Centro Università di Milano-Scuola per la diffusione delle bioscienze
e delle biotecnologie
www.cusmibio.unimi.it
TUTTI UGUALI, TUTTI DIVERSI
Caccia al gene
1
Tutti uguali, tutti diversi
Caccia al gene
Lo scopo di questa attività pratica è di capire come attraverso l’uso di banche dati bioinformatiche
sia possibile, partendo da una sequenza parziale di DNA umano, identificare il gene a cui appartiene
la sonda nucleotidica, identificare le differenze tra la sequenza data e quella normale, ottenere
informazioni dettagliate sulla proteina codificata dal gene e sui tessuti in cui la proteina è espressa,
mettere in relazione le alterazioni del gene con malattie.
Ti verrà data una sequenza parziale di DNA (sonda) e con quella dovrai “pescare” il
gene corrispondente. Sarà come trovare un ago in un pagliaio!!
Obiettivi dell’attività:
1. identificare un gene a partire da una sequenza (sonda) sconosciuta;
2. identificare la regione del cromosoma dove si trova il gene;
3. identificare una mutazione in una data sequenza di DNA; definire la struttura esone-introne del
gene ed ottenere la sequenza completa del cDNA;
4. identificare le caratteristiche principali della proteina codificata dal gene normale
5. trovare le conseguenze della mutazione a livello della proteina; identificare le principali
caratteristiche del cDNA elaborando uno schema con la posizione del codone di inizio, di stop e
del segnale di poliadenilazione; tradurre la molecola di cDNA nella corrispondente proteina;
6. ottenere informazioni sulla struttura in 3D della proteina;
7. capire come correlare la mutazione in un gene ad una malattia.
2
Scenario
I test predittivi vengono proposti a individui asintomatici che hanno, nella loro famiglia, casi di
malattie genetiche. Nella storia che viene proposta per l’attività di bioinformatica, una donna con
casi di cancro al seno in famiglia (vedi l’albero genealogico della famiglia del probando) chiede di
sottoporsi ad un test per evidenziare se è portatrice di geni
di predisposizione alla malattia (in questo caso il tumore al
seno).
Anne, una giovane donna di 23 anni, si reca al suo primo
appuntamento con il suo nuovo ginecologo; il dottore nota
dal racconto di Anne che nella sua famiglia ci sono stati
numerosi casi di cancro. La sua nonna paterna morì a 40
anni di cancro al seno; due delle quattro zie paterne sono
morte prima dei 50 anni per cancro alle ovaie e ad una
terza zia paterna di 39 anni è stato recentemente
diagnosticato il cancro al seno. Il ginecologo pensa che
nella famiglia di Anne possa essere presente una mutazione in uno dei due geni che controllano la
predisposizione allo sviluppo del cancro al seno e/o all’ovaio (BRCA1 or BRCA2). Durante la
visita il ginecologo individua un nodulo sospetto nel seno destro di Anne e ne predispone una
biopsia. Oltre all’esame istologico, il ginecologo suggerisce ad Anne il test del DNA ma la informa
che i risultati potranno essere informativi solo se si può fare il test anche sui famigliari, per
individuare esattamente la mutazione tipica della sua famiglia.
Anne contatta subito sua zia malata scoprendo che si è già sottoposta al test genetico da cui è
risultata portarice di una rara mutazione nel gene BRCA2.
Per fare diagnosi di malattie genetiche viene utilizzata dai laboratori una tecnica particolare: la RTPCR (reverse transcription polymerase chain reaction). L’RT-PCR è una tecnica che amplifica un
frammento di acido ribonucleico (RNA). La molecola di RNA è dapprima trascritta nel DNA
complementare (o cDNA) attraverso l’uso dell’enzima trascrittasi inversa (RT), e in seguito
amplificata utilizzando la reazione a catena della polimerasi. L’RT-PCR usa come stampo una
molecola di RNA ed è quindi molto utile per l’analisi dell’espressione genica in un tessuto.
Sul campione della biopsia di Anne viene eseguita la RT-PCR e il prodotto della reazione viene
sequenziato: si scopre che la mutazione nel gene di Anne è la stessa riscontrata nel DNA della zia.
Userai una sequenza parziale di cDNA di Anne come sonda per identificare la mutazione presente
3
in questa famiglia e per verificare la presenza della mutazione nel DNA di Anne.
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Obiettivi 1 e 2:
Identificare il gene a cui appartiene la sequenza (sonda) e la sua posizione sul cromosoma.
Per raggiungere l’obiettivo della prima parte dell’attività devi usare il software BLAT (BLASTLike Alignment Tool), un algoritmo ottimizzato per confrontare sequenze di cDNA (prive di
introni) con intere sequenze genomiche (che contengono introni).
Vai al sito: http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?db=mm2
Incolla nel box vuoto la sequenza nucleotidica
TGCACTAACAAGACAGCAAGTTCGTGCTTTGCAAGATGGTGCAGAGCTTTATGAAGCAGTGAAGAATGCA
GCAGACCCAGCTTACCTTGAG TTATACTGAGTATTTGGCGTCCATCATCAGATTTATATTCTCTGTTAAC
AGAAGGAAAGAGATACAGAATTTATCATCTTGCAACTTCAAAATCTAAAAGTAA ATCTGAAAGAGCTAAC
ATACAGTTAGCAGCGACAAAAAAAACTCAGTATCAACAACTACCG GTTTCAGATGAAATTTTATTTCAGA
TTTACCAGCCACGGGAGCCCCTTCACTTCAGCAAATTTTTAGATCCAGACTTTCAGCCATCTTGTTCTGA
per trovare la sua localizzazione nel genoma umano (controlla che sia selezionata la scelta “human”
tra i genomi disponibili e clicca su “submit”.
Bisogna attendere alcuni secondi per avere i risultati della ricerca del software BLAT. Scegli il
primo risultato che mostri il migliore allineamento definito con un numero detto score: più alto è lo
score migliore è l’allineamento. Scoprirai che la tua sequenza (definita dal software query) è
composta da 350 nucleotidi e si trova nel cromosoma 13.
Se desideri maggiori dettagli sulla struttura esoni-introni della regione genomica in esame, clicca su
“details” (userai questa funzione anche in seguito); ora però clicca su “browser” per trovare la
regione cromosomica che contiene la sequenza che ci interessa. Nella schermata che si apre osserva
che l’ideogramma del cromosoma ha un tratto rosso nella posizione dove si trova la sequenza che
5
stiamo studiando.
Nella finestra sottostante ritrovi la sequenza (your seq) al di sotto della quale c’è la sequenza
genomica (known genes) che si allinea nel miglior modo possibile; per capire bene le informazioni
contenute in questa finestra bisogna rinfrescare le conoscenze sulla struttura del gene. I geni
rappresentano solo l’1% del genoma umano e gli scienziati stanno ancora studiando per capire la
composizione e la funzione del restante 99%.
Negli eucarioti i geni sono affiancati da lunghe sequenze non codificanti il cui significato risulta
ancora abbastanza oscuro (queste sequenze sono anche dette DNA spazzatura); quando viene
localizzato un gene si nota che è suddiviso in piccole parti dette esoni, che sono le parti codificanti
proteine o molecole di RNA e che gli esoni sono separati da lunghi tratti non codificanti detti
introni. Nella finestra di BLAT gli esoni sono rappresentati da blocchetti neri o rossi, mentre gli
introni sono raffigurati come linee sottili.
domanda1) Prendi nota della posizione della sonda che stai studiando sul cromosoma 13 e
della lunghezza della regione.
Il gene al quale appartiene la tua sonda è quello che mostra il migliore allineamento, indicato sotto
a your seq :come ci attendevamo, è BRCA2.
Obiettivo 3
Identificare la mutazione presente nel DNA di Anne e nella sua famiglia
Confronta la struttura della tua sequenza (your seq) con la struttura del gene normale sottostante.
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domanda2) Quanti esoni sono visibili in questa parte di gene? Quanti esoni ci sono nella tua
sequenza? Ci sono differenze tra la struttura esoni-introni della tua sequenza e la struttura
della sequenza del gene normale? Cosa possiamo dire sulla mutazione genica di Anne?
In questa pagina ci sono altre informazioni; sulla sinistra ci sono dei blocchetti grigi e blu: l’interfaccia del browser ti permette di personalizzare ed
arricchire la tua ricerca visualizzando informazioni diverse, aggiungendone o nascondendone altre. Infatti cliccando sui blocchetti verticali si accede
ad altre pagine e si possono cambiare anche i parametri della ricerca.
Osserva attentamente la barra verticale relativa alla conservazione della sequenza (Vertebrate Alignment and Conservation). Nota che le regioni
maggiormente conservate corrispondono agli esoni (i rettangoli colorati pieni nella sezione RefSeq genes ) e che queste regioni si conservano anche
in specie di vertebrati lontane evolutivamente dall’uomo, come in opossum, pollo o rana. Un discreto livello di conservazione si osserva anche in
alcune regioni introniche (conservazione delle sequenze non-codificanti) ma ancora non ne è chiaro il ruolo anche se si può supporre che siano zone
coinvolte nella regolazione dell’espressione genica. La penultima barra mostra gli SNPs (single nucleotide polymorphisms) e l’ultima, Repeat
masker, mostra le sequenze ripetute.
Ora dobbiamo trovare quale è l’esone che manca nella mutazione della famiglia di Anne. Per
ottenere questa informazione bisogna trovare la struttura esone-introne completa del gene normale
BRCA2. Per fare questo hai bisogno della sequenza codificante completa (CDS) e, con questa,
cominciare una nuova ricerca BLAT.
Vai alla pagina http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ per trovare il codice identificativo del gene BRCA2.
Seleziona “Nucleotide” nel campo “search”
posizionato in alto a sinistra nella home page
e digita “BRCA2 homo sapiens” nel campo
“for”. Clicca poi su Go. Nell’elenco che
apparirà, trova BRCA2 Homo sapiens breast
cancer 2, early onset (BRCA2), mRNA.
Prendi nota del numero di accesso
identificativo NM_000059 (NM
significa mRNA naturale).
Clicca su NM_000059 e si aprirà
un tipico file di GenBank.
Questa pagina è difficile da
interpretare
ma
alcune
informazioni sono chiare; prima
di tutto ci sono le Reference,
7
cliccando sulle quali si possono trovare le citazioni alle pubblicazioni in letteratura scientifica che
riguardano
la nostra sequenza. Per leggere un abstract dell’articolo che descrive il gene, clicca sul link
PubMed presente in ogni Reference.
Scendendo nella pagina puoi trovare informazioni più dettagliate sulla mutazione genica.
Alla fine della pagina, nella sezione Features, troverai la sequenza di cDNA (CDS). Questa è
la sequenza utile per la ricerca in BLAT. Non si può copiare la sequenza CDS così come si trova
nella pagina ma bisogna ottenere un file utile per la ricerca del gene correlato nelle banche dati. Per
fare ciò bisogna risalire all’inzio della pagina e di fianco al bottone Display cliccare per far
scendere un menù a tendina e selezionare FASTA. Salva su un file di testo con il nome
cDNAFASTA.doc la sequenza di basi che apparirà sullo schermo. Tornando in banca dati alla
pagina con le caratteristiche di NM_000059, trova il numero identificativo della proteina prodotta
dal gene (NP_000050), la sua sequenza di amminoacidi, copiala e salvala in un nuovo file di testo
dal nome BRCA2 protein.doc. Prendi nota del numero di amminoacidi che costituiscono la
proteina normale.
Adesso che hai la sequenza codificante completa (cDNA) del gene BRCA2 puoi cercarne la
sequenza genomica usando il software BLAT. Come ricorderai, questo software ti permette di
confrontare sequenze di cDNA con sequenze genomiche complete e di identificarne la struttura in
esoni ed introni.
Ritorna alla pagina http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?db=mm2 ed incolla la sequenza di
cDNA nella finestra di BLAT.
Clicca “submit” e quando comparirà la nuova pagina clicca su “details” alla sinistra del primo
record in elenco (score 11.358, 11.386 nucleotides, 100% identity).
Nella pagina che si apre troverai la tua sequenza di cDNA, la sequenza di DNA genomico nella
quale sono evidenziati in blu scuro e con le lettere maiuscole gli esoni, in nero e con le lettere
minuscole gli introni e in azzurro i siti di splicing. Clicca sui links, nella colonna di sinistra, per
navigare nella sequenza. Cliccando sui vari blocchi, ti appare ad inizio pagina l’esone
corrispondente nella sequenza genomica; noterai che ci sono 27 esoni nel gene BRCA2. Il tuo
compito ora è di identificare quale è l’esone che manca nel gene mutato di BRCA2.
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Nella sequenza genomica ricerca i residui nucleotidici che corrispondono alla posizione della tua
sonda sul cromosoma 13 (ricorda: chr13:31,848,838-31,852,238), semplicemente cliccando uno di
seguito all’altro i vari blocchi
di sinistra e leggendo i numeri
dei nucleotidi dell’esone che
apparirà in alto nella pagina.
domanda3) sei in grado di
rispondere alla domanda:
qual è l’esone che manca nel
gene mutato BRCA2? La
perdita dell’esone è dovuta a
una mutazione di un sito di
splicing (sostituzione di G con A) nell’introne 21, che porta alla perdita completa dell’esone 22
(Wagner TM et al 1999, PMID: 9971877).
Copia la sequenza dell’esone mancante e salvala in un file di testo dal nome “missing exon.doc”.
Obiettivo 4
Costruire una scheda contenente tutte le informazioni sulle funzioni della proteina codificata dal
gene BRCA2 normale.
Apri l’ homepage di Swiss Prot all’indirizzo http://www.expasy.org/sprot/sprot-top.html
Swiss Prot è un database di
sequenze proteiche molto
ricco e completo che
contiene un livello molto
elevato di annotazioni
quali: la descrizione delle
funzioni delle proteine, i
domini
strutturali,
le
modificazioni
posttrascrizionali, le varianti
ecc. Swiss Prot ha livelli
minimi di ridondanza e alti
livelli di integrazione con
altri
database
bioinformatici.
In alto nella pagina che
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si apre, digita nel campo “search” la tua QUERY (richiesta): BRCA2 human, e clicca su GO; nella
pagina seguente, nella lista di risultati che appaiono, cerca human BRCA2 protein (prendi nota del
codice identificativo P51587). Clicca su BRCA2_HUMAN.
La nuova pagina contiene informazioni
raggruppate in categorie quali: [Entry info],
[Name
and
origin],
[Comments],
[Keywords],
[References],
[Cross-references],
[Features],
[Sequence],
[Tools]. Osserva tutta la pagina per
raccogliere tutte le informazioni disponibili
sulla proteina in esame.
Nella sezione [Comments] troverai le
informazioni sulle funzioni della proteina e
in che tessuti è localizzata.
Nella sezione [Cross-references], ci sono i
links ad altri database per avere più informazioni su BRCA2. Per esempio la sequenza del gene che
codifica per la proteina è disponibile su EMBL Genbank, i domini proteici su SMR, la struttura in
3D in PDB, Prosite, InterPro e Pfam, le malattie associate ad alterazioni del gene o della proteina in
OMIM.
Prendi nota del numero identificativo in PDB (1NOW), SMR (P51587) e OMIM (ci sono molti
records tutti preceduti dalla sigla MIM).
Obiettivo 5
Trovare le conseguenze della mutazione a livello della proteina.
Puoi fare delle predizioni sulle conseguenze della perdita dell’esone 22 nel gene BRCA2 sulla
struttura e sulla funzione della proteina?
Per rispondere a questa domanda devi ricostruire la molecola di mRNA (o di cDNA) priva
dell’esone 22 e poi tradurla nella corrispondente sequenza di amminoacidi.
Apri il file della sequenza normale di cDNA (cDNAFASTA.doc); apri anche il file della sequenza
dell’esone 22 (salvata come file “missingexon.doc”). Cerca la sequenza dell’esone 22 nella
sequenza di cDNA (ricordati che il cDNA è solo una sequenza di esoni) e cancellala. La funzione di
Word “Cerca” potrà aiutarti a trovare l’esone 22 nel cDNA ma devi prestare molta attenzione a
cancellare solo l’esone 22. Salva il risultato del tuo lavoro come file “cDNA22del.doc” ( vedi
allegato)
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Ora bisogna usare un nuovo software per tradurre la sequenza di cDNA mutata, cDNA22del.doc
(contenente la delezione) in sequenza di amminoacidi; vai al sito:
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/translate/index.html. Incolla la sequenza mutata nella finestra
bianca e clicca “translate DNA”.
Otterrai una immagine su fondo nero
che è il risultato della traduzione della
sequenza nelle 6 possibili cornici di
lettura (3 per ogni elica di DNA): in
verde
sono rappresentati i possibili
codoni di inizio e in viola i codoni di
stop. Identifica la cornice di lettura
detta anche “Open Reading Frame o
ORF” più lunga, senza interruzioni
date dai codoni di stop.
Nel nostro caso la ORF più lunga è “forward frame 3”. Ora clicca su “Text Output” per
visualizzare la sequenza e la sua traduzione in amminoacidi. Scegli la forward frame 3.
Puoi facilmente personalizzare l’interfaccia del software scegliendo di visualizzare la sequenza
amminoacidica con il codice a una o a tre lettere, con o senza la sequenza di DNA appaiata. Scegli
“one letter code” e “amino acids and DNA”.
Copia il contenuto della finestra in un nuovo file di Word e salvalo come “mutated protein.doc”);
usa come font “courier new” or “courier”, dimensione 8, nero; è necessario utilizzare questo
font per gli allineamenti di sequenza perché mantiene fissi e costanti gli spazi tra i caratteri.
Localizzazione delle caratteristiche principali del cDNA
Ora puoi localizzare le principali caratteristiche del cDNA/mRNA, per esempio:
• 5’UTR (5’ UnTranslated Region)
• start codon (inizio della traduzione, ATG (AUG) il codone della metionina)
• CDS (CoDing Sequence): la sequenza tradotta in proteina
• stop codon (fine della traduzione, TAA (UAA)/ TAG (UAG) / TGA (UGA)
• 3’UTR (3’ UnTranslated Region)
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• sito polyA
(sito di poliadenilazione) costituito dalla sequenza consenso “AATAAA”
generalmente localizzata 20-30 bp (max 10-35 bp) a monte dell’inizio della coda di polyA. Nota
che talvolta questo sito può essere leggermente differente dalla sequenza consenso (per esempio
ATTAAA).
Identifica tutti gli elementi sopra
elencati ed evidenziali con il colore
verde
e
giallo.
Iniziando
dall’estremità 5’ della molecola,
trova il codone d’inizio cioè il
primo ATG, che corrisponde alla
prima metionina (M), non seguita
a breve distanza da alcun codone
di stop. Una volta identificato il
codone di inizio puoi cancellare la
sequenza di amminoacidi che lo
precede che è la regione 5’UTR, non tradotta dai ribosomi in proteina.
domanda 5 Quanto è lunga la proteina mutata? Confrontala con la lunghezza della proteina
normale che hai annotato precedentemente.
Obiettivo 6
domanda 6 Quali sono i domini principali della proteina BRCA2 normale? Quali domini
mancano nella proteina mutata?
Vai alla pagina http://pfam.sanger.ac.uk/search
Pfam
raccoglie
una
collezione di allineamenti
multipli
riguardanti
di
sequenze
i
domini
proteici e le famiglie più
comuni. Per ogni famiglia
in Pfam puoi trovare la
struttura del dominio e
della
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proteina
nel
suo
complesso. Inserisci il codice identificativo di Swiss Prot per la proteina BRCA2, P51587 nella
finestra per la ricerca che si trova sotto “Jump to” alla voce “enter ID/acc”.
Nella nuova pagina, si trova la lista dei domini conservati identificati all’interno della proteina, con
i residui amminoacidici corrispondenti. Cliccando sui singoli domini, si ottiene la rappresentazione
grafica e la descrizione .
Cerca la regione di circa 500 amminoacidi che mancano nella proteina mutata di Anne: si trovano
nella parte finale della proteina ed esattamente appartengono al dominio Pfam-A_BRCA2_OB3 (aa
3052-3190).
Clicca ora sul link OB3 per conoscere le funzioni di questo dominio e riassumile qui sotto.
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
Strutture 3D disponibili della proteina BRCA2
Vai alla home page di NCBI e cerca, nel database PROTEIN, BRCA2 Human e scegli la proteina
P51587. Alla sua destra clicca sul link “Conserved domains”.
Nella pagina che si apre osserva la sequenza della proteina nella sua interezza e cliccando
sull’ultimo rettangolino rosso nella riga Specific hits comparirà una finestra che illustra le
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caratteristiche del dominio OB3, clicca sul bottone “Structure” (nella barra orizzontale azzurra in
cima alla pagina); nella pagina seguente inserisci BRCA2 human nella search box. Scegli 1IYJ (la
sola struttura in 3D che contiene il dominio che ci interessa). 1IYJ è un frammento della proteina
BRCA2 (817 residui) ingegnerizzato in un vettore, espresso in una linea cellulare, purificato e
cristallizzato.
Clicca su “Structure view in Cn3D”. Si scaricherà un file con estensione .cgi che potrà essere aperto
solo con il programma chiamato 'Cn3D' (è possibile scaricare il programma di modellazione 3D
gratuitamente dal sito dell’NCBI). In una finestra a fondo nero viene mostrata la struttura in 3D di
1IYJD. Se non si visualizza la sequenza amminoacidica di 1IYJ, apri la finestra “sequence viewer”
dal Menu Window in cima alla pagina. Questo programma 3D è interattivo: spostandosi col mouse
su un punto qualsiasi della figura e tenendo premuto il tasto sinistro si può ruotare a piacere
l’immagine.
Sono possibili diverse opzioni:
-
andando su Style _ Rendering Shortcuts si sceglie il tipo di modellizzazione (a sfere e
bastoncini, a tubi, etc). Selezionando worms si ha una struttura “vermiforme” facilmente
interpretabile.
-
andando su Style _ Coloring Shortcuts si sceglie il criterio di colorazione: Secondary
Structure evidenzia con colori diversi le strutture ad alfa elica o a foglietto ripiegato;
Molecule associa a ciascuna catena polipeptidica un colore diverso; Hydrophobicity
evidenzia le zone idrofile e idrofobiche, Charge le cariche, etc.
-
Con Style _ Favorites _ Add/Replace si può salvare con nome l’immagine tra i favoriti
(comparirà nella tendina in basso).
-
Con Style _ Edit Global Style si ha una visione complessiva delle impostazioni ed è
possibile modificarle: in Settings si modifica il tipo di modellizzazione, i colori di catene e
sfondo, si decide se visualizzare o meno molecole estranee (esempio ioni zinco, fenolo, etc),
gli oggetti che evidenziano la struttura secondaria, i ponti disolfuro. Per prendere familiarità,
selezionare e deselezionare queste voci, osservando le variazioni nell’immagine. In Labels è
possibile visualizzare i nomi degli aminoacidi (alla voce “Spacing” si sceglie se scrivere un
nome ogni uno, due, tre, ... aminoacidi). In Details si modificano le dimensioni del tipo di
modellizzazione scelta (ad esempio il diametro della struttura “vermiforme”).
-
Alla voce Show/Hide _ Pick Structures ... si decide se visualizzare tutte le catene, oppure
solo alcune. Può essere utile per identificare quali sono le catene A e B di ciascun
monomero.
-
Con View _ Animation _ Spin si fa partire la rotazione automatica del modello.
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Scegli dal Menu Style “Rendering shortcuts” e “Worms” in modo da visualizzare la struttura
secondaria con cilindri per le alfa eliche e frecce per i beta foglietti.
Per vedere dove è posizionato un amminoacido devi cliccare il medesimo in una delle sequenze e la
sua posizione apparirà scritta sul fondo della finestra (tra parentesi compare anche la posizione
dell’amminoacido nella proteina totale). Cliccando e trascinando il mouse su di una serie di residui
amminoacidici nella sequenza cristallizzata (1IYJD) una barra gialla compare sulla struttura 3D nel
punto in corrispondenza della posizione dei residui all’interno della struttura.
In effetti bisognerebbe allineare la proteina normale con la sua forma mutata. Purtroppo non sono ancora state realizzate
le strutture 3D di molte proteine e neanche della varie forme mutanti della stessa proteina. Così bisogna riconoscere la
mutazione (nel nostro caso la delezione dell’esone 22) dalla posizione degli aa mancanti e prevedere quali interferenze
strutturali potrebbero esserci nella proteina mutata. Questo metodo, non certamente ottimale, sarà migliorato dalla
disponibilità di algoritmi più accurati per predire le strutture che eviteranno di dover determinare la struttura 3D
sperimentalmente, lasciando al laboratorio solo la fase finale della validazione farmacologica.
Obiettivo 7
Malattie associate con l’alterazione del gene BRCA2.
Visita il database OMIM per conoscere le malattie associate con le alterazioni di questo gene. Vai
all’indirizzo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ e clicca su OMIM nella barra in alto blu. Si aprirà il
nuovo database nel quale dobbiamo cercare BRCA2.
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Il gene BRCA2 (BReast
CAncer 2) con il gene
BRCA1 rappresentano i
geni più importanti le cui
mutazioni
causano
suscettibilità allo sviluppo
del
cancro
al
seno
e
all’ovaio. BRCA2 è stato
scoperto
e
studiato
famiglie
islandesi
in
che
avevano casi di tumore al seno nel loro albero genealogico. Normalmente i geni BRCA2 e BRCA1
sono geni soppressori dei tumori poiché sono coinvolti nella sintesi di enzimi riparatori dei danni
che può subire il DNA; hanno anche altre funzioni complesse che però non sono state
completamente chiarite. Solo il 5-10% dei tumori al seno sono forme di tumore ereditario. In questi
casi, nel 90% dei pazienti sono presenti mutazioni nei geni BRCA1 o BRCA2. I ricercatori hanno
individuato 450 mutazioni solo nel gene BRCA2 e >600 nel gene BRCA1. Le mutazioni in BRCA1
sono responsabili del 50-85% dei casi di cancro al seno ereditari e aumentano del 15-45% il rischio
di sviluppare il cancro alle ovaie. Le mutazioni in BRCA2 sono responsabili del 35% del cancro al
seno ereditario ma conferiscono un rischio minore (10-20%) di sviluppare tumori alle ovaie.
Entrambi i geni sono coinvolti anche nel tumore al seno nel maschio (6%). In tutti i casi ci sono dati
che sottolineano un leggero incremento (6-14%) del rischio di sviluppare anche altri tipi di cancro
(colon, prostata, pancreas).
Nei casi sporadici (non familiari) di cancro al seno le mutazioni in BRCA1 e BRCA2 sono
molto rare. La frequenza delle mutazioni nel gene BRCA2 che predispongono al cancro non è
ancora stata definita a livello della popolazione generale,; si stima che, nella popolazione globale, la
frequenza di soggetti portatori di mutazioni in uno di questi due geni sia fra 1/500 e 1/1000; a causa
dell’effetto fondatore, nei diversi gruppi etnici singole o poche mutazioni possono essere
predominanti.
Qui di seguito vengono illustrati due gruppi etnici con specifiche mutazioni in BRCA2 che
predispongono al cancro:
1) la mutazione 999del5 di BRCA2 che predispone al cancro è presente nello 0,6% della
popolazione generale Islandese, e rispettivamente nel 7.7% delle donne e nel 40% degli uomini
affetti da tumore mammario [Thorlacius et al 1996 , Thorlacius et al 1997];
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2) la mutazione 6174delT di BRCA2 presente con una frequenza dell’1% in individui discendenti
da Ebrei Ashkenazi [Struewing et al 1995 , Oddoux et al 1996 , Roa et al 1996 , Struewing et al
1997].
Considerando sia il gene BRCA1 Che BRCA2, nella popolazione degli Ebrei Ashkenaziti sono
state osservate 3 tipi di mutazioni dovute a effetto fondatore: 187delAG (BRCA1), 5385insC
(BRCA1) e 6174delT (BRCA2). Tra gli ebrei Ashkenaziti 1 individuo su 40 presenta una di queste
tre mutazioni [Struewing et al 1997]
A questo punto hai trovato un ago in un pagliaio!! Non hai solo individuato il gene ma hai
fatto un percorso lungo e complicato: partendo da una sequenza “sonda” hai trovato molte
informazioni sul gene BRCA2 e sulla sua proteina! Hai anche acquisito un metodo per farti
domande e trovare risposte ad altre questioni riguardanti mutazioni geniche di tuo interesse
(o di interesse dei tuoi studenti).
Congratulazioni! Una caccia davvero di successo.
A cura di:
•
•
Prof.ssa Giovanna Viale, Dipartimento di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche,
Università degli Studi di Milano, Cus-Mi-Bio;
Prof.ssa Cinzia Grazioli, docente di scienze del liceo scientifico Vittorio Veneto di Milano,
distaccata presso il Cus-Mi-Bio
17
