TITOLO DELLA RICERCA

PROGETTI A CONCORSO 2009-2010 - VINCITORI
PROGETTO N. 25
CDR / 500/08
RESPONSABILE PROGETTO: DARIO DEGIORGIO
FINANZIAMENTO: € 35.000,00
TITOLO
Analisi molecolare del gene ABCB4 nelle epatopatie colestatiche suggestive di deficit della
fosfatidilcolina biliare e valutazione funzionale di specifiche mutazioni identificate nei pazienti
Responsabile Scientifico
Dr Dario Degiorgio
Lab. Genetica Medica – Laboratorio di Analisi Chimico Cliniche e
Microbiologia R. Dr.E.Torresani
Unità Operative collaboranti
- U.O. Centro Fibrosi Cistica
- U.O. Gastroenterologia 1
- U.O.S. Patol. della Gravidanza.
-IRCCS Maggiore MILANO- Prof.ssa C. Colombo
-IRCCS Maggiore MILANO- Prof. M. Colombo
-IRCCS Maggiore MILANO- Dr. B. Acaia
Area per la salute della donna, del bambino e del neonato
- Telethon Institute of Genetics and Medicine
-TIGEM NAPOLI- Dssa G. Meroni
Durata della ricerca
Inizio ricerca: GENNAIO 2009;
Fine ricerca DICEMBRE 2010
OBIETTIVI DELLA RICERCA
Obiettivi del presente progetto sono i seguenti:
1) valutare il coinvolgimento del gene ABCB4 in un ampia casistica di adulti affetti da
a) epatopatie colestatiche con diagnosi di (i) colestasi intraepatica della gravidanza, (ii)
colestasi concomitante all'assunzione di contraccettivi orali, (iii) colangiopatie idiopatiche croniche;
b) litiasi intraepatica/colelitiasi di colesterolo a esordio giovanile.
2) valutare l'incidenza dei grossi riarrangiamenti genici di ABCB4 come meccanismo patogenetico
di malattia colestatica;
3) Eseguire l’analisi funzionale del gene ABCB4 mediante:
a) valutazione del livello di espressione del gene ABCB4 wild type e di alcuni alleli
ABCB4 mutati inseriti in vettori d’espressione e transfettati nella linea cellulare HEK293;
b) valutazione della localizzazione nella membrana plasmatica della proteina ABCB4 wild
type e della proteina ABCB4 mutata in HEK293 (valutazione di singoli cambi aminoacidici
già identificati e descritti nel nostro precedente studio);
c) valutazione dell’efficienza residua dell’attività floppasica per le proteine ABCB4 mutate
che raggiungano correttamente la membrana plasmatica.
RAZIONALE DELLA RICERCA/Innovazione rispetto allo stato dell'arte nel campo
La proteina ABCB4 (ATP-binding cassette-subfamily B member 4) si dispone sulla membrana
canalicolare degli epatociti dove partecipa alla secrezione biliare traslocando la fosfatidilcolina
(PC) che dissolve gli acidi biliari nelle micelle impedendone così l’attività citotossica dello stato
libero. Mutazioni puntiformi di entrambi gli alleli del gene ABCB4, fino all’80% rappresentate da
sostituzioni nucleotidiche che comportano singoli cambi aminoacidici, sono documentate come
causa della Colestasi Intraepatica Familiare Progressiva di Tipo 3 (PFIC3) in ambito pediatrico
(Degiorgio e coll., 2007) e della litiasi intraepatica/colelitiasi di colesterolo a esordio giovanile.
Inoltre, singoli cambi aminoacidici sono stati occasionalmente descritti nelle colangiopatie
idiopatiche croniche dell’adulto; lo studio dell’open reading frame del gene ABCB4 di un’ampia
coorte di pazienti adulti contribuirà sostanzialmente a chiarire l’epidemiologia delle epatopatie
colestatiche con deficit di PC.
Una relativamente alta omologia tra il gene ABCB1 e ABCB4 (raggiunge il 78% se si paragonano
le due proteine) e la contiguità fisica (sono a circa 100 Kb di distanza) suggerisce che è ragionevole
ricercare grossi riarrangiamenti tra i due geni omologhi, perché potrebbero rappresentare un
meccanismo molecolare di malattia colestatica.
Gli studi più recenti relativi ai singoli cambi aminoacidici di ABCB4, quali l’esclusione di un
significato polimorfico e i risultati dell’analisi speculativa in silico, suggeriscono un deficit
dell’attività floppasica della proteina ABCB4 mutata; allo stesso tempo, l’assenza di studi
funzionali esaustivi delle mutazioni missense non consente di conoscere né l’entità del deficit
dell’attività floppasica, né quali possano essere i più comuni meccanismi patogenetici che
sottendono alla deficienza dell’attività stessa della proteina ABCB4. L’analisi funzionale delle
proteine ABCB4 con singoli cambi aminoacidici in cellule HEK239, opportunamente
ingegnerizzate, può consentire di stabilire quali e quanti sono i genotipi mutati che promuovono la
sintesi della proteina ABCB4-misfolded sequestrata dal reticolo endoplasmico, la sintesi della
proteina ABCB4-misfolded che ha difficoltà nell’inserzione nel doppio foglietto lipidico della
membrana plasmatica e la sintesi della proteina ABCB4-misfolded correttamente inserita attraverso
il doppio foglietto lipidico della membrana plasmatica ma con deficiente abilità nella traslocazione
della PC. La realizzazione del progetto consentirà pertanto di (i) indagare con quale frequenza una
colangiopatia idiopatica dell’adulto è da ascrivere a deficit di PC biliare, (ii) indagare nuovi
meccanismi molecolari causa di mutazione genica di ABCB4, (iii) stabilire i meccanismi molecolari
con cui il singolo cambio aminoacidico è causa di deficit dell’attività floppasica ovvero stabilire
una migliore correlazione genotipo/fenotipo e quindi l’utilizzo/ la validazione a scopo diagnostico e
prognostico del test genetico di ABCB4.
DISEGNO DELLO RICERCA
Il progetto si articola in tre fasi principali:
1) Arruolamento dei pazienti
WP1 (0-12 mesi)
La U.O. di Gastroenterologia 1 (Prof. M. Colombo) e la U.O.S. Patologia della Gravidanza (Dssa
Barbara Acaia) arruoleranno rispettivamente i pazienti adulti con diagnosi di epatopatia colestatica
cronica e colestasi intraepatica della gravidanza.
2) Analisi di sequenza e ricerca dei grossi riarrangiamenti
WP2 (0-18 mesi)
Il laboratorio di Genetica Medica eseguirà l’analisi molecolare del gene ABCB4 mediante
sequenziamento diretto. Nei pazienti PFIC3 già arruolati col precedente studio e nei pazienti adulti
si ricercheranno grossi riarrangiamenti genici facendo uso del Kit “SALSA MLPA KIT P109
ABCB4" (MRC Holland, Amsterdam, Holland).
3) Analisi funzionale degli alleli mutanti
WP3 (6-24 mesi)
Il cDNA di ABCB4, sintetizzato mediante RT-PCR a partire da RNA totale umano di fegato, sarà
clonato nel vettore di espressione pVisionGFP-C (BioVision Inc, Mountain View, CA, USA).
L’inserto verrà fuso con la Green Fluorescent Protein (GFP) in modo da poter generare la proteina
di fusione GFP-ABCB4. In collaborazione con il laboratorio del TIGEM di Napoli (Dott.ssa G.
Meroni, Responsabile Prof. A. Ballabio), nella linea cellulare embrionale renale umana HEK293
verranno trasfettati il costrutto wild type e in seguito i costrutti con le singole mutazioni di ABCB4..
I cloni che esprimono una proteina ABCB4 mutata capace di raggiungere la membrana plasmatica
saranno oggetto di un saggio funzionale (Morita SY e coll., Hepatology 2007) che ne valuterà
l’efficienza residua dell’attività floppasica.
TITOLO
Analisi molecolare del gene ABCB4 nelle epatopatie colestatiche suggestive di deficit della
fosfatidilcolina biliare e valutazione funzionale di specifiche mutazioni identificate nei pazienti
Responsabile Scientifico
Dr Dario Degiorgio
Lab. Genetica Medica – Laboratorio di Analisi Chimico Cliniche e
Microbiologia R. Dr.E.Torresani
Utilizzo dei fondi:
borsa di studio: 12.500 Euro annuale
Viaggi, congressi, pubblicazioni e materiale per i due anni
TOTALE
25.000
10.000
35.000