
(mmol/mol). Questo renderà più confrontabili i
risultati ottenuti nei laboratori in Italia e nel
mondo
Hb A1c: aspetti metodologici
Esistono oggi più di 70 metodiche per determinare la
concentrazione della HbA1c basate su:
A. La differenza di carica elettrica tra HbA1c ed
HbA (minicolonne, HPLC, isoelettrofocalizzazione
ed elettroforesi)
B. La natura di determinanti antigenici dei primi 8
residui aminoacidici della catena β (immunochimica)
C. La presenza di glucosio legato covalentemente
all’emoglobina (cromatografia di affinità).
Hb A1c: variabili preanalitiche
Fattori legati al soggetto
Età (+0,1% ogni decade dopo i 30 anni)
Fenotipo glicatore veloce o lento (2-3%)
Possibili variazioni stagionali
Modificata vita media eritrocitaria (emolisi intra- ed extravascolare Hb A1c)
Assunzione di vitamina C Hb A1c
Anemia sideropenica Hb A1c
Ipertrigliceridemia, iperbilirubinemia, assunzione cronica di
salicilato, dipendenza da oppiacei Hb A1c
Condizione uremica (+0,066% per ogni incremento di 1 mmol/L
di urea, per formazione di emoglobina carbamilata)
Presenza di varianti emoglobiniche
Presenza di emoglobina fetale (portatori di certi tipi di βtalassemia, persistenza ereditaria di emoglobina fetale) e di
quote elevate di frazione labile (base di Schiff)
Emoglobine anomale
Le tecniche HPLC a scambio ionico sono generalmente in grado
di verificare la presenza di emoglobine anomale; non è noto se e
come la velocità di glicazione della emoglobina sia modificata
nelle emoglobine patologiche.
La cromatografia di affinità misura la glicazione anche delle
emoglobine anomale, mentre i metodi immunologici solo in alcuni
casi.
In tutte le condizioni in cui esistono ragioni biologiche (es.
anemia emolitica) od analitiche (es. presenza di varianti
emoglobiniche) che rendono inaffidabile la misura della HbA1c è
possibile ricorrere all’automonitoraggio o alla determinazione
della fruttosamina o, meglio, dell'albumina glicata.
Hb A1c: variabili preanalitiche
Raccolta e conservazione dei campioni
Prelievo venoso o capillare in EDTA;
Sangue intero stabile 5 giorni a 4°C e 6 mesi a -80°C;
Congelamento rapido e scongelamento lento (1 h a T ambiente)
Traguardi analitici
Studio DCCT
Diabetes Control and Complication Trial
Maggiori risultati:
• La glicoemoglobina è un indicatore di rischio per lo sviluppo di
complicanze nel diabetico
• La gravità delle complicanze è correlata con il valore della
glicoemoglobina
• Il “trattamento intensivo” rallenta lo sviluppo e/o la
progressione delle complicanze a lungo termine
Lowering HbA1c reduces the risk
of complications (UKPDS)
21%
Deaths related
to diabetes
37%
Microvascular
complications
14%
Myocardial
infarction
HbA1c
1%
Stratton IM et al. BMJ 2000; 321:405–12
Altri esami: marcatori di autoimmunità
Nella maggior parte dei casi di diabete di tipo 1 la distruzione
delle cellule del pancreas è mediata da cellule T.
Tali forme di diabete appartengono alla categoria 1A (anche
denominata IMD, diabete immuno-mediato).
Nell’85-90% degli individui con IMD alla prima osservazione è
possibile dimostrare la presenza di marcatori di autoimmunità
(vedi tabella seguente).
Una parte minore dei diabetici di tipo 1 (tipo 1B, idiopatico)
sono di eziologia ignota e non hanno evidenza di autoimmunità.
Circa il 10-15 % degli adulti con diabete di tipo 2 sono positivi
per marcatori di autoimmunità, in particolare GADA.
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Altri esami: marcatori di autoimmunità
Auto-anticorpo
Anti-citoplasma delle cellule
insulari (ICA)
Anti-glutammato
decarbossilasi (GADA)
Anti-antigeni associati
all’insulinoma (IA-2A e IA2bA)
Anti-insulina (IAA)
Frequenza
(diabete tipo 1)
70 – 80 %
70 – 80 %
~ 60 %
adulti: < 10%
bambini: ~ 50%
Microalbuminuria
La misurazione della albuminuria è un sensibile
indicatore di danno glomerulare
Infatti solo una piccolissima percentuale di albumina (circa
0,004%, pari a 1.3 g/die) oltrepassa il filtro glomerulare.
Di questi 1,3 g/die ~15 mg/die (~1%) vengono eliminati
con le urine, il rimanente viene catabolizzato dalle cellule
del tubulo
Microalbuminuria e rischio di
nefropatia diabetica
80% dei diabetici di tipo 1 (20 – 40% tipo 2) con
(micro)albuminuria sviluppa proteinuria entro 10 – 15
anni
La “microalbuminuria” diabetica si accompagna all’instaurarsi
di microangiopatia ancora reversibile.
Oltre 200 mg/L si sviluppa microangiopatia (anche renale) non
più reversibile.
