Relazione dell’attività di Ricerca svolta, durante il secondo anno di dottorato,
da Fabio Cannone
Durante il primo anno di attività abbiamo studiato le proprietà spettroscopiche, quali l’emissione di
fluorescenza, il tempo di vita e il tempo di foto-daneggiamento, di un mutante della Green
Fluorescence Protein (GFP) detto GFPmutant2. La proteina, fissata in gel di silice, è stata studiata
tramite microscopia di fluorescenza con eccitazione a doppio fotone a livello di singola molecola.
Nel secondo anno la GFPmutant 2 (abbreviata GFPmut2) è stata caratterizzata nelle nanocapsule
con la stessa tecnica. Le nanocapsule sono dei nano-dispositivi sferici aventi un diametro di circa
4.5 m composti da un core cristallino e da una sequenza di layers polielettrolitici, carichi
alternativamente positivamente e negativamente, che avvolgono il cristallo. Tale strutture sono state
pesante quali possibili vettori di marcatori fluorescenti in differenti ambienti liquidi. Misure di
microscopia a forza atomica, svolte presso il dipartimento di Fisica dell’Università di Genova, con
cui collaboriamo, hanno provato che tali nano dispostivi risultano essere altamente stabili e
resistenti. La GFPmut2 è stata studiata in due regioni delle nanocapsule.
In primis, la proteina è stata legata al layer più esterno della nanocapsula. Le misure su singole
GFPmut2 così fissate hanno provato la presenza di due popolazioni. Le misure di spettroscopia e di
denaturazione chimica indicano che una delle due famiglie risulta più efficiente in emissione e più
resistente alla denaturazione. Misure di anisotropia statica e di microscopia a forza atomica provano
che questa famiglia è composta da singole GFPmut2 che risultano essere poste in cavità che il layer
più esterno forma proteggendo e stabilizzando la proteina stessa.
Sono state monitorate 900 singole molecole di GFP legate tra due layers interni, uno positivo e
l’altro negativo. Le misure indicano tre popolazione con fluorescenza tempo di vita differenti. La
presenza di più popolazioni è spiegabile con il fatto che le singole GFPmut2 risentono di ambienti
carichi differentemente. In particolare la famiglia di GFP che risente maggiormente dell’effetto del
layer negativo è altamente fluorescente e stabile. In questo caso non sono state fatte misure di
denaturazione poiché gli agenti denaturanti non penetrano tra i layers.
Le misure fin qui svolte provano che la proteina legata nei differenti comparti delle nanocapsule
non viene danneggia al contrario subisce un processo di stabilizzazione.
