Il ruolo del laboratorio nella diagnosi del diabete mellito

Il ruolo del laboratorio nella
diagnosi del diabete mellito
Anna Maria Eleuteri
Diabete mellito: definizione
Un gruppo di disordini metabolici causati da deficit
effettivo di insulina a livello tissutale.
La malattia può presentarsi in forme asintomatiche
oppure in forme via via più gravi fino al coma.
Metabolismo del glucosio
Apporto con
l’alimentazione
GLUCOSIO
Assorbimento
Deposito/ Biosintesi di altri composti
 Glicogeno
 Aminoacidi
 Acidi grassi
 Acidi nucleici
Ossidazione
Produzione di
energia
Controllo dell’omeostasi glicemica
•
•
•
•
•
•
Ormoni ipoglicemizzanti
Ormoni iperglicemizzanti
Insulina
Glucagone
Incremento dell’ingresso del glucosio nella
cellula (cellule muscolari striate, cellule
adipose)
Incremento dell’utilizzazione del glucosio
(conversione a trigliceridi, sintesi di acidi
nucleici)
Aumento della glicogenosintesi
Aumento della sintesi proteica
Inibizione della glicogenolisi e lipolisi
Inibizione della gluconeogenesi e della
chetogenesi
• Stimolazione della glicogenolisi e della
gluconeogenesi
Ormone della crescita
• Inibizione della assunzione di glucosio
da parte della cellula
• Inibizione della sintesi di acidi grassi
• Aumento della lipolisi
Glucocorticoidi
• Aumento della gluconeogenesi
• Inibizione della sintesi proteica
• Aumento della lipolisi
Adrenalina
• Inibizione della assunzione di glucosio
da parte della cellula
•Incremento della glicogenolisi
•Diminuzione del rilascio di insulina
Classificazione del diabete mellito
I. Diabete di tipo 1 (caratterizzato da distruzione delle β-cellule, solitamente
comportante un deficit assoluto di insulina). Frequenza: <10%.
A. Immuno-mediato
B. Idiopatico
II. Diabete di tipo 2 (può variare da predominantemente insulino-resistente e
relativamente insulino-deficente, a predominantemente insulino-deficente e
relativamente poco insulino-resistente) Frequenza: 80%.
III. Altri tipi specifici
A. Difetti genetici della funzionalità β-cellulare [compreso il Maturity Onset
Diabetes of the Young (MODY)]
B. Difetti genetici dell’azione insulinica
C. Malattie del pancreas esocrino
D. Endocrinopatie
E. Malattie indotte da farmaci o sostanze chimiche
F. Infezioni
G. Rare forme di diabete immuno-mediato
H. Altre sindromi genetiche a volte associate al diabete
IV. Diabete mellito gestazionale
Categorie non diabetiche di disordini del controllo glicometabolico
I.
Alterata glicemia a digiuno (IFG)
II.
Alterata tolleranza glucidica (IGT)
Eziopatogenesi del diabete mellito di tipo 1 (DM1)
PREDISPOSIZIONE GENETICA
Geni HLA-associati ed altri loci genici
INSULTO AMBIENTALE
Risposta immunitaria contro le cellule β
normali
E/O
Risposta immunitaria contro le cellule β
alterate
ATTACCO AUTOIMMUNITARIO
Distruzione delle cellule β
DIABETE DI TIPO I
Infezione virale
Parotite, rosolia,
mononucleosi, morbillo,
citomegalovirus
E/O
Danno alle cellule β
Eziopatogenesi del diabete mellito di tipo 2 (DM2)
PREDISPOSIZIONE GENETICA
AMBIENTE
Difetti genetici multipli
Obesità
DIFETTO PRIMARIO
DELLE CELLULE BETA
INSULINO-RESISTENZA NEI
TESSUTI PERIFERICI
Incontrollata secrezione di insulina
(all’inizio poi inadeguata)
Inadeguato utilizzo di glucosio
Iperglicemia
Esaurimento delle cellule β
DIABETE DI TIPO II
Diabete mellito gestazionale
- Intolleranza ai carboidrati, di variabile grado e severità con
inizio o primo riscontro durante la gravidanza.
- Stima della prevalenza del GDM in Italia intorno al 6%.
Complicanze del diabete mellito e
rischi associati al diabete mellito
Diabete mellito
rischio rispetto
ai non diabetici
Cecità
20 volte
Insufficienza
renale
25 volte
Amputazione
40 volte
 Infarto del miocardio
Infarto miocardico
2 – 5 volte
 Ictus
Ictus
2 – 4 volte
 Nefropatia
 Neuropatia
 Retinopatia
 Microangiopatia
 Aterosclerosi
Diagnosi di Diabete mellito
Sintomatologia tipica del DM:
 Poliuria
 Polidipsia
 Iperfagia
 Calo ponderale
Altri sintomi che accompagnano l’iperglicemia sono:
 suscettibilità a certi tipi di infezioni
 diminuzione della crescita
 vista offuscata
Diagnosi di Diabete mellito
Stati pre-diabetici: criteri diagnostici.
Intolleranza glucidica (IGT)
Glicemia post-carico a 2 ore ≥ 140 mg/dl (7.8 mmol/l) e < 200 mg/dl (11.1
mmol/l) oppure glicemia post-carico a 2 ore da 140 mg/dl (7.8 mmol/l) a 199
mg/dl (11.0 mmol/l)
Iperglicemia a digiuno (IFG)
Glicemia a digiuno ≥ 100 mg/dl (5.6 mmol/l) e < 126 mg/dl (7.0 mmol/l) oppure
glicemia a digiuno da 100 mg/dl (5.6 mmol/l) a 125 mg/dl (6.9 mmol/l)
Diabete mellito: criteri diagnostici
1. Sintomi di diabete e riscontro di glicemia casuale ≥ 200 mg/dl (11.1
mmol/l).
2. Glicemia a digiuno ≥ 126 mg/dl (7.0 mmol/l).
3. Glicemia plasmatica a 2 ore dal carico ≥ 200 mg/dl (11.1 mmol/l) nel corso di
un test da carico.
Diagnosi di diabete mellito gestazionale
Strategie proposte per la diagnosi delle condizioni di
iperglicemia in gravidanza
• Prima Visita in Gravidanza
Valutare FPG o RPG in tutte le donne
Se i risultati indicano un diabete manifesto:
Trattamento e follow-up come per diabete pre-gestazionale
Se i risultati non indicano un diabete manifesto, ma:
- FPG ≥ 92 e <126 mg/dl: diagnosi di diabete gestazionale
-FPG < 92 mg/dl: eseguire OGTT tra 24ma-28ma settimana
• 24ma – 28ma settimana di Gestazione
OGTT 2 ore 50 g: In tutte le donne non precedentemente
diagnosticate come GDM o diabete manifesto nel corso dell’attuale
gravidanza.
- GDM se 1 o più valori superano la soglia diagnostica
- Normale se tutti i valori dell’OGTT sono inferiori alla soglia
diagnostica
Screening di Diabete mellito
Popolazione a rischio di sviluppare precocemente stati prediabetici o diabete mellito conclamato.
 Obesi (≥ 120% del peso corporeo desiderabile o con un indice di
massa corporea (BMI) ≥ 25 kg/m2 per la Società Italiana di
Diabetologia; BMI ≥ 27 kg/m2 per l’American Diabetes Association.
 Parenti di primo grado di un paziente diabetico.
 Appartenenti a gruppi etnici ad alto rischio (afroamericani, ispanici,
nativi d’America, americani di origine asiatica, abitanti delle isole
del Pacifico).
 Madri di neonati macrosomici (peso alla nascita > 4 kg) o gravide con
diagnosi di diabete gestazionale.
 Ipertesi (pressione arteriosa ≥ 140/90 mmHg).
 Dislipidemici (valori di colesterolo HDL ≤ 35 mg/dl e/o livelli di
trigliceridi ≥ 250 mg/dl).
 Riscontro a un precedente test diagnostico di uno stato prediabetico (intolleranza glucidica o iperglicemia a digiuno).
 Portatori di altre condizioni cliniche associate a insulino-resistenza.
Glicemia - punti di attenzione
Digiuno overnight (da almeno 8 ore, massimo 16 ore)
Separare il plasma entro 60 min; altrimenti usare NaF per
inibire la glicolisi (10 mg/dL/ora)
Plasma: campione raccomandato per la diagnosi
 Differenze tra plasma, sangue intero, sangue capillare
 Interferenze da acido urico, bilirubina, acido ascorbico
(Trinder)
Glicemia – metodi più utilizzati
- Glucosio ossidasi/perossidasi/Trinder
- Esochinasi/glucosio-6-fosfato deidrogenasi
Forniscono valori sostanzialmente sovrapponibili nell’intervallo
di valori di concentrazione compreso tra 54 e 214 mg/dL.
Glicemia – metodi più utilizzati
- Glucosio ossidasi/perossidasi/Trinder
Glucosio + O2
GOD
Acido gluconico + H2O2
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenolo
Reazione di Trinder
POD
Chinoneimina + 4 H2O
Glicemia – metodi più utilizzati
Esochinasi/glucosio-6-fosfato deidrogenasi
1. Glucosio + ATP ——Esochinasi——> G-6-P + ADP
2. G-6-P + NAD+ —G-6-PDH—> 6-PG + NADH + H+
1. L’esochinasi catalizza la fosforilazione del glucosio da parte dell’ATP producendo ADP e
glucosio-6-fosfato.
2. Il glucosio-6-fosfato viene ossidato in 6-fosfogluconato con la riduzione di NAD+ in
NADH da parte di G-6-PDH.
La quantità di NADH formata è proporzionale alla concentrazione di glucosio nel campione e
può essere misurata mediante l’aumento dell’assorbanza a 340 nm.
Test ottico di Warburg: spettri di assorbimento di
soluzioni 0.1 nM rispettivamente di NAD, NADP (---)
e NADH2, NADPH2 (__). A 340 nm si ha il max di
assorbimento dei coenzimi ridotti.
Requisiti di qualità per la misura
del glucosio plasmatico
Metodi per la determinazione del glucosio mostrano bassa
imprecisione a valori di concentrazione pari a 126 e 200 mg/dL,
ma la relativamente alta variabilità biologica (CV: 5-7%) può
produrre errori di classificazione.
Tenendo conto della variabilità biologica le determinazioni del
glucosio dovrebbero avere una imprecisione non superiore al
3.3%, un errore del 2,5% ed un errore totale analitico
accettabile non superiore al 7.9%.
Oral glucose tolerance test (OGTT)
Considerazioni di tipo pre-analitico:
(a) il paziente deve assumere una dieta regolare di 100-150 g di
carboidrati al giorno per almeno tre giorni prima del test;
(b) deve essere generalmente in buona salute (un raffreddore non è una
controindicazione ma un’influenza con vomito sì);
(c) non deve essere stato ospedalizzato recentemente;
(d) non deve essere stato posto in regime di attività fisica limitata,
appositamente prima del test.
Efficacia dubbia dell’OGTT:
scarsa riproducibilità.
Nella nuova classificazione l’OGTT
ha un ruolo di minore importanza
rispetto alla misura della glicemia
(più facilmente standardizzabile ed
economica).
Emoglobina glicosilata
- Luglio 2009: un Comitato di Esperti nominati dall’American
Diabetes Association (ADA), dalla European Association for
the Study of Diabetes (EASD) e dall’International Diabetes
Federation (IDF) ha suggerito che l’HbA1c è più affidabile
della glicemia per la diagnosi di diabete a condizione che:
- la misurazione sia eseguita con un metodo allineato con lo
standard DCCT(Diabetes Control Complication Trial)/UKPDS (United Kingdom
Prospective Diabetes Study);
- non sussistano condizioni che ostacolano l’interpretazione
del valore di HbA1c misurato.
Emoglobina glicosilata
- HbA1c è un parametro più affidabile rispetto alla glicemia
nella diagnosi di diabete:
- ha una migliore standardizzazione (se allineata al sistema
IFCC e, di riflesso, al sistema DCCT/UKPDS);
- è espressione della glicemia media di un lungo periodo e non
di un singolo momento;
- ha una minore variabilità biologica;
- ha una minore instabilità pre-analitica;
-non ha necessità di un prelievo dopo 8 ore di digiuno;
- non soffre di alcuna influenza da parte di perturbazioni
acute (es. stress da prelievo);
- è lo stesso parametro usato per il monitoraggio clinico del
diabete.
Emoglobina glicosilata
- Principio: in un ambiente contenente glucosio, questo si lega
stabilmente alle proteine, che risultano “glicate”.
- L’entità della glicazione è proporzionale all’integrale della
concentrazione di glucosio per il tempo di contatto
- La glicazione è un processo lento: l’entità è limitata dalla vita
media della proteina
- La misura dell'emoglobina glicata (HbA1c) è molto utilizzata in
pazienti diabetici soprattutto al fine di monitorare il controllo glicometabolico a medio-lungo termine (gold standard).
Hb glicata: reazione di glicazione
reversibile
irreversibile
veloce
lenta
HbA1c
labile
HbA1c
stabile
Reazione non enzimatica di condensazione tra il gruppo
aldeidico del glucosio e il gruppo amminico N-terminale delle
catene  della Hb.
Emoglobina glicosilata
-Globuli rossi liberamente permeabili al glucosio.
-L’entità della formazione della HbA1c è direttamente
proporzionale alla concentrazione di glucosio alla quale i
globuli rossi sono esposti durante tutta la loro permanenza
in circolo.
- La sua eliminazione avviene con la degradazione dei globuli
rossi.
- Vita media degli eritrociti circa 120 giorni.
- HbA1c riflette pertanto la concentrazione prevalente della
glicemia nei 2-3 mesi precedenti.
Hb glicata: limiti di riferimento e
livelli decisionali
HbA1c :
HbA1c
(%)
HbA1c
(mmol/mol)
- Limite decisionale (obiettivo terapia): <7%
4,0
20
- Limite decisionale per rivalutazione terapia:
5,0
31
>8%.
6,0
42
6,5
48
7,0
53
7,5
59
8,0
64
9,0
75
10,0
86
- Limiti di riferimento: 4-6%
I risultati di HbA1c tracciabili al metodo di
riferimento IFCC saranno espressi in mmol di
emoglobina glicata per mole di emoglobina totale
(mmol/mol). Questo renderà più confrontabili i
risultati ottenuti nei laboratori in Italia e nel
mondo
Hb A1c: aspetti metodologici
Esistono oggi più di 70 metodiche per determinare la
concentrazione della HbA1c basate su:
A. La differenza di carica elettrica tra HbA1c ed
HbA (minicolonne, HPLC, isoelettrofocalizzazione
ed elettroforesi)
B. La natura di determinanti antigenici dei primi 8
residui aminoacidici della catena β (immunochimica)
C. La presenza di glucosio legato covalentemente
all’emoglobina (cromatografia di affinità).
Hb A1c: variabili preanalitiche
Fattori legati al soggetto
 Età (+0,1% ogni decade dopo i 30 anni)
 Fenotipo glicatore veloce o lento (2-3%)
 Possibili variazioni stagionali
 Modificata vita media eritrocitaria (emolisi intra- ed extravascolare   Hb A1c)
 Assunzione di vitamina C   Hb A1c
 Anemia sideropenica   Hb A1c
 Ipertrigliceridemia, iperbilirubinemia, assunzione cronica di
salicilato, dipendenza da oppiacei   Hb A1c
 Condizione uremica (+0,066% per ogni incremento di 1 mmol/L
di urea, per formazione di emoglobina carbamilata)
 Presenza di varianti emoglobiniche
 Presenza di emoglobina fetale (portatori di certi tipi di βtalassemia, persistenza ereditaria di emoglobina fetale) e di
quote elevate di frazione labile (base di Schiff)
Emoglobine anomale
 Le tecniche HPLC a scambio ionico sono generalmente in grado
di verificare la presenza di emoglobine anomale; non è noto se e
come la velocità di glicazione della emoglobina sia modificata
nelle emoglobine patologiche.
 La cromatografia di affinità misura la glicazione anche delle
emoglobine anomale, mentre i metodi immunologici solo in alcuni
casi.
 In tutte le condizioni in cui esistono ragioni biologiche (es.
anemia emolitica) od analitiche (es. presenza di varianti
emoglobiniche) che rendono inaffidabile la misura della HbA1c è
possibile ricorrere all’automonitoraggio o alla determinazione
della fruttosamina o, meglio, dell'albumina glicata.
Hb A1c: variabili preanalitiche
Raccolta e conservazione dei campioni
 Prelievo venoso o capillare in EDTA;
 Sangue intero stabile 5 giorni a 4°C e 6 mesi a -80°C;
 Congelamento rapido e scongelamento lento (1 h a T ambiente)
Traguardi analitici
Studio DCCT
Diabetes Control and Complication Trial
Maggiori risultati:
• La glicoemoglobina è un indicatore di rischio per lo sviluppo di
complicanze nel diabetico
• La gravità delle complicanze è correlata con il valore della
glicoemoglobina
• Il “trattamento intensivo” rallenta lo sviluppo e/o la
progressione delle complicanze a lungo termine
Lowering HbA1c reduces the risk
of complications (UKPDS)
21%
Deaths related
to diabetes
37%
Microvascular
complications
14%
Myocardial
infarction
HbA1c
1%
Stratton IM et al. BMJ 2000; 321:405–12
Altri esami: marcatori di autoimmunità
 Nella maggior parte dei casi di diabete di tipo 1 la distruzione
delle cellule  del pancreas è mediata da cellule T.
 Tali forme di diabete appartengono alla categoria 1A (anche
denominata IMD, diabete immuno-mediato).
 Nell’85-90% degli individui con IMD alla prima osservazione è
possibile dimostrare la presenza di marcatori di autoimmunità
(vedi tabella seguente).
 Una parte minore dei diabetici di tipo 1 (tipo 1B, idiopatico)
sono di eziologia ignota e non hanno evidenza di autoimmunità.
 Circa il 10-15 % degli adulti con diabete di tipo 2 sono positivi
per marcatori di autoimmunità, in particolare GADA.
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Altri esami: marcatori di autoimmunità
Auto-anticorpo
Anti-citoplasma delle cellule
insulari (ICA)
Anti-glutammato
decarbossilasi (GADA)
Anti-antigeni associati
all’insulinoma (IA-2A e IA2bA)
Anti-insulina (IAA)
Frequenza
(diabete tipo 1)
70 – 80 %
70 – 80 %
~ 60 %
adulti: < 10%
bambini: ~ 50%
Microalbuminuria
La misurazione della albuminuria è un sensibile
indicatore di danno glomerulare
Infatti solo una piccolissima percentuale di albumina (circa
0,004%, pari a 1.3 g/die) oltrepassa il filtro glomerulare.
Di questi 1,3 g/die ~15 mg/die (~1%) vengono eliminati
con le urine, il rimanente viene catabolizzato dalle cellule
del tubulo
Microalbuminuria e rischio di
nefropatia diabetica
80% dei diabetici di tipo 1 (20 – 40% tipo 2) con
(micro)albuminuria sviluppa proteinuria entro 10 – 15
anni
La “microalbuminuria” diabetica si accompagna all’instaurarsi
di microangiopatia ancora reversibile.
Oltre 200 mg/L si sviluppa microangiopatia (anche renale) non
più reversibile.