Presentazione di PowerPoint

Trasformazione genetica di cellule vegetali: introduzione ed inserzione
nel genoma nucleare di un nuovo gene, senza utilizzare la fecondazione.
Problemi tipici dei vegetali:
1- Presenza della parete vegetale
2- Scarsa ricombinazione omologa
3- Mancanza di linea germinale
4- Ciclo vitale dei virus al di fuori del nucleo o dei cromosomi.
Non tutti già risolti:
1- Sorpassare la parete grazie a batteri (metodi indiretti) o proiettili
(metodi diretti), oppure rimuovere la parete (metodi diretti)
2- Integrazione illegittima
3- Obbligo quasi sempre di rigenerare una nuova pianta da cellule
somatiche trasformate
4- Vettori virali solo per espressione transiente
Agrobacterium tumefaciens: agente eziologico della ‘galla del colletto’
‘crown gall’.
Agrobacterium
Famiglia rhizobiaceae
Esistono all’interno del genere specie correlate
che causano malattie in qualche modo simili:
Agrobacterium tumefaciens:
galla del colletto (crown gall)
Agrobacterium rhizogenes:
radici avventizie (hairy roots)
Agrobacterium rubi:
galla del fusto
Agrobacterium radiobacter:
non virulento
Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo
stesso di trasformazione genetica
1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e
che continuano a crescere anche in assenza di A.t.  Tumor inducing
principle
Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del
batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal
tipo di pianta.
1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a
37°/42°C il batterio (curato)  contiene un plasmide?
1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide.
Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore  prima
evidenza della trasformazione genetica.
Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo
stesso di trasformazione genetica
1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che
continuano a crescere anche in assenza di A.t.  Tumor inducing principle
Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione
del batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non
dal tipo di pianta.
1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a
37°/42°C il batterio (curato)  contiene un plasmide?
1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide.
Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore  prima
evidenza della trasformazione genetica.
Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo
stesso di trasformazione genetica
1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che
continuano a crescere anche in assenza di A.t.  Tumor inducing principle
Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del
batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal
tipo di pianta.
1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando
a 37°/42°C il batterio (curato)  contiene un plasmide?
1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide.
Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore  prima
evidenza della trasformazione genetica.
Tutti i ceppi virulenti di Agrobacterium possiedono un
mega-plasmide (190-240 Kb, Ti).
Prove su Agrobacterium tumefaciens ceppo C58
•Coltura a 28°C
•Recupero delle colonie
•Infezione delle piante
•Coltura a 37°C
•Recupero delle colonie
•Infezione delle piante
Tutte le colonie
provocano la malattia
Alcune colonie non
provocano la malattia
Plasmide Ti presente
Plasmide Ti assente
Agrobacterium tumefaciens come strumento di infezione e al tempo
stesso di trasformazione genetica
1970: Dr Braun dimostra che il tumore contiene cellule trasformate e che
continuano a crescere anche in assenza di A.t.  Tumor inducing principle
Morel: il tumore produce metaboliti (opine) anche dopo la rimozione del
batterio. Il tipo di opina prodotta dipende dal tipo di batterio e non dal
tipo di pianta.
1971: Hamilton e Fall scoprono che la virulenza viene persa incubando a
37°/42°C il batterio (curato)  contiene un plasmide?
1974: Zaenen, Schell e van Montagu isolano questo plasmide.
Una sua parte viene trovata anche nelle cellule del tumore  prima
evidenza della trasformazione genetica.
Struttura modulare plasmide Ti
96-156.000bp, codifica per 155 proteine raggruppate in operoni presenti in 5
porzioni:
1- regione T (T-DNA), DNA fisicamente trasferito
2- regione vir  trasferimento DNA
3- regione rep  replicazione batterica
4- regione tra  coniugazione tra batteri
5- uptake e metabolismo opine.
1- T-DNA: delimitato da RB e LB, 25 bp ripetute dirette. Il RB è indispensabile
per il trasferimento. Contiene geni con proprietà ‘vegetali’ deputati alla
sintesi di auxine (iaaM e H), citochinine (ipt) e opine (ocs, nos, etc).
Mutanti inattivati da trasposoni portano a tumori hairy o rooty o privi di
opine.
2- 20 geni vir organizzati in 6 operoni (A  G) sono indispensabili per il
trasferimento
virD1 e D2: tagli singola elica al RB, D2 rimane legata covalentemente
virB (11 geni) crea l’apparato di trasferimento (pilo)
virE2 media la localizzazione (insieme a D2) nel nucleo, Single strand DNA
binding protein. Funzione necessaria solo in pianta.
X X
Tumore formato da germogli Tumore formato da radici
Struttura modulare plasmide Ti
96-156.000bp, codifica per 155 proteine raggruppate in operoni presenti in 5
porzioni:
1- regione T (T-DNA), DNA fisicamente trasferito
2- regione vir  trasferimento DNA
3- regione rep  replicazione batterica
4- regione tra  coniugazione tra batteri
5- uptake e metabolismo opine.
1- T-DNA: delimitato da RB e LB, 25 bp ripetute dirette. Il RB è indispensabile
per il trasferimento. Contiene geni con proprietà ‘vegetali’ deputati alla
sintesi di auxine (iaaM e H), citochinine (ipt) e opine (ocs, nos, etc).
Mutanti inattivati da trasposoni portano a tumori hairy o rooty o privi di
opine.
2- 20 geni vir organizzati in 6 operoni (A  G) sono indispensabili per il
trasferimento
virD1 e D2: tagli singola elica al RB, D2 rimane legata covalentemente
virB (11 geni) crea l’apparato di trasferimento (pilo)
virE2 media la localizzazione (insieme a D2) nel nucleo, Single strand DNA
binding protein. Funzione necessaria solo in pianta.
Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali:
1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici
inusuali come l'acetosiringone;
2- l'acetosiringone induce l'attivazione
dei geni vir sul plasmide Ti;
3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo
filamento il quale è importato nella cellula vegetale;
4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il
T-DNA è integrato nel genoma vegetale;
5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi:
 produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine;
 biosintesi delle opine
Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali:
1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici
inusuali come l'acetosiringone;
2- l'acetosiringone induce l'attivazione
dei geni vir sul plasmide Ti;
3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo
filamento il quale è importato nella cellula vegetale;
4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il
T-DNA è integrato nel genoma vegetale;
5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi:
 produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine;
 biosintesi delle opine
5
4
3
1
2
Vir Genes and their Function
Vir Gene
Function
Vir A, Vir G
Sense phenolic compounds from wounded plant cells and induce
expression
of other virulence genes
VirD2
Endonuclease; cuts T-DNA at right border to initiate T-strand synthesis
Vir D1
Topiosomerase; Helps Vir D2 to recognise and cleave within the 25bp
border sequence
Vir D2
Covalently attaches to the 5’ end of the T-strand, thus forming the
T-DNA Complex. Also guides the T-DNA complex through the nuclear
pores
Vir C
Binds to the 'overdrive' region to promote high efficiency T-strand
Synthesis
Vir E2
Binds to T-strand protecting it from nuclease attack, and intercalates
with lipids to form channels in the plant membranes through which the
T-complex passes
Vir E1
Acts as a chaperone which stabilises Vir E2 in the Agrobacterium
Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali:
1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici
inusuali come l'acetosiringone;
2- l'acetosiringone induce l'attivazione
dei geni vir sul plasmide Ti;
3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo
filamento il quale è importato nella cellula vegetale;
4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il
T-DNA è integrato nel genoma vegetale;
5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi:
 produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine;
 biosintesi delle opine
LB
RB
5’
3’
3’
5’
LB
RB
5’
3’
3’
5’
LB
5’
3’
RB
3’
5’
Agrobacterium tumefaciens
cells attached to a plant cell.
Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali:
1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici
inusuali come l'acetosiringone;
2- l'acetosiringone induce l'attivazione
dei geni vir sul plasmide Ti;
3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo
filamento il quale è importato nella cellula vegetale;
4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo
e il T-DNA è integrato nel genoma vegetale;
5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi:
 produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine;
 biosintesi delle opine
Vir D2 e Vir E2 contengono segnali di localizzazione
nucleare NLS
Il processo d'infezione prevede diverse fasi temporali:
1- la cellula vegetale ferita produce composti fenolici
inusuali come l'acetosiringone;
2- l'acetosiringone induce l'attivazione
dei geni vir sul plasmide Ti;
3- i prodotti proteici dei geni vir permettono la sintesi di T-DNA a singolo
filamento il quale è importato nella cellula vegetale;
4- il complesso proteico contenente il T-DNA viene importato nel nucleo e il
T-DNA è integrato nel genoma vegetale;
5- i geni contenuti nel T-DNA vengono espressi:
 produzione da parte della cellula vegetale di auxine e citochinine;
 biosintesi delle opine
Utilizzo biotecnologico di A. tumefaciens come sistema di
trasformazione vegetale
Sistema del vettore binario: i geni vir possono agire anche in trans.
Sistema binario a due plasmidi:
- Plasmide Ti  delezione del T-DNA originale  disarmato residente
- Plasmide di E. coli con nuovo T-DNA (2 border, geni interesse),
origine di replicazione per E. coli e A. tumefaciens.
Sistema co-integrato ad un plasmide:
- Plasmide Ti  nessuna delezione del T-DNA originale
- Plasmide di E. coli con nuovo T-DNA (2 border, geni interesse),
origine di replicazione per E. coli
ma NON ha quella per A. tumefaciens,
regioni di omologia prima e dopo T-DNA
Le regioni di omologia tra i plasmidi innescano doppia
ricombinazione omologa  scambio dei T-DNA
Il plasmide del E. coli non si replica nell’A.t.  viene perso
Esperimenti di co-coltivazione