RELAZIONE DI ATTIVITA’ DI RICERCA DEL PRIMO ANNO DI DOTTORATO
di Fabio Cannone
Dottorato in Fisica
Ciclo XVIII
Oggetto di indagine di questa tesi di dottorato sono i:biosensori. I biosensori sono delle strutture
composte da più biomolecole che permettono di rilevare particolari processi all’interno della
cellula. I biosensori, in particolare, sono costituiti da due molecole in grado di essere rilevate
all’interno della cellula poiché emettono fluorescenza. In questo primo anno sono state studiate le
proprietà di due proteine in grado di produrre fluorescenza e quindi di essere inserite all’interno di
un biosensore. Per rendere un biosensore funzionale e facilmente utilizzabile le proteine
fluorescenti che lo costituiscono debbono essere resistenti e produrre costantemente un buon
segnale di fluorescenza. Le proteine che in questo anno sono state indagate sono due mutanti di una
molecola naturalmente fluorescente: GFP (Green Fluorescence Protein) dette GFPmut2 ed E 2GFP.
Ogni proteina mantiene la sua funzionalità fin tanto che essa mantiene la sua forma nativa. La
GFPmut2 ha come funzione quella di emettere luce. Esistono particolari condizioni, variazioni di
temperatura , di acidità dell’ambiente , presenza di una agente denaturante, che modificano la
struttura della proteina, facendola passare dalla forma nativa ad una forma denaturata. In questa
configurazione denaturata la proteina non è più funzionale, cioè non emette più luce. In questo
primo anno è stato studiato il processo di denaturazione e rinaturazione della GFPmut2, in una
matrice di gel, in presenza di un agente denaturante come il Cloruro di Guanidinio (GdnHCl).
Questo studio è stata fatto a livello di singola molecola, cioè si è studiata, con la microscopia di
fluorescenza confocale a singolo fotone, la perdita di fluorescenza (denaturazione) ed il ritorno di
fluorescenza (rinaturazione) di ogni singola molecola di GFPmut2 osservabile. Sono stati svolti più
esperimenti di denaturazione, introducendo GdnHCl, e rinaturazione, eliminando dal gel il GdnHCl.
L’esperienze mostrano che la GFPmut2 dopo essere stata denaturata , può essere rinaturata con
successo, cioè , dopo aver eliminato dal Gel il GdnHCl, si osserva fluorescenza. Questo permette di
concludere che la GFPmut2 è una valida e resistente molecola fluorescente da introdurre nei
biosensori.
La E2GFP è un mutante della GFP altamente fluorescente. Inizialmente sono stati studiati con la
microscopia di fluorescenza a doppio fotone, sempre a livello di singola molecola, gli stati
fluorescenti della E2GFP, che risultano essere due ed altamente foto-convertibili. Come tutte le
molecole fluorescenti la E2GFP, dopo essere stata illuminata per un certo intervallo di tempo, perde
la sua capacità di emettere fluorescenza a causa del ”Bleaching”. Questo è descrivibile come una
transizione da uno stato fluorescente ad uno stato “dark”. Dalla letteratura è noto che il Bleaching è
un processo irreversibile. Le esperienza provano che questo non è vero per la E2GFP , cioè è
possibile recuperare la fluorescenza. Infatti se la proteina, nello stato dark, è eccitata ad
un’opportuna lunghezza d’onda, essa subisce una transizione da questo stato allo stato fluorescente.
Cioè per la E2GFP è possibile ottenere fluorescenza dopo il fenomeno del Bleaching. Quindi la
E2GFP è una proteina fluorescente perenne, e quindi un’altra valida candidata per la costruzione di
biosensori.
