INIBIZIONE ENZIMATICA REVERSIBILE
Gli inibitori (I) legano l’enzima e
interferiscono con la loro attività
modificando la Vmax, la Km o entrambe.
Gli inibitori reversibili si legano all’enzima
mediante interazioni NON-covalenti.
Quando l’inibitore si lega all’enzima si
stabilisce un equilibrio che porta alla
formazione del complesso inattivo EI.
INIBITORI COMPETITIVI
INIBITORI NON COMPETITIVI
INIBITORI INCOMPETITIVI
INIBITORI COMPETITIVI
Competono con il substrato per il
sito attivo. Sono in genere
analoghi strutturali del substrato.
Rimuovono l’enzima dal ciclo
catalitico naturale.
Vmax rimane inalterata
Km = Kmapp >> aumenta
Km =
k-1
k1
In presenza di Inibitore
COMPETITIVO:
Aumenta la k-1 perché
aumenta la dissociazione del
complesso ES
v0 (μM/min)
Vmax
In presenza di Inibitore
competitivo
½ Vmax
Km Kmapp1
mM
Inibizione competitiva: il trattamento con etanolo dell'avvelenamento
da metanolo
ALCOOLDEIDROGENASI
ALCOOLDEIDROGENASI
Non può essere
metabolizzata: è
tossica per
l’organismo
Può essere
metabolizzata:
non è tossica per
l’organismo
Può essere utilizzato come inibitore competitivo dell’alcool-deidrogenasi nei casi di
intossicazione da metanolo, se utilizzato subito rimuove il METOH dal sito attivo
dell’enzima.
INIBIZIONE DA PRODOTTI DELLA REAZIONE
In alcuni casi, in reazioni irreversibili i prodotti della reazione
agiscono da INIBITORI COMPETITIVI REVERSIBILI dell’enzima che
catalizza la loro formazione.
(per es.: esochinasi, glucosio-6-fosfato fosfatasi)
ATP
glucosio
glucosio-6-fosfato
esochinasi
_
Pi
glucosio-6-fosfato
glucosio
glucosio-6-fosfato fosfatasi _
k1
IN. INCOMPETITIVI
k-1
Si legano all’enzima solo dopo che si è già
formato il complesso ES.
Viene rimosso dal mezzo ES e quindi la Vmax
diminuisce (Vmax = k2 [ES] = k2 [E]tot)
v0 (μM/min)
Vmax
A
B
Vmaxapp
½ Vmax
+ In. INCOMP
Kmapp
Km
in assenza di Inibitori
[S] mM
Diminuisce anche la Km perché tutto
l’equilibrio si sposta verso la
formazione di ES e ESI.
Apparentemente aumenta l’affinità
dell’enzima per il substrato
Km =
k-1
k1
In presenza di In. INCOMP:
Aumenta la k1 e la Kmapp
diminuisce
INIBITORI NON COMPETITIVI PURI
Possono legarsi all’enzima libero oppure al complesso ES
Km
diminuisce
v0 (μM/min)
Km
aumenta
Vmax
A
B
Vmaxapp
+ In. NON COMP.
½ Vmax
½ Vmaxapp
Diminuisce la Vmax (perchè il complesso
ES è sottrato dal mezzo).
La Km rimane invariata (con i NON-competitivi
PURI), perché l’inattivazione dell’enzima libero
(EI) e quella del complesso (ESI) avvengono
con la stessa velocità.
Km
[S] mM
Diverse sostanze tossiche sono inibitori non competitivi di enzimi: METALLI PESANTI
(MERCURIO, PIOMBO) inibiscono numerosi enzimi agendo sui gruppi SH di residui di cisteina
del’enzima o di cofattori enzimatici.
INIBIZIONE IRREVERSIBILE
Gli inibitori irreversibili si legano COVALENTEMENTE all’enzima inattivandolo. Reagiscono
con i gruppi funzionali del sito attivo impedendo al substrato di accedervi o impedendo la
sua trasformazione.
Analoghi dello stato di transizione
Es: composti organofosforici (DFP (diisopropilfluorofosfato), Sarin..), fisostigmina
(alcaloide vegetale)
Analoghi del substrato
Sono molto selettivi. Definiti MARCATORI DI AFFINITA’
Es: TPCK (N-tosil-Lfenilalaninaclorometilchetone) Blocca specificatamente la
chimotripsina (proteasi a serina)
Inibitori suicidi
Molecole che si legano al sito attivo dell’enzima, dando inizio al ciclo catalitico e quando
iniziano ad essere trasformate dall’enzima vi si associano stabilmente inattivandolo.
Inibitori suicidi
Es: SERPINE (SERine-Protease-INhibitors) = sono proteine che funzionano da inibitori di
proteasi a serina e ne regolano l’attività proteolitica, possono avere funzione di difesa nei
confronti di proteasi seriniche esogene, hanno un ruolo protettivo nei processi infiammatori.
TRIPSINA (PROTEASI A SERINA)
ALFA 1ANTITRIPSINA
Si inseriscono nel sito attivo della proteasi
con un’ansa chiamata RCL (= Loop del
centro reattivo).
La reazione procede col taglio della
serpina e la formazione di un intermedio
in cui un frammento di SERPINA rimane
legato all’enzima.
Questo frammento di serpina subisce
un cambiamento conformazionale
>> Si forma un complesso
proteasi/serpina inscindibile
MECCANISMI DI CATALISI
Ogni enzima ha un suo specifico meccanismo catalitico ma spesso più
meccanismi si integrano:
1) CATALISI PER EFFETTO DI PROSSIMITA’ E ORIENTAMENTO
2) CATALISI DA LEGAME PREFERENZIALE PER LO STATO DI TRANSIZIONE
3) CATALISI ACIDO-BASE
4) CATALISI COVALENTE
5) CATALISI MEDIANTE IONI METALLICI
I primi due meccanismi sono comuni a tutti gli enzimi
CATALISI favorita dalla PROSSIMITA’ e dall’ORIENTAMENTO:
1) Gli enzimi bloccando il substrato nel sito di legame aumentano la
prossimità dei gruppi funzionali che devono reagire (è come se
aumentassimo la concentrazione dei reagenti nel sito attivo)
2) diminuisce la libertà di movimento e quindi l’entropia dei reagenti,
l’energia necessaria a compensare questo aumento di ordine del sistema
è fornita dalla formazione di legami fra il sito attivo dell’enzima e il
substrato.
CATALISI favorita dal LEGAME PREFERENZIALE PER LO STATO DI
TRANSIZIONE
il sito attivo dell’enzima di adatta perfettamente al substrato quando
viene raggiunto lo stato di transizione:
la complementarietà abbassa la ΔG‡ e accelera la trasformazione
CATALISI ACIDO-BASE
Trasferimento di ioni H+ o OH- dal o al substrato
e comporta la rottura di legami
Favorisce quelle reazioni in cui si forma un intermedio carico instabile
Specifica: quando l’accettore o il donatore di ioni H+ o OH- è l’H2O
Generale: quando sono coinvolte
le catene laterali ionizzabili
di residui amminoacidici del sito
Catalitico. I pKa di tali residui
possono variare molto rispetto
a quelli dei singoli amminoacidi
in soluzione.
Comporta la formazione di intermedi in cui il
substrato è legato covalentemente con un residuo
amminoacidico del sito attivo dell’enzima.
CATALISI
COVALENTE
La catena laterale reattiva dell’enzima può comportarsi sia da nucleofilo che da elettrofilo. La
più comune è la catalisi nucleofila (un gruppo funzionale dell’enzima si comporta da
nucleofilo):
Enz-R-O—
S
Enz-R-O-S
H2O
Enz-R-OH + P
CATALISI TRAMITE IONI METALLICI
quando nel sito attivo sono presenti ioni metallici che servono a:
• stabilizzare lo stato di transizione
• proteggere cariche negative (Mg2+ nelle chinasi scherma le cariche
negative dell’ATP e facilita l’attacco nucleofilo del substrato al fosforo)
• orientare il substrato
• partecipare a reazioni di ossido-riduzione
METALLO-ENZIMI: metallo di transizione legato fortemente all’enzima (Fe,
Cu, Mn, Zn, Co)
ENZIMI ATTIVATI DA METALLI: legano debolmente un metallo alcalino o
alcalino-terroso
Rimozione dell’anione radicale superossido
(·O2-)
L’anione superossido è un prodotto secondario e tossico del metabolismo ossidativo e può
essere prodotto ad alti livelli in caso di stress ossidativo causato da stati infiammatori e
allergici, patologie specifiche, fumo, radiazioni, farmaci…
Superossido dismutasi (SOD)
Nel sito attivo è presente un
profondo canale idrofilico alla base
del quale è presente uno ione Cu2+
L’anione superossido è indirizzato all’interno del
canale e trattenuto per effetto elettrostatico
1° step: entra il 1° ·O2- che riduce il Cu2+
E-Cu2+ + ·O2- → E-Cu+ + O2
2° step: entra il 2° ·O2- che ossida il Cu+
E-Cu+ + ·O2- + 2H+ → E-Cu2++ H2O2
SOD
4 ·O2-
2O2 + 2H2O2
4H+
Rimossa dalla catalasi o dalla
glutatione-perossidasi
2H2O + O2
REGOLAZIONE DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
- Regolazione a lungo termine: la quantità di enzima può essere controllata
regolando la velocità della sua sintesi o degradazione (minuti o ore)
- Regolazione a breve termine (secondi o frazioni di secondo): l’attività enzimatica
varia in funzione di stimoli ambientali, primo fra tutti la concentrazione di substrato
e di prodotto, in secondo luogo attraverso dei meccanismi di modulazione
(regolazione).
Gli enzimi che subiscono modulazione controllano
passaggi chiave delle vie metaboliche, perciò vengono
anche detti: Enzimi regolatori
MODULAZIONE ALLOSTERICA NON-COVALENTE (REVERSIBILE)
MODULAZIONE COVALENTE (REVERSIBILE o IRREVERSIBILE)
MODULAZIONE COVALENTE: l’enzima subisce una modificazione post-traduzionale ad
opera di altri enzimi (MODIFICATORI) che a loro volta possono essere regolati.
Ad opera di
Modificazioni più comuni:
fosforilazioni (su residui di Ser, Thr, Tyr, His) ► Chinasi
► Acetilasi
acetilazione (Lys, Ammino-terminale)
► Proteosoma
ubiquitinazione (Lys)
► Metilasi
metilazione (Lys, Arg)
SerinaChinasi
+ ATP
+ ADP
Enzima da regolare
------ VSQEE-----Residuo di Ser da
fosforilare
Enzima fosforilato
------ VSQEE-----CH2
Ι
O
Ι
-O–P=O
Ι
O-
La fosforilazione di residui di Ser, Thr, Tyr o His è la forma più comune di
modulazione covalente: è controllata da chinasi e fosfatasi
Una proteina-chinasi trasferisce
un gruppo fosforico dall’ATP sul
sito di fosforilazione dell’enzima
Una proteina-fosfatasi rimuove il
gruppo fosforico dall’enzima.
Proteina-chinasi e proteinafosfatasi sono a loro volta
regolate e in genere inserite in
una cascata di fosforilazioni
innescate da un segnale.
2 subunità
ciascuna con un
sito di
fosforilazione
Glicogenofosforilasi b
(meno attiva)
Fosforilasifosfatasi
Fosforilasichinasi
LA FOSFORILAZIONE PUÒ
INIBIRE O ATTIVARE
L’ENZIMA.
Glicogenofosforilasi a
(più attiva)
DEGRADAZIONE DEL GLICOGENO
