LEZ 06 BIOCHIMICA x TBA ODDI 2015_2016

La catalisi enzimatica
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Le proprietà generali degli enzimi
Concetti chiave
• Gli enzimi si differenziano dai catalizzatori chimici di
uso comune per velocità, condizioni, specificità e
controllo della reazione.
• Le proprietà fisiche e chimiche uniche del sito attivo
limitano l'attività degli enzimi a substrati e reazioni
specifiche.
• Alcuni enzimi richiedono ioni metallici o cofattori
organici.
Il fattore 1011
Fig. 8-1.jpg
Termodinamica e cinetica chimica
Velocità di Reazione
Catalisi Chimica vs Enzimatica
Le velocità delle reazioni catalizzate
dagli enzimi sono elevate
Gli enzimi agiscono
su substrati specifici
Interazioni stereospecifiche
enzima-substrato
Gli enzimi sono macchine molecolari
Alcuni enzimi catalizzano reazioni
altamente stereospecifiche
Alcuni enzimi sono più permissivi
Gli enzimi sono classificati in base al
tipo di reazione che catalizzano
Classificazione degli Enzimi
http://www.expasy.org/enzyme
Nome raccomandato e
nome sistematico.
Numero di
Classificazione:
Numero a quattro cifre
preceduto da EC
(Enzyme Commission: la
prima cifra indica la
classe, la seconda la
sotto-classe, la terza la
sotto-sotto-classe, la
quarta il numero
seriale).
Unità di attività enzimatica e dosaggio degli Enzimi
Catal (kat, nel sistema SI): è la quantità di enzima che
converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1 secondo nelle
condizioni di reazione standard (ottimali).
L’Unità internazionale (U o UI): corrisponde alla quantità di
enzima che converte 1 mole di reagente nel prodotto in 1
minuto, nelle condizioni di reazione standard (ottimali).
Poiché 1 mole/min = 1,67 10-8 moli/s,
1U = 1,67 10-8 kat.
L’attività specifica: è il rapporto tra il numero di U o di kat e
il volume che la contiene (U/mL) o la quantità totale di
proteina espressa in milligrammi (U/mg).
Effetto del pH
L’attività enzimatica è influenzata dal pH. Ciò può derivare
dai valori di pKa del substrato e/o dell’enzima. Perciò il pH
scelto e la selezione di un tampone appropriato sono
fondamentali per i saggi di attività enzimatica.
Amminoacidi nel sito catalitico o implicati nella stabilizzazione della
conformazione nativa
Effetto della temperatura
Le reazioni enzimatiche, come le reazioni chimiche, dipendono
dalla temperatura; tuttavia, ad una determinata soglia, il moto di
agitazione termica denatura l’enzima
Proprietà
degli Enzimi
Gli enzimi,
come legenerali
altre proteine,
sono classificati come semplici (se
costituite esclusivamente da amminoacidi) o coniugati (se contengono
metalli o composti organici). Nel loro complesso, gli elementi non
amminoacidici che si aggiungono alla porzione proteica di un enzima
coniugato vengono detti cofattori.
La maggior parte dei cofattori organici, i coenzimi, sono derivati di
vitamine solubili in acqua.
Gli ioni metallici sono i più comuni cofattori inorganici. Gli enzimi la cui
forma attiva comprende uno o più metalli saldamente legati alla matrice
proteica (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Cu+, Zn2+, Mn2+, Co3+ o Mo3+) sono detti
metalloenzimi (un terzo degli enzimi conosciuti).
Gli enzimi attivati da metalli (Na+, K+, Mg2+ o Ca2+) richiedono solo un
legame debole di questi.
I cofattori ampliano il range
delle reazioni enzimatiche
APOENZIMA (Enzima – cofattore)
OLOENZIMA (Enzima + cofattore)
Coenzimi e Gruppi prostetici
Se i cofattori organici si legano reversibilmente
all’enzima, sono detti coenzimi (p.e., NAD, FAD).
Se i cofattori organici sono legati
permanentemente all’enzima, sono indicati
come gruppi prostetici (p.e., eme)
Esempi di enzimi e loro cofattori
Beriberi
Pellagra
Anemia
perniciosa
COFATTORI organici (e
vitamine)
NAD(P) niacina (o vit B3)
FAD e FMN riboflavina (o vit B2)
Ubichinone (o CoQ)
CoA pantotenato (o vit B5)
Eme
NTP
TPP tiamina
THF folato
PLP piridossina (o vit B6)
Biotina
Cobalammina vit B1
Cofattori.pdf
Scheda riassuntiva dei principali coenzimi
Struttura e reazione del NAD(P)+
Le proprietà generali degli enzimi
Punto di verifica
• Quali proprietà consentono di distinguere gli enzimi
dagli altri catalizzatori?
• Descrivete come sono classificati e nominati i diversi
enzimi.
• Quali sono i fattori che influenzano la specificità per il
substrato di un enzima?
• Per quale motivo i cofattori sono necessari per
determinate reazioni enzimatiche?
• Qual è la correlazione tra cofattori, coenzimi e gruppi
prostetici?
L'energia di attivazione e la coordinata di reazione
Concetti chiave
• Un enzima fornisce un percorso a bassa energia per
convertire un substrato in prodotto, ma non influenza la
variazione di energia libera complessiva della reazione.
Catalisi
Diagrammi dello stato di transizione
°
Perché due molecole possano reagire devono scontrarsi e rompere i legami che
tengono uniti i loro atomi; per far questo necessitano di sufficiente energia cinetica,
tale da portarsi in stretta vicinanza l’una con l’altra superando la repulsione tra i
rispettivi gusci elettronici. Lo stato di massima energia di un sistema di molecole
reagenti è detto complesso attivato o stato di transizione. La barriera energetica che
separa i reagenti dallo stato di transizione prende il nome di energia di attivazione
(ΔG≠).
Non si confonda ΔG con ΔG≠; il ΔG° (variazione di energia libera standard di
reazione) è invece una misura della stabilità termodinamica relativa tra reagenti e
prodotti. In altre parole, il ΔG° indica il punto di equilibrio della reazione.
Diagramma dello stato di transizione
di una reazione a due tappe
Effetto di un catalizzatore sul diagramma
dello stato di transizione
L'energia di attivazione e la coordinata di reazione
Punto di verifica
• Disegnate e identificate le varie parti dei diagrammi di
transizione di stato per una reazione con e senza il
catalizzatore.
• Qual è la relazione tra ΔG e ΔG‡?
I meccanismi di catalisi
Concetti chiave
• Le catene laterali degli amminoacidi in grado di
donare o accettare protoni possono prendere parte
alle reazioni chimiche come catalizzatori acidi o
basici.
• I gruppi nucleofili possono catalizzare le reazioni
tramite la formazione di legami covalenti transitori
con il substrato.
• Nella catalisi da ioni metallici le proprietà
elettroniche tipiche dello ione metallico favoriscono la
reazione.
• Gli enzimi accelerano le reazioni avvicinando i
gruppi reagenti e orientandoli correttamente.
• La stabilizzazione dello stato di transizione può
diminuire significativamente l'energia di attivazione di
una reazione.
Catalisi Acida Generale
Accelera la velocità della reazione mediante il
trasferimento temporaneo di un protone da un
acido di Bronsted al substrato.
Es., His 57 nel sito catalitico della chimotripsina
(primo stadio); His 119 nel sito catalitico della RNAsi
A
Catalisi Basica Generale
Accelera la velocità della reazione mediante il
trasferimento temporaneo di un protone dal
substrato ad una base di Bronsted.
Es., l’His 12 nel sito catalitico della RNAsi A e
l’His 57 nel sito catalitico delle serina proteasi
(secondo stadio)
Catalisi Acido-Base Generale
Prevede l’azione simultanea di un catalizzatore
acido generale e di un catalizzatore basico
generale sul substrato.
Es., le due istidine nel sito catalitico dell’RNAsi A.
Struttura dell'RNasi S pancreatica bovina
Il meccanismo dell'RNasi A
Il meccanismo dell'RNasi A
Il meccanismo dell'RNasi A
Catalisi covalente
Accelera la velocità edlla reazione attraverso la
formazione temporanea di legami covalenti tra
enzima e substrato. Prevede due tappe: òa
prima, la tappa nucleofila serve per formare un
legame covalente tra enzima e substrato; la
seconda è la tappa elettrofila in cui si ha la
perdita di elettroni dal centro della reazione
verso un sito elettrofilo.
Es., chimotripsina
Gruppi nucleofili ed elettrofili
di rilevanza biologica
Gruppi nucleofili di rilevanza biologica
Esempio di catalisi covalente (tappa
nucleofila: formazione legame E-S)
Gruppi elettrofili di rilevanza biologica
Esempio di catalisi covalente (fasse
elettrofila: rottura del legame E-S)
Catalisi da effetto di prossimità e di
orientamento
Aumenta la velocità della reazione mediante la
vicinanza e l’immobilizzazione nel corretto
orientamento dei gruppi reattivi all’interno del
sito catalitico. L’energia libera necessaria per
compiere questo lavoro è data dall’energia di
legame del substrato all’enzima.
La catalisi per vicinanza e orientamento
Catalisi da metallo
1. Stabilizzazione di cariche, tramite
interazioni elettrostatiche favorevoli tra
metallo e gruppi reattivi del substrato
2. Promozione del corretto orientamento
del substrato
3. Promozione delle reazioni redox
4. Catalisi elettrofila
5. Promozione della catalisi nucleofila
mediante un aumento della ionizzazione
dell’acqua
Ruolo dello ione Zn2+
nell'anidrasi carbonica
Anidrasi
carbonica
PDBid 1HCB
Ruolo dello ione Zn2+
nell'anidrasi carbonica
La catalisi attraverso il legame preferenziale dello stato di transizione
La catalisi attraverso il legame
preferenziale dello stato di transizione
I meccanismi di catalisi
Punto di verifica
• Descrivete come i gruppi funzionali delle proteine
agiscono da catalizzatori acido-base. Come è possibile
per una singola catena laterale di un amminoacido
comportarsi da acido e da base?
• Spiegate in che modo i nucleofili funzionano da
catalizzatori covalenti. Quali sono gli amminoacidi adatti
a fare ciò?
• Elencate i modi in cui gli ioni metallici prendono parte
alla catalisi.
• Quali sono i ruoli della vicinanza e dell'orientamento
nella catalisi enzimatica?
• Perché è improbabile che i catalizzatori non enzimatici
agiscano legando preferenzialmente lo stato di
transizione?
Le serina proteasi
Concetti chiave
• I residui cataliticamente attivi di Ser, His e Asp delle
serina proteasi sono stati identificati tramite marcatura
chimica e analisi strutturale.
• La tasca di legame determina la specificità del
substrato delle diverse serina proteasi.
• Le serina proteasi catalizzano l'idrolisi del legame
peptidico per effetti di vicinanza e orientamento, catalisi
acido-base, catalisi covalente, catalisi elettrostatica e
stabilizzazione dello stato di transizione.
• Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi.
Le serina proteasi
Concetti chiave
• I residui cataliticamente attivi di Ser, His e Asp delle
serina proteasi sono stati identificati tramite marcatura
chimica e analisi strutturale.
• La tasca di legame determina la specificità del
substrato delle diverse serina proteasi.
• Le serina proteasi catalizzano l'idrolisi del legame
peptidico per effetti di vicinanza e orientamento, catalisi
acido-base, catalisi covalente, catalisi elettrostatica e
stabilizzazione dello stato di transizione.
• Gli zimogeni sono i precursori inattivi degli enzimi.
Tripsina di bovino con il
suo inibitore leupeptina
Complesso covalente
leupeptina-tripsina
PDBid 2AGI
I residui del sito attivo
della chimotripsina
Chimotripsina
PDBid 2AGI
Organofosfati: I veleni
per il sistema nervoso
diisopropilfluorofosfato (DFP)
Target: enzimi con serina attivata
Target vitale: acetilcolinesterasi
Il meccanismo di catalisi
delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi
delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi
delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi
delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi
delle serina proteasi
Il meccanismo di catalisi
delle serina proteasi
Stabilizzazione TS nelle serina proteasi
Tasche di specificità di serina proteasi
Il complesso tripsina-BPTI