Transferasi che hanno come coenzima FOSFOPANTOTEINA E COENZIMA A (derivati dalla VITAMINA B3 ) Altre transferasi hanno come CoE: Vitamina B3 (sintetizzata in vegetali e molti procarioti anche ospiti dell’intestino crasso di molti vertebrati). Queste cellule usano come base di partenza la valina e l’acido aspartico. O HO CH3 O OH O NH2 Acido aspartico Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry H3 C OH NH2 valina 1 Sintesi della Vit. B3 La valina è sottoposta ad un processo di transdesaminazione si ha uscita di NH3 e sostituzione con OH diventa α-chetoacido. CH3 O CH3 O H3C CH3 O OH NH2 H3 C OH + NH2-enzima H3 C NH + OH O enzima Valina ac. α−cheto β-metil butirrico base di Schiff Un secondo enzima riconosce questo substrato, ha nel sito attivo un residuo di lisina che può dare attacco nucleofilo sul C=O dell’α-chetoacido. A reazione ultimata si ottiene il substrato legato all’E con liberazione virtuale di H2O. Il composto è una Base di Schiff. Altri R aa presenti nel sito attivo protonano l’N. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 2 Sintesi della Vit. B3 Si scatena così la trasposizione del doppio legame nel substrato con dissociazione dal Cβ di 1 H + . Il ritorno alla forma di risonanza precedente (eq.tra le forme di risonanza) rende il Cβ carbanionico ed in grado di accettare certi gruppi (uno di questi è l’idrossimetile + CH2OH) CH3 C H C CH3 CH3 + N H enzima CH COOH 3 COOH CH3 C C C H+ N H enzima C CH3 + N H enzima CH3 CH3 CH3 + CH2OH Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 3 Sintesi della vit B3 Poi avremo deprotonazione dell’N della base di Schiff. Idrolisi del doppio legame alla fine il prodotto sarà il derivato precedente che si è accresciuto del gruppo –CH2OH. Il Cα è ridotto a gruppo alcolico secondario da una oxred. NAD dipendente). PRODOTTO FINALE che esce dal sito attivo dell’enzima: α,γ diossi- βdimetil butirrico o ACIDO PANTOICO COOH C O H3C C H2C CH3 OH COOH C OH H C H3C H2C CH3 OH ACIDO PANTOICO Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 4 Sintesi della Vit. B3 2) L’acido aspartico, attraverso un E liasico viene solo decarbossilato sulla posizione 1. Questa decarbossilazione lo trasforma in una struttura con un C in meno, è un aa ma non α-aa: è un β-aa β ALANINA. O HO CH2 CH2 O HO C CH2 CH2 OH NH2 CH2 O ac.aspartico CH3 NH2 β-alanina Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 5 Sintesi della Vit. B3 SINTESI vit B3. Ultima tappa: unione di acido pantoico e β-alanina. La reazione è promossa da un Manganese-Enzima. Il Mn lega con legame dativo l’O del carbossile poi il legame da dativo a covalente (il Mn aumenta il suo numero di covalenza). Si ha una sottrazione di OH ed il carbocatione che resta subisce l’attacco nucleofilo dell’NH2 della β-alanina. Mn- Enzima vitamina B3. + H H3C acido pantoico COOH C OH C H2C CH3 OH H H3C COOH C OH C H2C Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry CH3 OH H2N CH2 CH2 + COOH β-ALANINA 6 Vitamina B3: acido pantotenico OH H 3C HO C CH 2 C NH CH 2 O CH 2 C CH3 O OH AC. PANTOTENICO o vit B3 E’ la molecola base con cui tutte le cellule costruiscono i CoE per le transferasi B3 dipendenti. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 7 Vit B3: Formazione del coenzima La prima trasformazione è rappresentata dalla marcatura per fosforilazione, transferasi cinasica, che destabilizza con il metallo di transizione l’ultimo legame di ATP Si forma fosfato catione che dà attacco elettrofilo nell’ossidrile. ATP ADP + Pi ACIDO FOSFOPANTOTENICO OH H 3C PH O C CH 2 C NH CH3 O Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry CH 2 O CH 2 C OH 8 Vit B3: Formazione del coenzima. FOSFOPANTOTEINA La seconda trasformazione riguarda il terminale carbossilico. (CISTEINA) Intervengono 2 metalloproteine distinte 1) ospita nel sito attivo il terminale carbossilico e l’aa cisteina. Il metallo di transizionesi lega all’O dell’OH virtuale sottrazione di H2O il carbossilecatione può ricevere attacco nucleofilo dall’NH2 della cisteina (virtuale saturazione di H2O) HO OH H3C OH O P HO C NH CH O C CH2 CH2 C CH3 CH2 O O + C H2N O H C CH2 SH OH OH H3C OH O P HO O CH2 NH CH C C CH3 O CH2 CH2 NH COOH C CH O CH2 SH FOSFOPANTOTENILCISTEINA Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 9 Vit B3: Formazione del coenzima. FOSFOPANTOTEINA 2) il secondo enzima riconosce ed accoglie il terminale cisteinico il Me riconosce l’O del carbossile (legato col doppio legame al C) Interazione prima dativa poi covalente, sottrazione del carbossile come catione. FOSFOPANTOTEINA La cisteina diventa cisteamina La fosfopantoteina può già essere molecola Coenzimatica. OH H3C OH O P HO CH C O CH2 NH C CH3 CH2 O CH2 NH C CH CH2 SH O Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 10 Enzimi a fosfopantoteina L’enzima accettore ha nel sito attivo un residuo di Ser. Poi per azione dell’E con il metallo di transizione che destabilizza il legame a cui partecipano i fosforili E legato alla fosfopantoteina. Enzima-CH2OH +ATPÆEnzima- CH2OP ÆEnzima- CH2OPP + P Pantoteina ÆEnzima- P-Pantoteina-SH In queste proteine la fosfopantoteina è legata covalentemente all’apoproteina. La fosfopantoteina si comporta come un braccio mobile (ex: sostituzione dimetilica) piuttosto lungo con alternanza di tratti idrofobici ed idrofilici (sostituzioni alcoliche e legami carbammidici) Questa alternanza di centri idrofilici ed idrofobici può creare interazioni con aa di diversi domini che circoscrivono la zona in cui si inserisce il gruppo prostetico braccio separatore e mobile quando interagisce con gruppi diversi in diverse direzioni trascina con questi spostamenti e indirizza in diverse direzioni il –SH che deve trasportare il substrato. SUBSTRATO acili a catena più o meno lunga (dall’acido acetico-2C- a quello serotico a-26 C-) Dagli acili più semplici a quelli a lunga catena. La fosfopantoteina diventa CoE legato covalentemente ad enzimi di trasporto degli acili ed i movimenti del “braccio spaziatore” sono trasmessi al –SH che è legato, con legame tioestere agli acili e li può trasportare, orientarli verso altre proteine, enzimi. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 11 Vit B3: Formazione del Coenzima A La fosfopantoteina può essere intermedio nella sintesi di altri CoE. Possibilità di interazione della fosfopantoteina con una struttura che mantiene un derivato pirofosforico (PPi), cioè l’ATP. Mn-Enzima Un Mn-Enzima riconosce e destabilizza il primo legame pirofosfato. ATP + P PANTOTEINA Æ PPi + Defosfo CoASH Interazione attacco nucleofilo che l’O del fosforile del cosubstrato può esercitare. (sulla base dell’AMP si inserisce la Ppantoteina) AMP + PPANTOTEINA ATP → ADP + Pi (sull’OH 3’ del riboso dell’adenina) DefosfoCoASH + ATP ADP + CoASH (ultimo passaggio→ CoA attivo) E’ una reazione di trasferimento. CoEnzimaA Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 12 Coenzima A NH2 N N OH O N N O OH O O P O OH H3C OH P O CH C O CH2 NH C CH3 O CH2 CH2 NH C CH CH2 SH O OH P O HO Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 13 CoA: interazione con l’apoproteina e funzioni Il CoA acquista così una carica più evidente che lo fa riconoscere dalle sue apoproteine. La molecola non è lineare ma c’è un ripiegamento attorno alla struttura pirofosforica; questo fa sì che l’adenina che può transire da lattimica a semilattamica, si può trovare affacciata al SH terminale. Anche in questo caso il CoE agisce solo con metalli cofattori. L’effetto è una variazione del pK del SH che può essere in grado di accettare il substrato (o, cambiando il pK, di dissociarlo). Il substrato è sempre un acile che si unisce sempre con legame tioestereo. (dall’acetato→ acetilCoA all’acile più lungo, es.cerobilCoA). L’interazione con la proteina è di 2 tipi 1) Interazioni idrofilico-idrofobiche sui domini esterni dell’apoproteina (come per la Ppantoteina) (Qui il braccio non è molto oscillante ma può interagire.) 2) legami salini (più forti) col P in 3’ (nella forma inattiva desforilata non si ha il legame con l’apoproteina) L’enzima non si lega all’apoproteina. Le interazioni saline sono dovute alla conformazione delle apoproteine (del sito attivo). I cambiamenti di conformazione fanno variare di un fattore compreso tra 103 e 106 il coefficiente di dissociazione CoE-apoproteina. Il CoA + substrato (ACILE) possono trasferirsi a diverse proteine e ad ogni trasferimento può avvenire una ulteriore trasformazione del substrato. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 14 Funzioni metaboliche vit B3 Gli enzimi trasportatori di acili interessano alcuni catabolismi ossidativi degli acili. (β-ossidazione, ciclo di Krebs-indirettamente:respirazione cellulare- demolizione o sintesi) Lesione da carenza di B3 riguarda: → respirazione cellulare → metabolismo lipidico Macroscopicamente: lesioni sui tessuti a flusso metabolico maggiore: muscolatura, tessuto nervoso ed epiteli: nevriti, miositi (aberrazioni muscolari), infiammazioni degli epiteli. Prof. G. Gilardi - Biological Chemistry 15