Training Course 2010
“Stem Cell Differentiation”
Napoli, 9-12 Novembre
Analisi dei marcatori molecolari della
pluripotenza e del differenziamento delle
cellule embrionali staminali (ES) murine
Cristina D’Aniello
Differenziamento in vitro delle cellule ES
Differenziamento in vitro
Analisi marcatori specifici:
• espressi solo dalla popolazione cellulare che si
intende analizzare
• non espressi dalle cellule indifferenziate
Metodi per la valutazione dei marcatori
del differenziamento
• Real-Time PCR
• Immunofluorescenza
Perché Real-Time PCR?
Misura l'amplificazione in tempo reale durante
la fase esponenziale della PCR, quando cioè
l'efficienza di amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di reazione,
permettendo di ottenere risultati molto più
accurati rispetto alla PCR tradizionale
Real-Time PCR
• amplificazione sequenza bersaglio in maniera sensibile
e specifica
• quantificazione dell’espressione genica in tempo reale
• identificazione del prodotto di amplificazione
specifico rispetto a prodotti aspecifici
• utilizzo del SYBR Green
• metodo del DDct per la quantificazione del livello di
espressione del gene d’interesse
Differenziamento cardiaco
Brachyury
Eomes
Mesp1
Mesp2
Nkx2,5
GATA4
Mef2C
ANP
α/β-MHC
MLC2a/v
Oct3/4
Nanog
T0
T2-T4
T12
NeuroD
Nestin
time
βIII-TUB
NF-L
NF-M
Differenziamento neurale
Marcatori del mesoderma primitivo
Eomes
FI
FI
Brachyury
day
0
2
4
8
10
13
day
0
2
4
8
10
13
Marcatori cardiaci precoci
Mesp2
FI
FI
Mesp1
day
0
2
4
8
10
13
day
0
2
4
8
10
13
Marcatori cardiaci
Tbx5
day
FI
FI
Nkx2.5
0
2
4
8
10
13
day
0
2
day
8
10
13
GATA4
FI
FI
Mef2c
4
0
2
4
8
10
13
day
0
2
4
8
10
13
Marcatori cardiaci tardivi
Mlc2v
0
2
4
8
10
day
13
0
2
MHC
FI
day
FI
FI
Mlc2a
day
0
2
4
8
10
13
4
8
10
13
Marcatori neurali
Nestin
800
FI
600
400
200
0
day
0
2
4
8
10
13
βIII tubulin
300
250
FI
200
150
100
50
0
day
0
2
4
8
10
13
Real-Time PCR: la reazione
Componenti della reazione:
- cDNA (ES; time course del differenziamento)
- oligonucleotidi
- Master mix (dNTP; DNA Polimerasi; probe fluorescente)
Cellule indifferenziate
Differenziamento cardiaco
Differenziamento neurale
Neuroni T7
precursori
EBs in sospensione
T4
Cardiomiociti
contrattili T10
Neuroni T10
SYBR Green
E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed
emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.
DENATURAZIONE
Non viene rilevata fluorescenza
SYBR Green
Primer
ANNEALING
L’intensità della fluorescenza
comincia ad aumentare
Luce emessa
ALLUNGAMENTO
L’intensità della fluorescenza continua
ad aumentare e diventa massima al
termine della fase di allungamento
Polimerasi
L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’
REGISTRATO A 530nm
Analisi della curva di melting
Consente di identificare il prodotto di amplificazione specifico rispetto
a prodotti aspecifici.
Curva di fluorescenza
100
104 copie
2.5
10 copie
2.0
0 copie
1.5
104 copie
10 copie
0 copie
80
1.0 Fluorescenza
3.0
Fluorescenza
Curva di melting
60
40
20
0
0.5
0
65
0
10
20
30
40
70
80
85
90
95
Temperatura (°C)
50
Cicli di amplificazione
Derivata negativa della curva di melting
100
104 copie
10 copie
0 copie
prodotti non
specifici
80
-dF/dT
Al termine della PCR la temperatura viene
lentamente aumentata inducendo un decremento
della fluorescenza.
La temperatura in corrispondenza della quale si
ha un repentino decremento della fluorescenza
corrisponde alla Tm del prodotto.
75
60
TM
40
20
0
65
70
75
80
85
Temperatura (°C)
90
95
Quantificazione
ASSOLUTA:
i campioni sono quantificati in modo assoluto.
Necessita di standard di cui si conosce la
concentrazione assoluta (utilizzo di una standard
curve). Per tutti gli unknowns devono essere saggiate
identiche quantità di campioni.
RELATIVA:
la quantificazione viene effettuata paragonando i CT.
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una
standard curve). Gli unknowns vengono “quantificati”
paragonando il loro DCT con quello del controllo
endogeno.
Real-Time PCR: analisi del risultato
CT= è il ciclo soglia definito come il numero di cicli richiesti
affinchè la fluorescenza superi il background. Il CT è
inversamente proporzionale alla quantità di gene target
presente nel campione.
CT medio= media del triplicato tecnico
DCT= CT medio (gene target) - CT medio (housekeeping)
DDCT= DCT campione in esame - DCT controllo
Fold induction= 2^-DDCT
