Colorazione del DNA con il DAPI

Colorazione del DNA con il DAPI
Il DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindole) è un colorante fluorescente che si lega
fortemente alle regioni ricche in A-T del DNA.
Figura 1. Struttura del DAPI
Ha la capacità di attraversare la membrana delle cellule intatte ed emette una
fluorescenza azzurra.
Il DAPI colora preferenzialmente il dsDNA associandosi ai cluster AT nel
solco minore, con un aumento di fluorescenza di circa 20 volte.
Figura 2. Spettri di eccitazione e di emissione del DAPI legato al dsDNA.
http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp01306.pdf
Per il DAPI legato a dsDNA
λeccitazione = 358nm
λemissione= 461 nm
PROTOCOLLO
1. Semina delle cellule Hep G2 in piastre petri nel terreno di coltura;
2. Crescita delle cellule per circa 24h in incubatore a 37°C in atmosfera
controllata;
3. Aspirazione del terreno di coltura e lavaggio con 1 ml di PBS (137 mM
NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4);
4. Aggiungere 1µl di DAPI (concentrazione finale 300nM) in 1 ml di PBS;
5. Incubare per circa 30 min a 37°C;
6. Visualizzare al microscopio a fluorescenza.
Figura 3. Immagine al microscopio a fluorescenza
Colorazione dei mitocondri con il MitoTracker Red
Il MitoTracker Red è un colorante utilizzato per visualizzare i mitocondri. Il
MitoTracker Red diffonde passivamente attraverso a membrana cellulare e si
accumula nei mitocondri funzionali.
Figura 4 Struttura MitoTraker
Il MitoTracker entra in cellula per diffusione passiva è ossidato a catione
fluorescente, entra nei mitocondri funzionali dove il gruppo reattivo cloro
metile reagisce con i gruppi tiolici delle proteine. Il composto coniugato è il
composto fluorescente.
La colorazione è molto semplice perché è sufficiente incubare le cellule con
MitoTraker probes che si accumulerà nei mitocondri funzionali.
Figura 5 Reazione in cellula del MitoTracker
Figura 6 Spettro di eccitazione e di emissione del MitoTracker Red
λeccitazione: 579 nm
λemissione: 599 nm
PROTOCOLLO
1. Semina delle cellule Hep G2 in piastre petri nel terreno di coltura;
2. Crescita delle cellule per circa 24h in incubatore a 37°C in atmosfera
controllata;
3. Aspirazione del terreno di coltura e lavaggio con 1 ml di PBS (137 mM
NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4);
4. Aggiungere 1µl di MitoTracker-Red (range di concentrazione finale 50
nM) in 1 ml di PBS;
5. Incubare per circa 30 min a 37°C;
6. Visualizzare al microscopio a fluorescenza.
Figura 7- Immagine al microscopio a fluorescenza