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A. UBIALI Metodi per lo studio e la diagnosi molecolare dei tumori solidi: le neoplasie intestinali Torino, 11 giugno 2008 UN PO’ DI TEORIA • Il concetto molecolare di malattia • I livelli di studio del materiale genetico UN PO’ DI TEORIA • Il concetto molecolare di malattia • I livelli di studio del materiale genetico Differenze genetiche non patologiche nella popolazione umana 1. Polimorfismi di singolo nucleotide (SNPs): sono la forma prevalente di differenza, costituita da variazioni di una singola coppia di basi (1 bp). 2. Minisatelliti: 10-100 nucleotidi ripetuti più volte in tandem, fiancheggiati da sequenze uniche e caratteristiche. Un esempio è dato dai Variable Number Tandem Repeats (VNTR), che sono circa 50.000 nel genoma. 3. Microsatelliti: simili ai minisatelliti ma con sequenze ripetute più piccole, ad esempio tetranucleotidi o anche solo dinucleotidi ripetuti in tandem. Riassumendo… • DNA Satellite Differenze di lunghezza (molte bp in più o meno) CACA CACACACACACA GTGT GTGTGTGTGTGT CACA CA GTGT GT • SNPs Differenze di sequenza a livello di 1 bp G C • Può cambiare il sito di restrizione A T • Può cambiare il comportamento di ibridazione con sonde (FISH, CISH) La Patologia Molecolare La Patologia Molecolare é una branca della BM specializzata nell’utilizzo di tecniche molecolari allo scopo di: • Distinguere il “normale” dal “patologico”: diagnosi • Predire la progressione di malattia: prognosi • Fornire indicazioni mirate alla cura: terapia La Patologia Molecolare La Patologia Molecolare considera tre tipi di anomalia genetica: • Ereditaria (es. Fibrosi cistica, predisposizione ad alcuni tumori, ecc.) • Somatica (mutazione accidentale da cui origina la patologia) • Dovuta a presenza di DNA esogeno (virale o batterico) UN PO’ DI TEORIA • Il concetto molecolare di malattia • I livelli di studio del materiale genetico Livello clinico: sintomatologia Livello istologico: tessuto patologico Livello cellulare: anomalie citogenetiche Livello molecolare: mutazione sul DNA Il danno molecolare Cromosoma intero: aberrazioni citogenetiche Geni o gruppi di geni: duplicazione, perdita, instabilità; mutazioni puntiformi Il danno molecolare polisomie Citogenetica , FISH perdita macroscopica di materiale genetico Citogenetica , FISH mutazione genica PCR-based MB Il danno molecolare A g e n te fis ic o o c h im ic o ; fa tto r i e r e d ita ri Danno sul DNA A b e r r a z io n i c r o m o s o m ic h e A b e r r a z io n i g e n o m ic h e M u ta z io n i p u n tifo r m i V a r ia z . e s p r e s s io n e C it o g e n e t ic a t r a d iz i o n a le o c o m b in a ta c o n F IS H ; CGH A n a li s i d e i m i c r o s a t e l l i t i; PCR S e q u e n z ia m e n to ; M a p p e d i re s tr iz io n e ; SSCP Q R T -P C R ; M ic r o a r r a y s Cariotipo WCP FISH Il danno molecolare A g e n te fis ic o o c h im ic o ; fa tto r i e r e d ita ri Danno sul DNA A b e r r a z io n i c r o m o s o m ic h e A b e r r a z io n i g e n o m ic h e M u ta z io n i p u n tifo r m i V a r ia z . e s p r e s s io n e C it o g e n e t ic a t r a d iz i o n a le o c o m b in a ta c o n F IS H ; CGH A n a li s i d e i m i c r o s a t e l l i t i; PCR S e q u e n z ia m e n to ; M a p p e d i re s tr iz io n e ; SSCP Q R T -P C R ; M ic r o a r r a y s Patologia molecolare nel tumore del grosso intestino • Lo studio e la diagnosi molecolare dei tumori intestinali rappresentano un’efficace esemplificazione delle diverse tecniche di Biologia Molecolare applicata in Anatomia Patologica. • Di queste patologie sono noti molti processi patogenetici, che includono una serie di mutazioni progressive su antioncogéni (oncosoppressori) o su oncogéni. BASE COUNT 2984 a 3125 c 3155 g 2958 t ORIGIN 1 bp upstream of EcoRI site. 1 gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt 61 gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca 121 ctgctgctca ctcagttcca caggtgggag gaacagcagg 181 tgcagatggg aaaacaaagg cccagagagg ggaagaaatg 241 ggcgacctca accacagccc agtgctggag ctgtgagtgg 301 cattcagcca gctcagggga aggacagggg ccctgaagcc 361 agggagctca gagagaaggg gaggggagtc tgagctcagt 421 ggtggtacct actcccttca cagggtaact gaatgagaga 481 caagtgtggc ccaccccacc ccagtgacac cagcccctga 541 atcaggaggg gctttctggg cacacccagt acccgtctct 601 cattttaatc ctcacagcag ctcaacaagg tacataccgt 661 tagggaaatt gaggctcgga gcggttaaac aactcacctg 721 gggttccctg gtctgaatgt gtgtgctgga ggatcctgtg 781 cccaaggtgg aggcataaat gggactggtg aatgacagaa 841 cattcactct gcaagtatct acggcacgta cgccagctcc 901 acagcggagc gatgcaatct gatttaggct tttaaaggat 961 tagcctcaac cctgtacctc ccctcccctc cacccccagc 1021 aaccccagag tgggggccat gtatccaaag aaactccaag 1081 ttttccagga gcaaaaacag aaacagcctg aggctggtca 1141 ctgagcagcc tagggggcag actaagcaga gggctgtgca 1201 tgtgtgccag gcacttcacc cgaggcactt cacaagcatg 1261 ctctttggga tgcaggtgaa acagttcctg gttcagagag 1321 cagcacagct cttctttaca gatgtgcttc cccacctcta 1381 tgccagcctg acggttgtgt ctgcctcagt catgctccat 1441 gagggtgttt gtgtctaagg ctgactgggt aactttggat 1501 gcctgtttcc tcatctgtca aacgggctct aacccactct 1561 agtcttcagc atcaggcatt ttggggtgac tcagtaaatg 1621 aacagccact aaggattctg cagtgagagc agagggccag 1681 gactgtctga ctcacgccac cccctccacc ttggacacag 1741 aggtacaatg actcctttcg gtaagtgcag tggaagctgt 1801 ccgggcagcg taggcgggcg actcagatcc cagccagtgg 1861 tccgataact ggggtgacct tggttaatat tcaccagcag 1921 gatccactgc ttaaatacgg acgaggacag ggccctgtct 1981 actgacctgg gacagtgaat cgtaagtatg cctttcactg 2041 tccgagctcc ccatggccca ggcaggcagc aggtctgggg 2101 gggtatccgc ctgctgaggt gcagggcaga tggagaggct 2161 ataataacag cagccatgag ggttgtgtcc tgtttcccag 2221 gtacctcctg gtggatacac tggttcctgt aagcagaagt 2281 gcagtcctgg caccccagga tgggggacac cagccaagat 2341 cagccatttc tttctgtttg cacagctcct ctgtctgtcg 2401 cctataagcc tcaccacctc tcctactgct tgggcatgca 2461 tgaggaggtt aaggttcaga gaggggtggg gaggaacgcc 2521 tccagatatg accaggaaca gacctgtgcc agcctcagcc 2581 ccatgcaccg tggacctctg ggccctcctg tcccagtgga 2641 cactgtcacc cagggctcaa gctggcattc ctgaataatc 2701 taagctcagt gcgtgattaa gcctcataac cctccaaggc 2761 ttttacagat gaggaagatg gggacagaga ggtgaataac 2821 tccataattc gggctcaggc acctggctcc agtccccaaa 2881 gtcactgttt ctcttgggtc tcaggcgctg gatggggaac 2941 gaggcctctc tgatgctcgg tgacttcaga cagttgctca 3001 aaaacatgat aacctttgac ttctgtcccc tcccctcacc caggccactc ggaaaggtgg gcttagagtg cctaggagct atgtagagca aggggatgga ttcccgctgc ctgcctggag cacgggggag gagctttcct caccatcccc aggcctcaca ggtcactcgc ggggcaaaaa caagcaggtt tgcaatcaag agtctccaaa ctgtatacgg aaattgaacc gacccacata cttgggaatg gtgaagcggc ccctgtctca ttttccatcg gagcggtctc gatctcccag gtagatcttg ctaagtggta gacgctgtgg acactgccca acttagcccc cctcccccgt cctcagcttc cgaggggttc caggaggggg gcagctgagc tcctgcccgg ggatgagggt acagcaacag ggggctcctg tctttctccc ggctcacatt ttacatcaaa ggacaggaag gctctgcacc agttactagt tggccccaaa ctcttgaacc aggaaacctg acctctctgt ccacccgacc tcctgtgcct 3061 aacattgctg 3121 ggggtcattg 3181 accgagggca 3241 gcggaatatc 3301 gctgcaggga 3361 ctgaaaggag 3421 gaaagctctt 3481 ggagggcagc 3541 tgaactgttg 3601 attttacaga 3661 gccagtaagt 3721 ctggtagagc 3781 tgcactcatc 3841 tgcgggttgc 3901 tgggacccac 3961 ggcctccaac 4021 atcacactgg 4081 tcctcctgct 4141 aagagcctac 4201 aaacttccaa 4261 ctgcctgagg 4321 cggcccccca 4381 ggaccatcaa 4441 tccgctccga 4501 ggcggcagta 4561 ctaccagtgg 4621 ctctcccaga 4681 tttctgagcc 4741 ggcaaagcgt 4801 tgtttgctcc 4861 tgcccctctg 4921 aggcaccacc 4981 tggagaggct 5041 gttgtggagt 5101 tcctattttc 5161 tcccccctcg 5221 gtctaggtct 5281 caacaaagcg 5341 tctgttgtct 5401 cttctataga 5461 ctccatcccc 5521 atgggcctcc 5581 ctgtgagggg 5641 aggccacggc 5701 gtgattccca 5761 tcacacacca 5821 tggccctagt 5881 ggctgaactt 5941 tctcttgggc 6001 ttgatctctg 6061 aagtgttgga ccaaggccaa caagaactgg atttaatttc 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ctgcctctga agcttgggag gacattcatc aaagccaaga accctctctg caccaggaaa accctccctg cacctgtctc gccattctaa tgggaggcca gtgaaacctc aatcccagct tcagtgagcc caaaaaaaac ccccactttg caagtggata cagcatattt taatgatggg agagaaatta acaacactag tttggattac cacttcattt tcaatatttg cctttttctt gtggctgccg aggttctacc ggatcactgt gctcggcaga gcccc Possibili percorsi genetici nell’insorgenza del tumore del colon-retto. La maggior parte dei tumori si sviluppa secondo il modello tradizionale di Vogelstein (riquadro verde), ma una parte segue invece il pathway molecolare della instabilità microsatellitare (arancione) o altri percorsi e meccanismi, ancora parzialmente ignoti. MHAP=Mixed hyperplastic adenomatous polyp Microsatelliti (MSI) Microsatelliti (LOH), PCR, analisi mutazionale Analisi Microsatellitare nel tumore colorettale familiare o ereditario: Instabilità Microsatellitare (MSI) Il danno sul DNA Dimerizzazione delle timine in seguito a irradiamento con raggi ultravioletti Il sistema di riparazione del DNA (Mismatch Repair System Genes, MMR) Se il sistema di riparazione del DNA subisce o eredita una o più mutazioni, non funziona più correttamente e il DNA accumula mutazioni non riparate Le mutazioni alterano la funzionalità cellulare e predispongono allo sviluppo di tumori (fenotipo RER = Replication ERror) Le mutazioni alterano anche molti loci microsatellitari, che mostrano pattern diversi rispetto al DNA del tessuto normale I microsatelliti ATATATATATATATATAT TGCCTGGCTAGCTTGCA Gene analizzato Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (HNPCC) N K Negativizzazione immunoistochimica delle proteine MMR Lo studio dei microsatelliti prevede la loro amplificazione differenziata Microdissezione PCR per il MS del normale PCR per il MS del patologico Metodica • Microdissezione di sezioni fissate in formalina ed incluse in paraffina • Estrazione e purificazione del DNA • Amplificazione per i microsatelliti BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 e D17S250 (ed altri) • Elettroforesi in acrilammide, colorazione argentica OPPURE ANALISI DI FRAMMENTO ! Risultati: MSI assay su gel MSI-H (3/5) MSI-H (5/5) MSI-H (4/5) RISULTATI: MSI assay (f.a.) microsatellite stabile RISULTATI: MSI assay (f.a.) microsatellite instabile Gene sequencing per determinare le mutazioni coinvolte e la loro diffusione per ereditarietà Limiti dei microsatelliti • Necessità di “arricchire” la popolazione cellulare patologica con una microdissezione accurata. • L’intero processo (pannello) viene effettuato su un solo paziente alla volta e prende molto tempo. • Costi di processazione relativamente elevati. • Necessità di integrare i risultati con clinica e IIC. Analisi Mutazionale nel tumore colorettale sporadico Geni coinvolti nella progressione tumorale e metodiche diagnostiche Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe Il “gold standard” della BM su DNA: Southern Blot Southern Blot sull’antioncogene APC (adenomatosis polyposis coli) Problemi del Southern Blot • Il quantitativo di DNA iniziale deve essere molto alto (bassa sensibilità del metodo) • Metodica macchinosa, lunga, costosa • Utilizza metodi di rilevazione spesso obsoleti (ad esempio la radioattività lab attrezzato) Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe Southern Blot “moderno”: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Si basa sui diversi pattern di digestione enzimatica che derivano da polimorfismi presenti all’interno del DNA non codificante o direttamente in seguito alla mutazione nel gene studiato. RFLP sull’oncogene K-RAS (Kirsten retrovirus associated sequence) Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) SSCP sull’antioncogene NM-23 (no metastasis gene) Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe Metodi basati sull’associazione fra PCR e sonda (PCR+probe) • Oligonucleotide ligation assay (OLA) • Allele specific oligonucleotide (ASO) • Line Probe Assay (LiPA) • altri… In generale, si basano sulla possibilità di sondare in modo specifico un tratto genico (contenente ad esempio una sequenza anomala in seguito a mutazione) dopo amplificazione della regione che lo contiene. Oligonucleotide ligation assay (OLA) Esempi di risultati in OLA Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe I microsatelliti ATATATATATATATATAT TGCCTGGCTAGCTTGCA Gene analizzato Microdissezione PCR per il MS del normale PCR per il MS del patologico Loss Of Heterozigosity (LOH) Le bande contenute nel tessuto normale sono confrontate con quelle del tumore: - Se sono identiche, identiche il gene è integro - Se nel tumore una o alcune bande sono perse, perse il corrispondente allele è stato eliminato dal cromosoma (LOH) Loss Of Heterozigosity (LOH) endoc. esoc. N K N K LOH NO LOH MW Gene MMR genes APC K-RAS DCC TP5 NM-23 Mutazione Tutte (o nessuna) Metodiche SAGGIO DI ESPRESSIONE DI UN GENE OVERESPRESSO O MUTATO: REAL-TIME PCR Saggi di espressione: Real-Time PCR e Tissue Microarrays • La Real-Time PCR è Quantitativa • Serve per quantificare il numero di copie originariamente presenti nel campione di DNA (es. virus) o di RNA • La misurazione avviene durante la FASE ESPONENZIALE di replicazione dell’acido nucleico • Il MICROARRAY è una matrice di molte RT-PCR eseguite contemporaneamente Real-Time PCR innesco 5’ 3’ 5’ Forward Primer TaqMan® R Probe Q 5’ 3’ 5’ 5’ Reverse Primer Real-Time PCR rimpiazzo 5’ Forward Primer R TaqMan® Probe Q 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Reverse Primer Real-Time PCR idrolisi R Q 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Real-Time PCR completamento della polimerizzazione R Q 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Real-Time PCR Segnale output R Real-Time PCR: output Segnale output Campione ∆Rn Rn Soglia CT 0 10 Controllo “bianco” N 20 Numero di cicli 30 40 N = CICLO - SOGLIA Real-Time PCR: calcoli X0 = Xn Xn (1 + E)n Xn = prodotto di PCR dopo n cicli X0 = numero iniziale di copie E = coefficiente di efficienza X0 n = numero dei cicli n Real-Time PCR: risultato 10ng 0.001ng RT-PCR: quantificazione assoluta Per quantificare il numero di copie di RNA o DNA inizialmente presenti, è necessario avere degli standard interni molto precisi e rigorosi. Esiste anche una Quantificazione Relativa ! Serve per quantificare un campione RELATIVAMENTE ad un altro (ad es. il campione A aveva 3 VOLTE l’RNA del campione B). Si usa soprattutto in farmacogenomica e saggi di gene expression come i MICROARRAY… Microarrays Microarrays Microarrays Gene MMR genes APC K-RAS DCC TP5 NM-23 Mutazione Tutte Metodiche SEQUENZIAMENTO DIRETTO DI UNA PARTE DEL GENE Gene sequencing Limiti e problemi della diagnostica molecolare in Anatomia Patologica Limiti • I tempi di risposta sono relativamente lunghi • E’ necessaria una campionatura eseguita secondo rigide regole di conformità • Il dato molecolare va inserito in un contesto piu’ ampio (istopatologico, clinico, di evoluzione della patologia, anamnestico,etc.) Problemi • Qualificazione, addestramento ed aggiornamento continuo del personale • Corretta comunicazione con il patologo ed il clinico • Elevato investimento iniziale / costo per metodica o per test
