Lo scopo della tesi è stato quello di verificare se mutazioni nel gene

Lo scopo della tesi è stato quello di verificare se mutazioni nel gene, che codifica per il canale del
potassio Kir4.1 (KCNJ10), inducono modificazioni nell’attività della proteina, in pazienti
appartenenti ad un particolare sottogruppo dello spettro autistico, che è stato denominato come
"fenotipo autismo-epilessia".
Per verificare se i canali Kir fossero responsabili del fenotipo oggetto di studio, il gene KCNJ10 è
stato analizzato alla ricerca di mutazioni da DNA genomico estratto da leucociti del sangue
periferico dei pazienti e utilizzando tecniche standard di genetica molecolare.
Successivamente attraverso studi funzionali, utilizzando la tecnica elettrofisiologica del TEVC
(two-electrode voltage-clamp) e del patch clamp, si è analizzato l’effetto delle mutazioni
identificate sull’attività del canale Kir4.1. I risultati ottenuti mostrano che queste mutazioni
inducono una gain-of-function dell’attività del canale sia attraverso un aumento di espressione in
superficie o della conduttanza della proteina.
I canali Kir 4.1 sono abbondantemente espressi negli astrociti in cui assieme al Kir5.1
contribuiscono al buffering di K+. La disfunzione dell’omeostasi del K+ indotta dalle mutazioni del
canale Kir4.1, in pazienti con DSA e suscettibilità all’epilessia, potrebbe contribuire allo sviluppo
del fenotipo autistico e degli attacchi epilettici, alterando l’eccitabilità e la funzione sinaptica, e
potrebbe rappresentare un target per nuovi approcci terapeutici.
In questo studio abbiamo individuato per la prima volta mutazioni nel gene che codifica per il
canale del potassio Kir4.1 associate ad attacchi epilettici, DSA e deficit intellettivo. Inoltre abbiamo
dimostrato che queste mutazioni, che cambiano residui altamente conservati nella struttura, alterano
l’attività del canale sia attraverso un aumento di espressione della proteina in membrana sia
attraverso un aumento di conduttanza del canale.
E’ noto che epilessia e DSA sono fortemente associati. La prevalenza degli attacchi epilettici è
infatti maggiore nei malati con DSA (5-6%) (Bryson et al., 1988; Hughes and Melyn, 2005),
rispetto alla popolazione generale (0.5-1%). La presenza di autismo nei pazienti epilettici è
approssimativamente del 32%, un valore circa cinquanta volte superiore rispetto a quello riscontrato
nella popolazione generale (Clarke et al., 2005). Pertanto, è stato definito il fenotipo “autismoepilessia” e i meccanismi patogenetici comuni sono statti ipotizzati (Tuchman et al., 2009). Nel
nostro studio sono state identificate due famiglie portatrici delle nuove mutazioni in KCNJ10.
Una penetranza ridotta è stata osservata in tre portatori apparentemente asintomatici delle mutazioni
ed in uno che era leggermente colpito dalla mutazione. La penetranza incompleta è possibile nelle “
canalopatie” (Camerino et al., 2008; Li and Lester, 2001), in particolare quando colpiscono il
sistema nervoso centrale (Gargus, 2009). Alternativamente, dovrebbe essere considerata la presenza
di mutazioni del gene KCNJ10 in uno scenaro multigenico più complesso (Abrahams and
Geschwind, 2008; Toro et al., 2010). Tuttavia non si può escludere che altri meccanismi, quali
metilazione di un allele paterno o effetto genitore di origine o altri fattori genetici o epigenetici
possano contribuire all’espressione clinica delle variabili indotte dalle mutazioni del gene KCNJ10.
Per esempio, i fattori epigenetici sono considerati possibili cause della penetranza ridotta delle
mutazioni in KCNJ11 (Pinney et al., 2009). D’altra parte, i DSA non seguono le classiche leggi di
Mendel (Gupta and State, 2007) e il tasso di concordanza tra gemelli monozigoti può essere basso
(40%) (Rosenberg et al., 2008). Le manifestazioni psichiatriche osservate nel caso A-II:1 indicano
la diagnosi della sindrome di Tourette e disordini ossessivi-compulsivi. I risultati suggeriscono che
questi disordini psichiatrici e DSA condividono delle similarità in fenomenologia, struttura del
cervello, caratteristiche famigliari e genetiche (Hollander et al., 2009). I genitori e i fratelli dei
pazienti autistci mostrano spesso manifestazioni di autismo subcliniche, il così detto “fenotipo di
ampio autismo”(Pive net al., 1997), suggerendo che DSA è associato debolmente con le varianti
preesistenti nei genitori. La possibilità che KCNJ10 possa essere non correlato con il fenotipo, non
può essere esclusa. I DSA non erano fra le caratteristiche cliniche associate con EAST/sindrome
SeSAME e la mutazione autosomica recessiva del gene KCNJ10 e la disabilità intellettuale non
erano
obbligatoriamente
una
manifestazione
EAST/sindrome SeSAME compromettevano
della
malattia.
Mutazioni
bialleliche
in
la funzione del canale attraverso differenti
meccanismi di loss-of-function, quali una riduzione dell’espressione in superficie del canale,
riduzione del tempo di apertura medio e uno spostamento della sensibilità al pH ad un range
alcalino (Reichold et al., 2010; Sala-Rabanal et al., 2010; Tange t al., 2010). Questi difetti
funzionali sono stati proposti per essere alla base delle manifestazioni renali della malattia,
includendo alcalosi metabolica ipokaliemica e attivazione del sistema renina-angiotensinaaldosterone.
I nostri pazienti esibiscono un fenotipo neuropsichiatrico puro, senza manifestazioni di danni renali
o inibizione dell’udito. I meccanismi molecolari sono diversi, grazie ai quali le nuove mutazioni del
gene KCNJ10 contribuiscono alla malattia. In particolare, la mutazione V84M che è localizzata in
TM1, vicino alla superficie membrana/acqua, incrementava la conduttanza del canale producendo
un effetto di gain-of-function. Questo risultato strutturale e funzionale suggerisce che questa
mutazione altera il gating del canale o l’interazione tra il canale e i lipidi del doppio strato di
membrana. Interessante notare che la mutazione dei canali Kir3.2 in TM1 (N94H) risulta nei canali
costitutivamente attivi e le correnti di base sono circa 30 volte più ampie rispetto WT (Yi et al.,
2001). D’altra parte, la mutazione R18Q, localizzata nella parte N-terminale dei canali Kir4.1,
genera una gain-of-function del canale provocando un aumento dell’ampiezze della corrente wholecell, senza cambiare la conduttanza del canale, la probabilità di apertura e il tempo medio di
apertura. Tutto ciò suggerisce che la mutazione R18Q aumenta l’espressione della proteina sulla
superficie cellulare. Questa conclusione è supportata dai risultati di struttura funzione ottenuti dai
canali Kir3.2. La mutazione S9A in Kir3.2 incrementava l’ espressione in superficie di circa 3 volte
rispetto al WT in cellule HEK293 senza cambiamento della conduttanza del canale (Chung et al.,
2009). Gli allineamenti di sequenza hanno rilevato che sia la mutazione S9A in Kir3.2 e la
mutazione R18Q in Kir4.1 risiedono in un dominio simile in posizione N-terminale del canale e
probabilmente condividono meccanismi di azione comuni. Le mutazioni R18Q e V84M causavano
un drammatico incremento della correnti istantanee del canale eteromerico Kir4.1/Kir5.1 e
abolivano quasi completamente la componente lenta della corrente, denotando una risposta più
veloce e più efficiente
dei canali mutati. Il fatto che la sensibilità al pHi dei canali mutati
Kir4.1/Kir5.1 è simile al WT dimostra che l’assemblaggio delle subunità mutate Kir4.1 ha luogo
normalmente, indipendentemente dalla mutazione. Una serie di evidenze convalidano che le
mutazioni in KCNJ10 dovrebbero contribuire alla disfunzione del cervello, suscettibilità agli
attacchi e DSA. Kir4.1 svolge un ruolo importante nel "buffering spaziale" della concentrazione
extracellulare K+ ([K+]o) che è essenziale per il mantenimento dell'attività neuronale (Chever et al.,
2010). Gli astrociti sono il 90% delle cellule che compongono il cervello umano e ogni astrocita
controlla l’attività di molte sinapsi (circa 140000 nell’ippocampo) (Benarroch, 2009). La
manifestazione sia di epilessia sia di ASD in pazienti portatori di mutazioni gain-of-function del
gene KCNJ10
suggerisce che la disfunzione del buffering di K+ astrociti-dipendenti da
K+
dovrebbe essere un meccanismo comune che contribuisce sia agli attacchi sia alle caratteristiche
nei ASD. Inoltre le registrazioni su campioni di pazienti con epilessie intrattabili hanno dimostrato
una riduzione della conduttanza dei canali Kir negli astrociti (Bordey and Sontheimer, 1998) e della
rimozione del potassio (Jauch et al., 2002). Topi knockout per Kir4.1 mostrano attacchi indotti da
stress (Djukic et al., 2007). Gli attacchi e il ritardo mentale sono parte dello spettro clinico delle
mutazioni loss-of-function in Kir4.1. (Bockenhauer et al., 2009; Scholl et al., 2009). La relazione tra
KCNJ10 e ASD sembra poco lineare. Tuttavia, uno studio recente di linkage su una famiglia
Finlandese ha proposto KCNJ10 come gene candidato per ASD (Kilpinen et al., 2009). KCNJ10 è
stato considerato un possibile responsabile sia di ASD e sia dei topi privi di MECP-2, in modelli
animali della sindrome di Rett (Zhang et al., 2010). E’ stato proposto che la mutazione loss-offunction dovrebbe favorire l’accumulo extracellulare di K+, contribuendo all’ipereccitabilità
neuronale e epilessia (Chever et al., 2010; Orkand et al.,1966). Nelle cellule gliali knock-out per i
canali Kir4.1, non sono state osservate delle variazioni del potenziale di membrana durante
l’incremento di [K+]o indotto da stimolazione nervosa (Chever et al., 2010). Recentemente, è stato
dimostrato che un episodio isolato di iperattività locale neuronale scatena un grande aumento di
calcio negli astrociti vicini. Gli astrociti attivati rieccitano i neuroni generando la scarica sincrona
tipica dell’attacco epilettico. L’analisi funzionale effettuata in questo studio suggerisce, come un
meccanismo patogenetico alternativo, che l’incremento e il più veloce flusso di K + negli astrociti
attraverso i canali Kir4.1 durante l’intensa attività neuronale, dovrebbe aumentare la
depolarizzazione di membrana e aumentare la concentrazione di calcio in queste cellule. Le elevate
concentrazione di calcio negli astrociti sono connesse con il rilascio di gliotrasmettitori, come
glutammato e D-serina che attivano la scarica dei neuroni, promuovendo un’ attività epilettica e la
sincronia neuronale locale (Angulo et al., 2004; Bezzi et al., 1998; Felli net al., 2004; Mothet et al.,
2005; Parpura et al., 1994; Pasti et al., 2001; Tian et al., 2005). Quindi il ciclo eccitatorio ricorrente
neurone-astrocita-neurone dovrebbe svilupparsi in un sito ristretto del cervello, come conseguenza
della gain-of-function dei canali Kir4.1 e contribuire allo sviluppo degli attacchi. L’alto livello di
espressione dei canali Kir4.1 e Kir5.1, canali eteromerici presenti sui neuroni del Locus Coeruleus
(LC) (D’Adamoet al., 2010), suggerisce che queste mutazioni dovrebbero alterare il sistema
noradrenergico (NA) del cervello (LC-NA) . (Samuels and Szabadi, 2008). Il LC produce e
trasporta tutta la noradrenalina (NA) nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo e la maggior parte
delle fibre NA in altre parti del nevrasse, compreso il cervelletto. Una alterazione nello sviluppo di
questa rete potrebbe causare comportamenti autistici negli uomo (MeHler and Purpura, 2009).
Inoltre, l’ upregolazione di Kir4.1 è stata individuata nei neuroni LC di topi knock-out per MECP2. Questa sovraespressione di Kir4.1 altera la neuromodulazione dei neuroni LC, inducendo
comportamenti autistici che si verificano nella sindrome di Rett (Zhang et al., 2010). Sia le
caratteristiche autistiche sia quelle conoscitive possono essere legate a eventi di sviluppo postnatali,
dovuti a cambiamenti nella attività sinaptica coinvolti nei meccanismi di plasticità sinaptica per
l’apprendimento e la memoria (Hong et al., 2005; Zoghbi, 2003). L’attività dei canali Kir4.1 mostra
una regolazione durante lo sviluppo, che correla sia con la differenziazione delle cellule e sia con la
regolazione durante lo sviluppo delle dinamiche extracellulare di K+ (Connors Et al., 1982;
MacFarlane and Sontheimer, 2000; Neusch et al., 2001). Inoltre le sostanze neuroattive rilasciate
dagli astrociti regolano varie funzioni tra le quali l’eccitabilità neuronale (D’Adamo et al., 2010;
Tian et al., 2005), la trasmissione sinaptica eccitatoria e inibitoria e la plasticità (Beattie et al., 2002;
Fiacco and McCarthy, 2004; Kang et al., 1998; Pascual et al., 2005; Yang et al., 2003), come anche
la sinaptogenesi e i collegamenti neuronali (Collazos-Castro and NietoSampedro, 2001; Elmariah et
al., 2005; Fase net al., 2003; Ullian et al., 2004).
Quindi i possibili effetti delle mutazioni R18Q sull’aumento di espressione e V84M
sulla
conduttanza del singolo canale, alterano i diversi meccanismi correlati all’omeostasi del K+ , alla
differenziazione cellulare e alla plasticità sinaptica.
I risultati suggeriscono che il meccanismo molecolare che contribuisce all’ autismo/epilessia con
disabilità mentale si correla a un incremento di espressione in superficie o della conduttanza dei
canali Kir4.1, o entrambi gli aumenti.
Gli astrociti dovrebbero rappresentare un target cruciale del controllo farmacologico per alterazioni
sinaptiche e scariche elettriche anormali.