A. UBIALI
Metodi per lo studio e la diagnosi
molecolare dei tumori solidi:
le neoplasie intestinali
Torino, 11 giugno 2008
UN PO’ DI TEORIA
• Il concetto molecolare di malattia
• I livelli di studio del materiale genetico
UN PO’ DI TEORIA
• Il concetto molecolare di malattia
• I livelli di studio del materiale genetico
Differenze genetiche non patologiche
nella popolazione umana
1. Polimorfismi di singolo nucleotide (SNPs): sono la forma
prevalente di differenza, costituita da variazioni di una
singola coppia di basi (1 bp).
2. Minisatelliti: 10-100 nucleotidi ripetuti più volte in tandem,
fiancheggiati da sequenze uniche e caratteristiche. Un
esempio è dato dai Variable Number Tandem Repeats
(VNTR), che sono circa 50.000 nel genoma.
3. Microsatelliti: simili ai minisatelliti ma con sequenze ripetute
più piccole, ad esempio tetranucleotidi o anche solo
dinucleotidi ripetuti in tandem.
Riassumendo…
• DNA Satellite Differenze di lunghezza (molte bp in più o meno)
CACA CACACACACACA
GTGT GTGTGTGTGTGT
CACA CA
GTGT GT
• SNPs Differenze di sequenza a livello di 1 bp
G
C
• Può cambiare il sito di restrizione
A
T
• Può cambiare il comportamento di
ibridazione con sonde (FISH, CISH)
La Patologia Molecolare
La Patologia Molecolare é una branca della
BM specializzata nell’utilizzo di tecniche
molecolari allo scopo di:
• Distinguere il “normale” dal “patologico”:
diagnosi
• Predire la progressione di malattia:
prognosi
• Fornire indicazioni mirate alla cura:
terapia
La Patologia Molecolare
La Patologia Molecolare considera tre tipi
di anomalia genetica:
• Ereditaria (es. Fibrosi cistica,
predisposizione ad alcuni tumori, ecc.)
• Somatica (mutazione accidentale da cui
origina la patologia)
• Dovuta a presenza di DNA esogeno (virale
o batterico)
UN PO’ DI TEORIA
• Il concetto molecolare di malattia
• I livelli di studio del materiale genetico
Livello clinico:
sintomatologia
Livello istologico:
tessuto patologico
Livello cellulare:
anomalie citogenetiche
Livello molecolare:
mutazione sul DNA
Il danno molecolare
Cromosoma intero:
aberrazioni citogenetiche
Geni o gruppi di geni:
duplicazione, perdita, instabilità;
mutazioni puntiformi
Il danno molecolare
polisomie
Citogenetica
, FISH
perdita macroscopica
di materiale genetico
Citogenetica
, FISH
mutazione genica
PCR-based MB
Il danno molecolare
A g e n te fis ic o o c h im ic o ;
fa tto r i e r e d ita ri
Danno sul DNA
A b e r r a z io n i c r o m o s o m ic h e
A b e r r a z io n i g e n o m ic h e
M u ta z io n i p u n tifo r m i
V a r ia z . e s p r e s s io n e
C it o g e n e t ic a t r a d iz i o n a le
o c o m b in a ta c o n F IS H ;
CGH
A n a li s i d e i m i c r o s a t e l l i t i;
PCR
S e q u e n z ia m e n to ;
M a p p e d i re s tr iz io n e ;
SSCP
Q R T -P C R ;
M ic r o a r r a y s
Cariotipo
WCP
FISH
Il danno molecolare
A g e n te fis ic o o c h im ic o ;
fa tto r i e r e d ita ri
Danno sul DNA
A b e r r a z io n i c r o m o s o m ic h e
A b e r r a z io n i g e n o m ic h e
M u ta z io n i p u n tifo r m i
V a r ia z . e s p r e s s io n e
C it o g e n e t ic a t r a d iz i o n a le
o c o m b in a ta c o n F IS H ;
CGH
A n a li s i d e i m i c r o s a t e l l i t i;
PCR
S e q u e n z ia m e n to ;
M a p p e d i re s tr iz io n e ;
SSCP
Q R T -P C R ;
M ic r o a r r a y s
Patologia molecolare nel
tumore del grosso intestino
• Lo studio e la diagnosi molecolare dei
tumori
intestinali
rappresentano
un’efficace esemplificazione delle diverse
tecniche di Biologia Molecolare applicata
in Anatomia Patologica.
• Di queste patologie sono noti molti
processi patogenetici, che includono una
serie di mutazioni progressive su
antioncogéni (oncosoppressori) o su
oncogéni.
BASE COUNT
2984 a
3125 c
3155 g
2958 t
ORIGIN
1 bp upstream of EcoRI site.
1 gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt
61 gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca
121 ctgctgctca ctcagttcca caggtgggag gaacagcagg
181 tgcagatggg aaaacaaagg cccagagagg ggaagaaatg
241 ggcgacctca accacagccc agtgctggag ctgtgagtgg
301 cattcagcca gctcagggga aggacagggg ccctgaagcc
361 agggagctca gagagaaggg gaggggagtc tgagctcagt
421 ggtggtacct actcccttca cagggtaact gaatgagaga
481 caagtgtggc ccaccccacc ccagtgacac cagcccctga
541 atcaggaggg gctttctggg cacacccagt acccgtctct
601 cattttaatc ctcacagcag ctcaacaagg tacataccgt
661 tagggaaatt gaggctcgga gcggttaaac aactcacctg
721 gggttccctg gtctgaatgt gtgtgctgga ggatcctgtg
781 cccaaggtgg aggcataaat gggactggtg aatgacagaa
841 cattcactct gcaagtatct acggcacgta cgccagctcc
901 acagcggagc gatgcaatct gatttaggct tttaaaggat
961 tagcctcaac cctgtacctc ccctcccctc cacccccagc
1021 aaccccagag tgggggccat gtatccaaag aaactccaag
1081 ttttccagga gcaaaaacag aaacagcctg aggctggtca
1141 ctgagcagcc tagggggcag actaagcaga gggctgtgca
1201 tgtgtgccag gcacttcacc cgaggcactt cacaagcatg
1261 ctctttggga tgcaggtgaa acagttcctg gttcagagag
1321 cagcacagct cttctttaca gatgtgcttc cccacctcta
1381 tgccagcctg acggttgtgt ctgcctcagt catgctccat
1441 gagggtgttt gtgtctaagg ctgactgggt aactttggat
1501 gcctgtttcc tcatctgtca aacgggctct aacccactct
1561 agtcttcagc atcaggcatt ttggggtgac tcagtaaatg
1621 aacagccact aaggattctg cagtgagagc agagggccag
1681 gactgtctga ctcacgccac cccctccacc ttggacacag
1741 aggtacaatg actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt
1801 ccgggcagcg taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg
1861 tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag
1921 gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct
1981 actgacctgg gacagtgaat cgtaagtatg cctttcactg
2041 tccgagctcc ccatggccca ggcaggcagc aggtctgggg
2101 gggtatccgc ctgctgaggt gcagggcaga tggagaggct
2161 ataataacag cagccatgag ggttgtgtcc tgtttcccag
2221 gtacctcctg gtggatacac tggttcctgt aagcagaagt
2281 gcagtcctgg caccccagga tgggggacac cagccaagat
2341 cagccatttc tttctgtttg cacagctcct ctgtctgtcg
2401 cctataagcc tcaccacctc tcctactgct tgggcatgca
2461 tgaggaggtt aaggttcaga gaggggtggg gaggaacgcc
2521 tccagatatg accaggaaca gacctgtgcc agcctcagcc
2581 ccatgcaccg tggacctctg ggccctcctg tcccagtgga
2641 cactgtcacc cagggctcaa gctggcattc ctgaataatc
2701 taagctcagt gcgtgattaa gcctcataac cctccaaggc
2761 ttttacagat gaggaagatg gggacagaga ggtgaataac
2821 tccataattc gggctcaggc acctggctcc agtccccaaa
2881 gtcactgttt ctcttgggtc tcaggcgctg gatggggaac
2941 gaggcctctc tgatgctcgg tgacttcaga cagttgctca
3001 aaaacatgat aacctttgac ttctgtcccc tcccctcacc
caggccactc
ggaaaggtgg
gcttagagtg
cctaggagct
atgtagagca
aggggatgga
ttcccgctgc
ctgcctggag
cacgggggag
gagctttcct
caccatcccc
aggcctcaca
ggtcactcgc
ggggcaaaaa
caagcaggtt
tgcaatcaag
agtctccaaa
ctgtatacgg
aaattgaacc
gacccacata
cttgggaatg
gtgaagcggc
ccctgtctca
ttttccatcg
gagcggtctc
gatctcccag
gtagatcttg
ctaagtggta
gacgctgtgg
acactgccca
acttagcccc
cctcccccgt
cctcagcttc
cgaggggttc
caggaggggg
gcagctgagc
tcctgcccgg
ggatgagggt
acagcaacag
ggggctcctg
tctttctccc
ggctcacatt
ttacatcaaa
ggacaggaag
gctctgcacc
agttactagt
tggccccaaa
ctcttgaacc
aggaaacctg
acctctctgt
ccacccgacc
tcctgtgcct 3061
aacattgctg 3121
ggggtcattg 3181
accgagggca 3241
gcggaatatc 3301
gctgcaggga 3361
ctgaaaggag 3421
gaaagctctt 3481
ggagggcagc 3541
tgaactgttg 3601
attttacaga 3661
gccagtaagt 3721
ctggtagagc 3781
tgcactcatc 3841
tgcgggttgc 3901
tgggacccac 3961
ggcctccaac 4021
atcacactgg 4081
tcctcctgct 4141
aagagcctac 4201
aaacttccaa 4261
ctgcctgagg 4321
cggcccccca 4381
ggaccatcaa 4441
tccgctccga 4501
ggcggcagta 4561
ctaccagtgg 4621
ctctcccaga 4681
tttctgagcc 4741
ggcaaagcgt 4801
tgtttgctcc 4861
tgcccctctg 4921
aggcaccacc 4981
tggagaggct 5041
gttgtggagt 5101
tcctattttc 5161
tcccccctcg 5221
gtctaggtct 5281
caacaaagcg 5341
tctgttgtct 5401
cttctataga 5461
ctccatcccc 5521
atgggcctcc 5581
ctgtgagggg 5641
aggccacggc 5701
gtgattccca 5761
tcacacacca 5821
tggccctagt 5881
ggctgaactt 5941
tctcttgggc 6001
ttgatctctg 6061
aagtgttgga
ccaaggccaa
caagaactgg
atttaatttc
ttcagagagg
aatctggcct
aggctgcctc
attcaatgtc
atctcagttt
ggctcaattt
gaggacagat
atggtgacgc
agttggataa
ccccttcctg
tctctcgggc
cactcatgca
acagctatga
agtgacaggg
cataggcgag
tcctgggtag
gcaaagagtg
tggtttaaag
tctcctctcc
tagaagggcc
gcataatgaa
atctgagatc
cttgttccag
ggcttcaaac
gatggatggg
caccagcctc
gtgcctagcc
ccaagaatcc
aggcaggcgg
agctctacta
atttgggaag
gagatcacgc
ccaaaaacct
cacaactggg
gtgatggccc
agtgtcccca
ggaatttcca
aagggagatg
ctagctgaag
ttagaggcac
gttgctttat
ttatttccag
tgtattttgt
ggcatattct
tagggggctg
ggggcagggc
gcctgctctc
aggatttaat
ggtggccagt
tattctcgag
acaatagctc
ttaagtaact
cagagccttt
tgaagttttc
aggttttgga
tgtaagcaag
ttctatctat
tagatgatac
tgaggctgtg
tttaatggaa
ctgaaatggt
aggagctcaa
ttacgtcagt
agctagtgct
cctggtcaca
attctcttcc
aaatggtgcg
ctcccacctg
cttggcctca
agtcgccctc
aggagagagc
cccaacatga
tgaggacaca
ctttgtcact
tcttcactgt
tgtgggggaa
tccacctcct
atgggaattc
tggctgggtg
atcaagaggt
aaaatacaaa
ctgagacaga
cactgcactc
atgttagtgt
gagagtgagg
tgccaggcta
ccctgcagag
taagccatga
gaaatataca
aaaatacaaa
gagggccaag
tggaaggaaa
ctttttttct
taagatgatg
cctcagctag
caggcaggtg
aggttctgtg
gctggttcag
ttttcctgca
ttcctataga
aacttgctgc
tatgacaaag
tgtccaaggt
aattttagcc
tgattcaaga
gcgaaatctg
tagctctgtg
aaaatagggc
ggtgcctgta
tttgcttagc
aatttgccaa
cctggggagt
cctgtgtgca
tattcctcat
caaagaagtg
cttgggttta
ctgcaccctg
agattaggca
ccccgatccc
gtgtccgtac
ccaggcacta
aggttttgga
tgcttgagac
gctgtctcag
gacttgctgt
gaaaggagga
tgtgctcctc
ttgagcccag
tccatctgtt
caggggctct
caggagttca
aattagccag
agaatttctt
caccctggcg
acagagggcc
ccccaggacc
gaagccacaa
gcccaactcc
aggactgcac
gcactaattt
catgtattat
gagaaaggtg
cttttaaaag
ccagtttttc
gttttggttt
gacctcagtt
gtccgaagcc
ttgctgtgga
ccacaggccc
ctgagttttg
acgcctctaa
gcagcaggca
tccacctttc
cacacagcta
acagactgat
cttctggctt
tttaatccca
atttttagtg
taataatttg
aaacaccagg
atagggttag
actcagatgc
gcagcaggct
ggtacaggga
ccctgtccaa
aagtcattta
tttattgccc
ccgggttgct
gggagtggac
agaaatgtca
accatggggt
gcttttagga
gacctgatgt
caatgtcaca
ttcatgatct
atagcctcaa
aaccagagta
ccagctgtca
aattcccctg
ttgctacatt
cgcctgtaac
agacctgcct
gcgtggtggc
gaacccggga
gataaagcga
ccagtgaagt
agaggattct
cctctggccc
ctcctgacca
aaagttcagt
tagcaccgtc
gtaatgtgtg
gtggagagaa
tccaaggggg
atttcccaaa
tgtgactagt
ttcccatctg
tgggcatatc
tgacgttgac
caccactccc
gagacaggtc
aagacctgca
cttcttggca
tcatctccag
atagcaagtt
gctcccctct
cagctttgta
gacaaaacat
agttatttaa
caccttatag
tgttagtaag
gcagctggca
tgttcactgc
ctccgggaag
gggcttcctc
aggattcttt
ccccaggccc
agttcaacag
cttggtccct
gcttccctgt
ccatgaagcc
ccttggccag
gtgcagggtg
tataaggaac
gcccaattct
gagtgctggg
caaggccctg
ggtgatgtga
ccccctcgcc
tctaggaggg
gaacccagat
cccagcactt
ggccaacacg
acacgcctgt
ggtggaggtt
gactctgtct
cttctcccag
tgctaaaggc
tgaggccact
ctgagccctg
tgggagtgaa
ttcagttcta
gtctgttcca
accagctttg
ttgaagaatc
ttcaaggaca
agttaacaat
tgaagacggc
tggagtagaa
tttgaccatt
tattgtctca
aaaaagatga
gcaatagcag
ttttatgtgt
gaaactgagg
gacgtggagc
tcatttagcc
cacagagatg
ttaggattac
tgctctttgg
ggtaagcttt
tgtggcaatg
ggcagtaaac
tgagcaggag
aaatctacca
acctggtgcc
tctccattgt
cctgccagta
gttgtttgac
tattttatgc
ccctggcccc
ttcattcttt
atggcgactt
ctgcctctga
agcttgggag
gacattcatc
aaagccaaga
accctctctg
caccaggaaa
accctccctg
cacctgtctc
gccattctaa
tgggaggcca
gtgaaacctc
aatcccagct
tcagtgagcc
caaaaaaaac
ccccactttg
caagtggata
cagcatattt
taatgatggg
agagaaatta
acaacactag
tttggattac
cacttcattt
tcaatatttg
cctttttctt
gtggctgccg
aggttctacc
ggatcactgt
gctcggcaga
gcccc
Possibili percorsi genetici nell’insorgenza del tumore del colon-retto. La
maggior parte dei tumori si sviluppa secondo il modello tradizionale di
Vogelstein (riquadro verde), ma una parte segue invece il pathway
molecolare della instabilità microsatellitare (arancione) o altri percorsi e
meccanismi, ancora parzialmente ignoti.
MHAP=Mixed hyperplastic adenomatous polyp
Microsatelliti
(MSI)
Microsatelliti
(LOH), PCR,
analisi
mutazionale
Analisi Microsatellitare nel tumore
colorettale familiare o ereditario:
Instabilità Microsatellitare (MSI)
Il danno sul DNA
Dimerizzazione delle timine in seguito a
irradiamento con raggi ultravioletti
Il sistema di
riparazione
del DNA
(Mismatch
Repair System
Genes, MMR)
Se il sistema di riparazione del DNA
subisce o eredita una o più mutazioni, non
funziona più correttamente e il DNA
accumula mutazioni non riparate
Le mutazioni alterano la
funzionalità cellulare e
predispongono allo
sviluppo di tumori
(fenotipo RER =
Replication ERror)
Le mutazioni alterano
anche molti loci
microsatellitari, che
mostrano pattern
diversi rispetto al DNA
del tessuto normale
I microsatelliti
ATATATATATATATATAT TGCCTGGCTAGCTTGCA
Gene analizzato
Hereditary Non-Polyposis
Colorectal Cancer (HNPCC)
N
K
Negativizzazione immunoistochimica
delle proteine MMR
Lo studio dei microsatelliti prevede la
loro amplificazione differenziata
Microdissezione
PCR per il MS del normale
PCR per il MS del patologico
Metodica
• Microdissezione di sezioni fissate in formalina
ed incluse in paraffina
• Estrazione e purificazione del DNA
• Amplificazione
per
i
microsatelliti
BAT25,
BAT26, D2S123, D5S346 e D17S250 (ed altri)
• Elettroforesi
in
acrilammide,
colorazione
argentica OPPURE ANALISI DI FRAMMENTO !
Risultati: MSI assay su gel
MSI-H
(3/5)
MSI-H
(5/5)
MSI-H
(4/5)
RISULTATI: MSI assay (f.a.)
microsatellite stabile
RISULTATI: MSI assay (f.a.)
microsatellite instabile
Gene sequencing per
determinare le
mutazioni coinvolte e
la loro diffusione per
ereditarietà
Limiti dei microsatelliti
• Necessità di “arricchire” la popolazione cellulare
patologica con una microdissezione accurata.
• L’intero processo (pannello) viene effettuato su un
solo paziente alla volta e prende molto tempo.
• Costi di processazione relativamente elevati.
• Necessità di integrare i risultati con clinica e IIC.
Analisi Mutazionale nel tumore
colorettale sporadico
Geni coinvolti nella progressione
tumorale e metodiche diagnostiche
Gene
Mutazione
Metodiche
APC
Delezione
Southern Blot,
PCR+probe
K-RAS
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
DCC
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
TP5
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
NM-23
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
Gene
Mutazione
Metodiche
APC
Delezione
Southern Blot,
PCR+probe
K-RAS
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
DCC
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
TP5
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
NM-23
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
Il “gold standard” della BM su DNA:
Southern Blot
Southern Blot sull’antioncogene APC
(adenomatosis polyposis coli)
Problemi del Southern Blot
• Il quantitativo di DNA iniziale deve essere molto
alto (bassa sensibilità del metodo)
• Metodica macchinosa, lunga, costosa
• Utilizza metodi di rilevazione spesso obsoleti (ad
esempio la radioattività lab attrezzato)
Gene
Mutazione
Metodiche
APC
Delezione
Southern Blot,
PCR+probe
K-RAS
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
DCC
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
TP5
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
NM-23
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
Southern Blot “moderno”: Restriction
Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Si basa sui diversi pattern di digestione enzimatica
che derivano da polimorfismi presenti all’interno del
DNA non codificante o direttamente in seguito alla
mutazione nel gene studiato.
RFLP sull’oncogene K-RAS
(Kirsten retrovirus associated sequence)
Gene
Mutazione
Metodiche
APC
Delezione
Southern Blot,
PCR+probe
K-RAS
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
DCC
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
TP5
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
NM-23
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
Single-Strand Conformation
Polymorphism (SSCP)
SSCP sull’antioncogene NM-23
(no metastasis gene)
Gene
Mutazione
Metodiche
APC
Delezione
Southern Blot,
PCR+probe
K-RAS
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
DCC
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
TP5
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
NM-23
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
Metodi basati sull’associazione fra
PCR e sonda (PCR+probe)
• Oligonucleotide ligation assay (OLA)
• Allele specific oligonucleotide (ASO)
• Line Probe Assay (LiPA)
• altri…
In generale, si basano sulla possibilità
di sondare in modo specifico un tratto
genico (contenente ad esempio una
sequenza anomala in seguito a
mutazione) dopo amplificazione della
regione che lo contiene.
Oligonucleotide ligation assay (OLA)
Esempi di
risultati in
OLA
Gene
Mutazione
Metodiche
APC
Delezione
Southern Blot,
PCR+probe
K-RAS
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
DCC
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
TP5
LOH
Analisi dei
Microsatelliti
NM-23
Puntiforme
RFLP, SSCP,
PCR+probe
I microsatelliti
ATATATATATATATATAT TGCCTGGCTAGCTTGCA
Gene analizzato
Microdissezione
PCR per il MS del normale
PCR per il MS del patologico
Loss Of Heterozigosity (LOH)
Le bande contenute nel tessuto normale
sono confrontate con quelle del tumore:
- Se sono identiche,
identiche il gene è integro
- Se nel tumore una o alcune bande sono
perse,
perse il corrispondente allele è stato
eliminato dal cromosoma (LOH)
Loss Of Heterozigosity (LOH)
endoc. esoc.
N K N K
LOH
NO LOH
MW
Gene
MMR genes
APC
K-RAS
DCC
TP5
NM-23
Mutazione
Tutte
(o nessuna)
Metodiche
SAGGIO DI
ESPRESSIONE DI
UN GENE
OVERESPRESSO
O MUTATO:
REAL-TIME PCR
Saggi di espressione: Real-Time
PCR e Tissue Microarrays
• La Real-Time PCR è Quantitativa
• Serve per quantificare il numero di
copie originariamente presenti nel
campione di DNA (es. virus) o di RNA
• La misurazione avviene durante la
FASE ESPONENZIALE di replicazione
dell’acido nucleico
• Il MICROARRAY è una matrice di molte
RT-PCR eseguite contemporaneamente
Real-Time PCR
innesco
5’
3’
5’
Forward
Primer
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’
5’
5’
Reverse
Primer
Real-Time PCR
rimpiazzo
5’
Forward
Primer
R TaqMan®
Probe Q
3’
5’
5’
3’
5’
Reverse
Primer
Real-Time PCR
idrolisi
R
Q
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Real-Time PCR
completamento della polimerizzazione
R
Q
5’
3’
5’
5’
3’
5’
Real-Time PCR
Segnale output
R
Real-Time PCR: output
Segnale output
Campione
∆Rn
Rn
Soglia
CT
0
10
Controllo
“bianco”
N
20
Numero di cicli
30
40
N = CICLO - SOGLIA
Real-Time PCR: calcoli
X0 =
Xn
Xn
(1 + E)n
Xn = prodotto di PCR dopo n cicli
X0 = numero iniziale di copie
E = coefficiente di efficienza
X0
n = numero dei cicli
n
Real-Time PCR: risultato
10ng
0.001ng
RT-PCR: quantificazione assoluta
Per quantificare il numero di copie di RNA o
DNA inizialmente presenti, è necessario avere
degli standard interni molto precisi e rigorosi.
Esiste anche una Quantificazione Relativa !
Serve
per
quantificare
un
campione
RELATIVAMENTE ad un altro (ad es. il campione
A aveva 3 VOLTE l’RNA del campione B). Si usa
soprattutto in farmacogenomica e saggi di gene
expression come i MICROARRAY…
Microarrays
Microarrays
Microarrays
Gene
MMR genes
APC
K-RAS
DCC
TP5
NM-23
Mutazione
Tutte
Metodiche
SEQUENZIAMENTO
DIRETTO DI UNA
PARTE DEL GENE
Gene sequencing
Limiti e problemi della diagnostica
molecolare in Anatomia Patologica
Limiti
• I tempi di risposta sono relativamente lunghi
• E’ necessaria una campionatura eseguita
secondo rigide regole di conformità
• Il dato molecolare va inserito in un contesto
piu’ ampio (istopatologico, clinico, di
evoluzione della patologia,
anamnestico,etc.)
Problemi
• Qualificazione, addestramento ed
aggiornamento continuo del personale
• Corretta comunicazione con il patologo
ed il clinico
• Elevato investimento iniziale / costo per
metodica o per test
