Agrobacterium tumefaciens batterio aerobio Gram negativo induce tumori nella zona d'infezione (GALLA DEL COLLETTO) le cellule infette acquisiscono la proprietà di crescere in modo non regolato la mantengono anche se il batterio non è più presente Questo sovverte il metabolismo della cellula mettendola al servizio del suo sofisticato parassita genetico Gli ormoni vegetali indotti sono la causa della crescita non regolata Le cellule danneggiate di una pianta (per es. da una lesione) liberano fattori che attivano nel batterio i geni vir, della virulenza, localizzati nel PLASMIDE TI, tumor inducing I plasmidi sono molecole di DNA circolare extracromosomico non strettamente necessari ai batteri, ma che apportano vantaggi resistenza ad antibiotici, patogenicità, capacità di metabolizzare in nutrienti sostanze insolite La sintesi di OPINE avviene grazie ad alcuni enzimi codificati dal T-DNA i quali portano alla modificazione di certi aminoacidi che solo il batterio infettante è in grado di metabolizzare come fonte di carbonio e di azoto Processo di infezione 1. Chemotassi e legame iniziale del batterio al sito della lesione; 2. Sviluppo di un ancoraggio solido; 3. Inizio della escissione del T-DNA e del suo impacchettamento con proteine; 4. Costruzione del canale transmenbrana; 5. Migrazione del T-DNA nella cellula vegetale; 6. Migrazione del T-DNA nel nucleo, integrazione e trascrizione. Produzione dei fattori di trascrizione della virulenza Escissione del T-DNA all'altezza delle due SEQUENZE BORDER a monte ed a valle del T-DNA stesso Trasferimento come singolo filamento nella cellula vegetale (processo simile alla coniugazione batterica) Riparazione del plasmide per replicazione del DNA Una volta all'interno della cellula, al T-DNA non rimane che entrare nel nucleo ed integrarsi col DNA cellulare in un sito casuale, in copie multiple Geni vir: Copiano il DNA Attaccano un prodotto al T-DNA copiato che agisca come guida Aggiungono proteine per un’azione protettiva Aprono un canale nella membrana cellulare batterica Agrobatterio non-disarmato Qualsiasi ceppo selvatico, cioè con un plasmide Ti non modificato Agrobatterio disarmato Ceppo incapace di indurre tumori, perché privato dei geni per la produzione di ormoni Vettori di trasformazione Devono avere almeno uno, ma solitamente entrambi, i “borders” Devono avere un “selectable marker” per la selezione delle piante trasformate Devono avere un “selectable marker” per l’introduzione del vetore in agrobacterio Caratteristiche di un plasmide Ti Le regioni del T-DNA codificanti ormoni ed opine possono essere rimosse senza influenzare il processo di trasformazione Le uniche sequenze indispensabile al trasferimento del T-DNA sono i due “borders”, LB e RB Cointegrativi (si integrano in un plasmide Ti residente) Deve esserci una regione di omologia tra il vettore ed il plasmide Ti Binari (capaci di replicazione autonoma) Sono in grado di replicarsi in E.coli e in agrobacterium Fasi principali della trasformazione mediante agrobatterio Preparazione del ceppo di agrobatterio Co-coltura di espianti fogliari ed agrobatterio Selezione e rigenerazione dei trasformanti Considerazioni utili Il sito di integrazione del T-DNA è casuale Uno, due o più T-DNA si possono integrare nel genoma di una singola cellula vegetale Quando ciò accade, le diverse copie di T-DNA si possono ritrovare: -in un unico locus -In loci differenti, sullo stesso o su un altro cromosoma Considerazioni utili Se più copie del T-DNA sono in un locus, esse possono trovarsi orientate nello stesso verso oppure opposte L’integrazione procura al genoma vegetale piccole delezioni (13-73 bp) nel sito di inserzione Una volta integrato nel genoma vegetale, il T_DNA, con tutto quel che contiene, si comporta come il DNA della pianta, è stabile e viene trasferito alla progenie