PROGETTI A CONCORSO 2009-2010 - VINCITORI PROGETTO N. 25 CDR / 500/08 RESPONSABILE PROGETTO: DARIO DEGIORGIO FINANZIAMENTO: € 35.000,00 TITOLO Analisi molecolare del gene ABCB4 nelle epatopatie colestatiche suggestive di deficit della fosfatidilcolina biliare e valutazione funzionale di specifiche mutazioni identificate nei pazienti Responsabile Scientifico Dr Dario Degiorgio Lab. Genetica Medica – Laboratorio di Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia R. Dr.E.Torresani Unità Operative collaboranti - U.O. Centro Fibrosi Cistica - U.O. Gastroenterologia 1 - U.O.S. Patol. della Gravidanza. -IRCCS Maggiore MILANO- Prof.ssa C. Colombo -IRCCS Maggiore MILANO- Prof. M. Colombo -IRCCS Maggiore MILANO- Dr. B. Acaia Area per la salute della donna, del bambino e del neonato - Telethon Institute of Genetics and Medicine -TIGEM NAPOLI- Dssa G. Meroni Durata della ricerca Inizio ricerca: GENNAIO 2009; Fine ricerca DICEMBRE 2010 OBIETTIVI DELLA RICERCA Obiettivi del presente progetto sono i seguenti: 1) valutare il coinvolgimento del gene ABCB4 in un ampia casistica di adulti affetti da a) epatopatie colestatiche con diagnosi di (i) colestasi intraepatica della gravidanza, (ii) colestasi concomitante all'assunzione di contraccettivi orali, (iii) colangiopatie idiopatiche croniche; b) litiasi intraepatica/colelitiasi di colesterolo a esordio giovanile. 2) valutare l'incidenza dei grossi riarrangiamenti genici di ABCB4 come meccanismo patogenetico di malattia colestatica; 3) Eseguire l’analisi funzionale del gene ABCB4 mediante: a) valutazione del livello di espressione del gene ABCB4 wild type e di alcuni alleli ABCB4 mutati inseriti in vettori d’espressione e transfettati nella linea cellulare HEK293; b) valutazione della localizzazione nella membrana plasmatica della proteina ABCB4 wild type e della proteina ABCB4 mutata in HEK293 (valutazione di singoli cambi aminoacidici già identificati e descritti nel nostro precedente studio); c) valutazione dell’efficienza residua dell’attività floppasica per le proteine ABCB4 mutate che raggiungano correttamente la membrana plasmatica. RAZIONALE DELLA RICERCA/Innovazione rispetto allo stato dell'arte nel campo La proteina ABCB4 (ATP-binding cassette-subfamily B member 4) si dispone sulla membrana canalicolare degli epatociti dove partecipa alla secrezione biliare traslocando la fosfatidilcolina (PC) che dissolve gli acidi biliari nelle micelle impedendone così l’attività citotossica dello stato libero. Mutazioni puntiformi di entrambi gli alleli del gene ABCB4, fino all’80% rappresentate da sostituzioni nucleotidiche che comportano singoli cambi aminoacidici, sono documentate come causa della Colestasi Intraepatica Familiare Progressiva di Tipo 3 (PFIC3) in ambito pediatrico (Degiorgio e coll., 2007) e della litiasi intraepatica/colelitiasi di colesterolo a esordio giovanile. Inoltre, singoli cambi aminoacidici sono stati occasionalmente descritti nelle colangiopatie idiopatiche croniche dell’adulto; lo studio dell’open reading frame del gene ABCB4 di un’ampia coorte di pazienti adulti contribuirà sostanzialmente a chiarire l’epidemiologia delle epatopatie colestatiche con deficit di PC. Una relativamente alta omologia tra il gene ABCB1 e ABCB4 (raggiunge il 78% se si paragonano le due proteine) e la contiguità fisica (sono a circa 100 Kb di distanza) suggerisce che è ragionevole ricercare grossi riarrangiamenti tra i due geni omologhi, perché potrebbero rappresentare un meccanismo molecolare di malattia colestatica. Gli studi più recenti relativi ai singoli cambi aminoacidici di ABCB4, quali l’esclusione di un significato polimorfico e i risultati dell’analisi speculativa in silico, suggeriscono un deficit dell’attività floppasica della proteina ABCB4 mutata; allo stesso tempo, l’assenza di studi funzionali esaustivi delle mutazioni missense non consente di conoscere né l’entità del deficit dell’attività floppasica, né quali possano essere i più comuni meccanismi patogenetici che sottendono alla deficienza dell’attività stessa della proteina ABCB4. L’analisi funzionale delle proteine ABCB4 con singoli cambi aminoacidici in cellule HEK239, opportunamente ingegnerizzate, può consentire di stabilire quali e quanti sono i genotipi mutati che promuovono la sintesi della proteina ABCB4-misfolded sequestrata dal reticolo endoplasmico, la sintesi della proteina ABCB4-misfolded che ha difficoltà nell’inserzione nel doppio foglietto lipidico della membrana plasmatica e la sintesi della proteina ABCB4-misfolded correttamente inserita attraverso il doppio foglietto lipidico della membrana plasmatica ma con deficiente abilità nella traslocazione della PC. La realizzazione del progetto consentirà pertanto di (i) indagare con quale frequenza una colangiopatia idiopatica dell’adulto è da ascrivere a deficit di PC biliare, (ii) indagare nuovi meccanismi molecolari causa di mutazione genica di ABCB4, (iii) stabilire i meccanismi molecolari con cui il singolo cambio aminoacidico è causa di deficit dell’attività floppasica ovvero stabilire una migliore correlazione genotipo/fenotipo e quindi l’utilizzo/ la validazione a scopo diagnostico e prognostico del test genetico di ABCB4. DISEGNO DELLO RICERCA Il progetto si articola in tre fasi principali: 1) Arruolamento dei pazienti WP1 (0-12 mesi) La U.O. di Gastroenterologia 1 (Prof. M. Colombo) e la U.O.S. Patologia della Gravidanza (Dssa Barbara Acaia) arruoleranno rispettivamente i pazienti adulti con diagnosi di epatopatia colestatica cronica e colestasi intraepatica della gravidanza. 2) Analisi di sequenza e ricerca dei grossi riarrangiamenti WP2 (0-18 mesi) Il laboratorio di Genetica Medica eseguirà l’analisi molecolare del gene ABCB4 mediante sequenziamento diretto. Nei pazienti PFIC3 già arruolati col precedente studio e nei pazienti adulti si ricercheranno grossi riarrangiamenti genici facendo uso del Kit “SALSA MLPA KIT P109 ABCB4" (MRC Holland, Amsterdam, Holland). 3) Analisi funzionale degli alleli mutanti WP3 (6-24 mesi) Il cDNA di ABCB4, sintetizzato mediante RT-PCR a partire da RNA totale umano di fegato, sarà clonato nel vettore di espressione pVisionGFP-C (BioVision Inc, Mountain View, CA, USA). L’inserto verrà fuso con la Green Fluorescent Protein (GFP) in modo da poter generare la proteina di fusione GFP-ABCB4. In collaborazione con il laboratorio del TIGEM di Napoli (Dott.ssa G. Meroni, Responsabile Prof. A. Ballabio), nella linea cellulare embrionale renale umana HEK293 verranno trasfettati il costrutto wild type e in seguito i costrutti con le singole mutazioni di ABCB4.. I cloni che esprimono una proteina ABCB4 mutata capace di raggiungere la membrana plasmatica saranno oggetto di un saggio funzionale (Morita SY e coll., Hepatology 2007) che ne valuterà l’efficienza residua dell’attività floppasica. TITOLO Analisi molecolare del gene ABCB4 nelle epatopatie colestatiche suggestive di deficit della fosfatidilcolina biliare e valutazione funzionale di specifiche mutazioni identificate nei pazienti Responsabile Scientifico Dr Dario Degiorgio Lab. Genetica Medica – Laboratorio di Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia R. Dr.E.Torresani Utilizzo dei fondi: borsa di studio: 12.500 Euro annuale Viaggi, congressi, pubblicazioni e materiale per i due anni TOTALE 25.000 10.000 35.000