UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MESSINA
Corso di Laurea Triennale in Scienze Biologiche
Corso di Genetica 2015-2016
CORSO DI
GENETICA
A/K
BASI GENETICHE DEL PROCESSO DI
INFEZIONE DI AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS: IL PLASMIDE TI E IL T-DNA
Modulo di Genetica Vegetale | Prof. Orazio Romeo
Dipartimento di Scienze Chimiche, Biologiche, Farmacologiche ed Ambientali
INTRODUZIONE
“Crown gall”, o galla della corona o del colletto (Fig. 1), è il nome utilizzato dai
fitopatologi per descrivere le più o meno vistose iperplasie o masse tumorali
spesso osservate alla base del fusto e delle radici degli alberi, viti e piante
legnose.
Fig. 1. Galle di forma rotondeggiante e munite di protuberanze.
La causa di tali formazioni è rimasta sconosciuta fino al 1897 quando Fridriano
Cavara descrisse in dettaglio l’isolamento di un batterio in grado di causare galle
alla base delle viti presenti nei giardini botanici reali di Napoli.
Oggi è noto che la formazione di tali tumori è dovuta, principalmente, a
microrganismi Gram-negativi appartenenti al genere Agrobacterium, il quale
include specie (A. tumefaciens, A. viti e A. rubi) in grado di indurre
trasformazioni oncogene nelle cellule vegetali e di causare, quindi, formazioni
neoplastiche al sito di infezione.
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A. tumefaciens è un proteobatterio, di forma bastoncellare, appartenente alla
famiglia delle Rhizobiaceae, la quale comprende anche molti batteri azotofissatori simbionti delle piante. Tuttavia, a differenza di quest’ultimi, A.
tumefaciens si comporta da parassita ed è capace di infettare le piante attraverso
la trasmissione di un elemento di DNA, detto T-DNA (T sta per trasferito), che
introdotto all’interno delle cellule vegetali è in grado di integrarsi nel genoma
dell’ospite.
Per la tumorigenesi sostenuta da A. tumefaciens, è richiesta la corretta
espressione di specifici geni tumorali all’interno della cellula ospite. Tali geni
sono localizzati sul T-DNA, un segmento mobile del plasmide Ti (Tumor
inducing; circa 200 kbp di grandezza) delineato da due ripetizioni dirette
imperfette di circa 25 bp ognuna chiamate rispettivamente “Left Border (LB)” e
“Right Border (RB)” (Fig. 2).
Il plasmide Ti di A. tumefaciens (ceppo 50; Genbank: AE00787) è stato
completamente sequenziato e il T-DNA all’interno di questo elemento genetico
mostra le seguenti sequenze fiancheggianti:
LB(25 bp): TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAAC
RB(25 bp): TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC
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Fig. 2. Rappresentazione schematica del plasmide Ti di A. tumefaciens.
La regione Vir con i geni VirF, VirD2 e VirE2 e il T-DNA incluso le
ORFs presenti (box verdi) sono mostrate. Da Bourras et al., 2015.
Il T-DNA presenta alcune sequenze (TATA-box; CAAT-box) (Fig. 2) che sono
elementi tipici dei promotori eucariotici i quali, probabilmente, assicurano una
corretta
trascrizione
dei
geni
batterici
una
volta
entrati
all’interno
dell’organismo eucariote ospite.
I geni presenti nel segmento mobile (T-DNA) possono essere suddivisi in due
distinte categorie sulla base della loro funzione nel processo di tumorogenesi.
La prima classe di geni oncogeni codifica per enzimi, tra cui la triptofano monoossigenasi e la indolacetammide idrolasi, che apportano un profondo
cambiamento nella regolazione e biosintesi di fitormoni quali le auxine e le
citochine generando così il caratteristico “gonfiore” tumorale.
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La seconda classe di geni indirizza il metabolismo cellulare della cellula ospite
verso la produzione di derivati amminoacidici e zuccheri necessari per la sintesi
di sostanze, dette opine. Le opine non sono utilizzabili dalle cellule vegetali ma
sono usate dai batteri come nutrienti e pertanto servono per la colonizzazione
microbica e per la loro proliferazione.
A. tumefaciens mostra una peculiare capacità di aderire a diversi tipi di superfici
sia inanimate (vetro, plastica, poliestere) che biologiche tra cui quelle di piante e
funghi. Il principale tipo di attacco sembra essere quello “polare” in cui i batteri
adesi al pelo radicale sembrano formare un piccolo “spazzolino” (Fig. 3).
Fig. 3. Adesione polare di A. tumefaciens al pelo radicale di una
pianta di pomodoro. Da Matthysse, 2014.
Il meccanismo di adesione sembra coinvolgere un particolare polisaccaride
(UPP) extracellulare localizzato ad un polo della cellula e composto
principalmente da mannosio e glucosio.
Una volta che il batterio si è legato alla superficie della pianta inizia il processo
di infezione il quale culmina con l’integrazione del T-DNA all’interno del
genoma della cellula vegetale.
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A. tumefaciens ha evoluto un sofisticato meccanismo di trasferimento il quale
prevede prima di tutto il rilascio del T-DNA sottoforma di un singolo filamento
detto “T-strand”. La formazione del T-strand avviene ad opera delle proteine
Vir, codificate dai geni Vir che occupano una regione di circa 35 kbp sul
plasmide Ti. L’espressione di tali geni è, in genere, attivata da composti fenolici
(acetosiringone) prodotti in seguito a ferite che si verificano a carico dei tessuti
della pianta (Fig. 4).
Fig. 4. Rappresentazione schematica del processo di trasmissione del T-DNA di
A. tumefaciens alla cellula vegetale in seguito ad attivazione dei geni Vir ad opera
di composti fenolici (acetosiringone).
La percezione di tali composti è dovuta ad un sistema a due componenti
costituito dalle proteine VirA/VirG (Fig. 5). VirA è un sensore (chinasi) di
membrana che in grado di auto-fosforilarsi ad un residuo di istidina e
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successivamente di trasferire il gruppo fosfato ad un residuo conservato di
aspartato della proteina VirG. La fosforilazione di VirG attiva la trascrizione del
regulone Vir presente sul plasmide Ti e quindi il processamento del T-DNA e la
sua traslocazione nella cellula ospite.
Fig. 5. Modello molecolare di percezione dei composti
fenolici mediante il sistema VirA/VirG.
É stato osservato come un certo numero di monosaccaridi tra cui il glucosio,
galattosio, arabinosio e l’acido D-glucoronico, solitamente rilasciati in seguito a
ferite riportate dalla pianta, aumentino enormemente l’induzione dei geni Vir.
Ciò è possibile poiché una proteina batterica periplasmatica, ChvE, è in grado di
legare tali zuccheri e di interagire successivamente con il dominio
periplasmatico di VirA inducendone un cambiamento conformazionale che
aumenta notevolmente la sensibilità delle proteina sensore nei confronti dei
composti fenolici presenti. Il dominio periplasmatico di VirA è sensibile anche
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alle variazioni di pH responsabili dell’induzione massima dei geni Vir (a pH
acidi).
Come accennato precedentemente, la fosforilazione di VirG promuove la
trascrizione di altri geni Vir poiché tale proteina è capace di interagire con una
sequenza regolatoria (TNCAATTGAAA) chiamata “vir box” e localizzata a
monte dei promotori dei geni Vir. La trascrizione di questi geni determina la
produzione della proteina VirD2, che insieme ad altri fattori accessori (le
proteine VirD1, VirC1 e VirC2), si lega e taglia il T-DNA a livello delle
sequenze LB e RB. VirD2 è una endonucleasi che rilascia il segmento di TDNA a singolo filamento (T-strand) rimanendo covalentemente legata
all’estremità 5’ (Fig. 6).
Una volta all’interno della cellula vegetale, al T-strand libero si lega VirE2, una
proteina in grado di legare il singolo filamento di DNA formando il cosidetto
“T-complex” che è la forma in cui viene effettivamente trasportato il T-DNA
nella cellula eucariotica evitando l’attacco di eventuali DNAsi (Fig. 6).
Il T-strand entra all’interno della cellula vegetale mediante traslocazione
attraverso un sistema di secrezione che è in grado di formare anche un “pilus”
coniugativo simile a quello prodotto dal plasmide F di Escherichia coli.
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Fig. 6. Formazione del T-strand e del T-complex.
Il “Type IV Secretion System (T4SS)” è uno dei diversi tipi di sistemi di
secrezione che utilizzano i microrganismi per il trasporto di macromolecole
quali proteine e DNA attraverso la cellula batterica. Il T4SS è un sistema molto
versatile come dimostrato dalla grande varietà di funzioni che esso svolge. In A.
tumefaciens, il T4SS, oltre ad elaborare pili coniugativi, produce anche il canale
di traslocazione attraverso cui è trasferito il T-DNA. Tuttavia se il “pilus” serva
solo come dispositivo di attacco o di condotto per i substrati o entrambi resta
ancora da chiarire.
Sebbene il pilus e il canale siano probabilmente assemblati in un’unica struttura
supramolecolare, la Figura 7 li riporta fisicamente distinti per trasmettere l’idea
che essi svolgono funzioni diverse.
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Fig. 7. Rappresentazione grafica del T4SS in grado di produrre pili (a) e canale di
traslocazione del T-DNA (b).
Infatti, anche se il “pilus” consente il contatto con la cellula target, esso è
assolutamente superfluo per la traslocazione intercellulare. Ciò è stato
dimostrato geneticamente attraverso l’uso di esperimenti di mutagenesi in cui
specifiche mutazioni bloccavano la biogenesi del “pilus” senza condizionare il
trasferimento di substrati o, viceversa, poteva essere bloccato il trasferimento
senza che la formazione del pilus ne fosse influenzata.
In A. tumefaciens, il T4SS è costituito dalle proteine VirB/VirD. In particolare
questo sistema di secrezione è formato da 11 proteine codificate dall’operone
VirB e dalla subunità VirD4 prodotta separatamente dall’operone VirD (Fig.
7a).
Oltre al T-strand, molti effettori batterici possono essere traslocati attraverso il
sistema VirB/VirD4. Infatti, immediatamente dopo l’ingresso del T10
strand/VirD2 all’interno della cellula ospite, il T-DNA viene rapidamente legato
e rivestito da circa 600 proteine VirE2 (Fig. 6) per formare un solido filamento a
spirale detto T-complex (Fig. 6). La conformazione del T-complex è mantenuta
durante tutto il suo “viaggio” all’interno della cellula eucariotica fino al suo
ancoraggio sulla cromatina all’interno del nucleo. Le proteine VirD2 e VirE2 a
loro volta, contribuiscono in vari modi alla traslocazione del T-complex nel
nucleo dell’ospite. È importante sottolineare che entrambe le proteine
presentano sequenze di localizzazione nucleare (NLS) che aiutano a guidare il
T-complex al nucleo attraverso specifiche interazioni con proteine vegetali quali
le α e β importine (Fig. 8).
Fig. 8. Trasporto del T-complex nel nucleo della cellula vegetale.
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La Figura 9 riassume le varie fasi che portano il T-DNA del batterio ad
integrarsi nel genoma della cellula vegetale.
Fig. 9. Panoramica del processo di infezione che porta il T-DNA di A.
tumefaciens all’interno del nucleo della cellula vegetale.
Quando il T-DNA raggiunge il nucleo della cellula eucariotica ospite può
integrarsi all’interno del genoma mediante meccanismi di ricombinazione nonomologa o illegittima. L’inserimento è causale pertanto il T-DNA può inserirsi
in qualsiasi punto del genoma vegetale.
Le rotture a doppio filamento (DSB) del DNA dell’ospite risultano essere i
principali “targets” per l’inserimento del T-DNA. Negli organismi eucariotici, le
DSB possono essere indotte da fattori ambientali quali raggi ionizzanti,
radiazioni UV, agenti genotossici o da fattori endogeni derivanti dall’attività
cellulare. Ad esempio, le DSB si verificano durante la replicazione del DNA,
quando la forca replicativa si arresta e poi riparte, durante la segregazione
mitotica, nella mobilizzazione di elementi trasponibili oppure durante la
ricombinazione meiotica. Comunque l’esatto meccanismo con cui il T-DNA si
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inserisce a livello delle DSB non è ancora noto. La Figura 10 mostra un
possibile modello di inserimento del T-DNA a livello di una rottura a doppio
filamento nel genoma.
Fig. 10. Presunto meccanismo di ricombinazione non-omologa
che permette l’integrazione del T-DNA nel genoma eucariotico.
Il meccanismo con il quale A. tumefaciens causa la formazione di tumori nelle
piante è molto affascinante e senza dubbio, rappresenta uno dei più sofisticati
sistemi di trasferimento di materiale genetico, tra organismi di regni diversi,
oggi conosciuto. Al momento, la gamma di ospiti a cui A. tumefaciens può
efficacemente trasferire DNA si estende al di là del regno vegetale ed include i
lieviti, molte specie di funghi filamentosi e addirittura le cellule umane. Questo
microrganismo è, infatti, capace di trasferire in maniera efficace DNA a
protoplasti fungini, a conidi e a tessuto ifale. Tale sistema di trasferimento
genico orizzontale risulta, pertanto, particolarmente utile per le specie fungine
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che sono recalcitranti alla trasformazione genetica con altri metodi. La sua
semplicità e l’elevata efficienza di trasformazione rendono questo sistema un
valido strumento per la manipolazione genetica dei funghi, soprattutto quelli di
interesse clinico e agro-alimentare.
La straordinaria scoperta, inoltre, che A. tumefaciens è in grado di trasformare
anche le cellule umane estende ancora di più la gamma degli ospiti con cui
questo batterio può interagire, e porta a chiedersi se il trasferimento del T-DNA
possa rappresentare la base di un sistema funzionale per il trasferimento di
elementi genetici all’interno delle cellule umane.
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Bibliografia (essenziale)
1. Bourras S, Rouxel T, Meyer M. Agrobacterium tumefaciens gene transfer: how a
plant pathogen hacks the nuclei of plant and non-plant organisms. Phytopathology.
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2. Chandran Darbari V, Waksman G. Structural biology of bacterial type IV secretion
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2014;2(6).
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eukaryotic cells. Biochemistry (Mosc). 2013;78:1321-32.
5. Kado CI. Historical account on gaining insights on the mechanism of crown gall
tumorigenesis
induced
by
Agrobacterium
tumefaciens.
Front
Microbiol.
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6. Matthysse AG. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci.
2014;5:252.
7. Wallden K, Rivera-Calzada A, Waksman G. Type IV secretion systems: versatility
and diversity in function. Cell Microbiol. 2010;12:1203-12.
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