Genomica funzionale
Possibilità di studiare tutti i geni presenti nel genoma e di avere a
disposizione linee mutanti per ciascun gene.
Progetti di sequenziamento del genoma e degli EST informazioni
strutturali e di espressione.
Genoma: soprattutto bisogna clonare tutto il genoma di grossi
frammenti (YAC e BAC), mapparli e posizionarli sulla mappa genetica,
ricostruendo il cromosoma e quindi la sua sequenza.
EST: expressed sequence tags. Sequenziamento parziale di tutti gli
mRNA presenti in un dato tessuto.
Viene sequenziato qualche centinaio di basi ad ogni estremità e
confrontati con le sequenze di proteine note.
Arabidopsis, a small Cruciferae plant without agricultural use, sets seed
in only 6 weeks from planting, has a small genome of 120 Megabases
(Mb) and only five chromosomes.
The
distribution
of
abundances of cDNAs in the
cDNA library will reflect the
distribution of mRNAs present
in the original tissue.
The cDNA library
sampled at random.
is
then
Each clone is sequenced in
one direction from either the
3' or 5' end (libraries are
usually made such that the
cDNA is cloned directionally;
some EST projects perform 5'
sequencing, others 3', others
both).
These randomly selected sequences are then grouped by identity to
classify them into groups or clusters that derive from a single gene.
The clusters can be used to
•derive a consensus sequence that may be better (more reliable, due to
the overlaps, and longer) than each individual EST
•perform similarity and other database analyses
•examine expression patterns in the dataset.
http://signal.salk.edu/cgi-bin/atta
Dati funzionali.
Studio mutanti: forward genetic. Dalla mutazione al gene.
Comporta studi di espressione:
Studiare l’espressione di un gene noto e possibilmente una linea
mutante specifica ottenuta con metodi tradizionali.
DNA micro-arrays: popolazione di cDNA fissati a vetrino e ibridati con
sonde specifiche marcate analisi quantitativa nei diversi tessuti.
L’isolamento del gene mutato è molto laborioso e richiede studi
biochimici, oppure lunghi e laboriosi esperimenti di chromosome
walking e mappe di linkage (map-based cloning).
Può essere quindi utile fare della reverse genetic: dal gene alla funzione.
Risalire alla funzione di un gene partendo dalla sequenza (vista la
disponibilità di genomi sequenziati).
No gene targeting e knock out in piante, servono altri metodi per la
mutagenesi sito specifica.
Mutagenesi inserzionale: inserzione di elementi a sequenza nota (T-DNA e
trasposoni) in gene di interesse.
E’ casuale e random e quindi deve essere fatta su larga scala per avere
una buona probabilità di avere una mutazione sul gene che interessa.
Arabidopsis è molto utile per questi studi visto che ha un piccolo genoma
e quindi i geni sono abbastanza densi.
La mutagenesi inserzionale può essere applicata sia in forward che in
reverse genetic.
T-DNA
Vantaggi: origina inserzioni stabili, non richiede passaggi complicati per
la mobilizzazione e l’inserzione, inserzione assolutamente random,
nessuna preferenza, spesso una solo copia integrata.
Svantaggi: riarrangiamenti cromosomici e integrazioni complesse.
Possibilità di saturare la mappa con metodi di trasformazione in planta.
T-DNA tagging in reverse genetic
trasformazione con T-DNA con gene marcatore (kan)
selezione della linea con il T-DNA integrato vicino o dentro il gene di
interesse (PCR e pooling)
analisi molecolare e fenotipica (se esiste fenotipo, vedi ridondanza
genica)
conferma tra fenotipo e gene, complementazione.
T-DNA tagging in forward genetic
trasformazione con T-DNA con gene marcatore (kan)
selezione della linea con il fenotipo di interesse
analisi dettagliata fenotipo e test di cosegregazione tra T-DNA e
fenotipo.
Isolamento del gene mutato con metodi di ibridazione di genoteche o
con plasmid rescue o con inverse PCR.
Inverse PCR
Trasposoni
Vantaggi: inserzione instabile, possibilità di ri-excidersi e di revertere
in fenotipo, integrazione in siti vicini, piccole distanze cromosomiche
percorse, necessità di attivarne la trasposizione.
Svantaggi: corto raggio, meccanismo difficoltoso per bloccare nuove
trasposizioni, più copie.
Sistemi usati Ac/Ds ed Em/Spm di mais introdotti in Arabidopsis.
Transposon tagging in forward o reverse
Introduzione di un costrutto con trasposone in sistema eterologo e con
caratteristiche tali da consentire di controllare la trasposizione.
Sistema a due componenti:
prima linea transgenica contenente un trasposone autonomo ma
immobilizzato (no repeat terminali, tipo Ac) fornisce la trasposasi
seconda linea con elemento non autonomo, ma mobile. Si muove solo
quando gli viene fornita la trasposasi (Ds).
Incrocio e analisi del fenotipo
Segregazione tra i due elementi per stabilizzare la mutazione.
Isolamento della linea con il trasposone integrato vicino al gene o con il
fenotipo di interesse.
Il numero di linee da ottenere dipende dalle dimensioni del genoma,
dal numero di geni totali e dal tipo di T (alto o basso numero di
copie).
Un alto numero di copie permette inserzioni in più siti e una maggiore
velocità di saturazione del genoma. Col T-DNA è necessario avere
molte più linee indipendenti.
Problema: ridondanza genica e quindi spesso mancanza di fenotipo
evidente, è necessario trovare le giuste condizioni di crescita o
creare doppi o tripli mutanti.
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Tagging specializzati
activation tagging: invece di creare un mutante inserzionale recessivo
con perdita di una funzione (loss of function) si crea un mutante
dominante a causa dell’attivazione di una funzione (gain of function,
sovraespressione costitutiva).
Si usa un T-DNA contenente un forte enhancer (4x35S).
