Trasformazione genetica di cellule vegetali: introduzione ed inserzione nel genoma nucleare di un nuovo gene, senza utilizzare la fecondazione. Problemi tipici dei vegetali: 1- Presenza della parete vegetale 2- Scarsa ricombinazione omologa 3- Mancanza di linea germinale 4- Ciclo vitale dei virus al di fuori del nucleo o dei cromosomi. Non tutti già risolti: 1- Sorpassare la parete grazie a batteri (metodi indiretti) o proiettili (metodi diretti), oppure rimuovere la parete (metodi diretti) 2- Integrazione illegittima 3- Obbligo quasi sempre di rigenerare una nuova pianta da cellule somatiche trasformate 4- Vettori virali solo per espressione transiente Agrobacterium tumefaciens: agente eziologico della ‘galla del colletto’ ‘crown gall’. Agrobacterium Famiglia rhizobiaceae Esistono all’interno del genere specie correlate che causano malattie in qualche modo simili: Agrobacterium tumefaciens: galla del colletto (crown gall) Agrobacterium rhizogenes: radici avventizie (hairy roots) Agrobacterium rubi: galla del fusto Agrobacterium radiobacter: non virulento Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37°/42°C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica. Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37°/42°C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica. Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37°/42°C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica. Tutti i ceppi virulenti di Agrobacterium possiedono un mega-plasmide (190-240 Kb, Ti). Prove su Agrobacterium tumefaciens ceppo C58 •Coltura a 28°C •Recupero delle colonie •Infezione delle piante •Coltura a 37°C •Recupero delle colonie •Infezione delle piante Tutte le colonie provocano la malattia Alcune colonie non provocano la malattia Plasmide Ti presente Plasmide Ti assente Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo stesso di trasformazione genetica 1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che continuano a crescere anche in assenza di A.t. Tumor inducing principle Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal tipo di pianta. 1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a 37°/42°C il batterio (curato) contiene un plasmide? 1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide. Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore prima evidenza della trasformazione genetica. Struttura modulare plasmide Ti 96-156.000bp, codifica per 155 proteine raggruppate in operoni presenti in 5 porzioni: 1- regione T (T-DNA), DNA fisicamente trasferito 2- regione vir trasferimento DNA 3- regione rep replicazione batterica 4- regione tra coniugazione tra batteri 5- uptake e metabolismo opine. 1- T-DNA: delimitato da RB e LB, 25 bp ripetute dirette. Il RB è indispensabile per il trasferimento. Contiene geni con proprietà ‘vegetali’ deputati alla sintesi di auxine (iaaM e H), citochinine (ipt) e opine (ocs, nos, etc). Mutanti inattivati da trasposoni portano a tumori hairy o rooty o privi di opine. 2- 20 geni vir organizzati in 6 operoni (A G) sono indispensabili per il trasferimento virD1 e D2: tagli singola elica al RB, D2 rimane legata covalentemente virB (11 geni) crea l’apparato di trasferimento (pilo) virE2 media la localizzazione (insieme a D2) nel nucleo, Single strand DNA binding protein. Funzione necessaria solo in pianta. X X Tumore formato da germogli Tumore formato da radici Struttura modulare plasmide Ti 96-156.000bp, codifica per 155 proteine raggruppate in operoni presenti in 5 porzioni: 1- regione T (T-DNA), DNA fisicamente trasferito 2- regione vir trasferimento DNA 3- regione rep replicazione batterica 4- regione tra coniugazione tra batteri 5- uptake e metabolismo opine. 1- T-DNA: delimitato da RB e LB, 25 bp ripetute dirette. Il RB è indispensabile per il trasferimento. Contiene geni con proprietà ‘vegetali’ deputati alla sintesi di auxine (iaaM e H), citochinine (ipt) e opine (ocs, nos, etc). Mutanti inattivati da trasposoni portano a tumori hairy o rooty o privi di opine. 2- 20 geni vir organizzati in 6 operoni (A G) sono indispensabili per il trasferimento virD1 e D2: tagli singola elica al RB, D2 rimane legata covalentemente virB (11 geni) crea l’apparato di trasferimento (pilo) virE2 media la localizzazione (insieme a D2) nel nucleo, Single strand DNA binding protein. Funzione necessaria solo in pianta. Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine 5 4 3 1 2 Vir Genes and their Function Vir Gene Function Vir A, Vir G Sense phenolic compounds from wounded plant cells and induce expression of other virulence genes VirD2 Endonuclease; cuts T-DNA at right border to initiate T-strand synthesis Vir D1 Topiosomerase; Helps Vir D2 to recognise and cleave within the 25bp border sequence Vir D2 Covalently attaches to the 5’ end of the T-strand, thus forming the T-DNA Complex. Also guides the T-DNA complex through the nuclear pores Vir C Binds to the 'overdrive' region to promote high efficiency T-strand Synthesis Vir E2 Binds to T-strand protecting it from nuclease attack, and intercalates with lipids to form channels in the plant membranes through which the T-complex passes Vir E1 Acts as a chaperone which stabilises Vir E2 in the Agrobacterium Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine LB RB 5’ 3’ 3’ 5’ LB RB 5’ 3’ 3’ 5’ LB 5’ 3’ RB 3’ 5’ Agrobacterium tumefaciens cells attached to a plant cell. Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine Vir D2 e Vir E2 contengono segnali di localizzazione nucleare NLS Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali: 1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici inusuali come l'acetosiringone; 2- l'acetosiringone induce l'attivazione dei geni vir sul plasmide Ti; 3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo filamento il quale è importato nella cellula vegetale; 4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale; 5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi: produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine; biosintesi delle opine Utilizzo biotecnologico di A. tumefaciens come sistema di trasformazione vegetale Sistema del vettore binario: i geni vir possono agire anche in trans. Sistema binario a due plasmidi: - Plasmide Ti delezione del T-DNA originale disarmato residente - Plasmide di E. coli con nuovo T-DNA (2 border, geni interesse), origine di replicazione per E. coli e A. tumefaciens. Sistema co-integrato ad un plasmide: - Plasmide Ti nessuna delezione del T-DNA originale - Plasmide di E. coli con nuovo T-DNA (2 border, geni interesse), origine di replicazione per E. coli ma NON ha quella per A. tumefaciens, regioni di omologia prima e dopo T-DNA Le regioni di omologia tra i plasmidi innescano doppia ricombinazione omologa scambio dei T-DNA Il plasmide del E. coli non si replica nell’A.t. viene perso Esperimenti di co-coltivazione