Programma del corso di Genomica Strutturale e Funzionale. A.a. 2007-2008.
Docente: Stefano Landi
Dipartimento di Scienze Uomo e Ambiente, Genetica.
Via S. Giuseppe 22.
56100
Universita’ di Pisa.
Tel: 050 836241
Fax: 050 551290
e-mail: [email protected]
Testi:
Si consiglia: “Genetica umana molecolare” (Tom Strachan – Read, Ed. UTET)
Inoltre: "Introduzione alla genomica” (Gibson-Muse, Ed. Zanichelli) capitolo “Gli SNPs e la
variazione” , per il linkage disequilibrium e gli studi di associazione di tipo caso-controllo.
Introduzione.
Cosa e’ la genetica. Cosa e’ la genomica.
Metodiche di analisi.
La PCR.
Schema di funzionamento. Visualizzazione del prodotto di PCR. Condizioni di reazione della PCR.
Il Mg++, il numero di cicli, il “touch-down”. La lunghezza dei prodotti di PCR. Tipi di Taq DNA
Polimerasi: “Proof Reading”, “Hot Start”. Le attivita’ esonucleasiche 5’>3’ e 3’>5’. La “Multiplex”
PCR. Marcature dei prodotti di PCR.
La PCR asimmetrica. La “nested” PCR. Il “controllo” e le contaminazioni.
Metodi di amplificazione del genoma. DOP-PCR. Adapter-ligation-PCR. Inter-Alu PCR. DNA
polimerasi “Phi-29” (“whole genome amplification”).
Il disegno dei primers. Criteri di scelta dei primers. La Tm. Le strutture secondarie. Procedimenti
consigliati per il disegno di sonde e primers. I “mismatch” nei primers. Specificita’ dei primers.
L’aggiunta di “code” al 5’. Mismatch al 3’. Le “ASO-PCR” e “ARMS-PCR”. Utilizzo di regioni
conservate e primers degenerati per la diagnosi e la tipizzazione di ceppi virali.
Le sequenze ripetute nei genomi. DNA satellite, minisatelliti, microsatelliti, SINEs, LINEs,
Pseudogeni, Pseudogeni Processati, retrovirus endogeni e similari, altri tipi di ripetizioni (MERs,
MIRs).
Real-time RT-PCR. Quantificazione dell’espressione genica. Assoluta e relativa. I micro-arrays per
l’analisi dell’espressione genica.
Tipi di polimorfismi rinvenibili nei genomi e relative metodiche di genotipizzazione.
Microsatelliti e minisatelliti. Misurazione della lunghezza di prodotti di PCR ad alta risoluzione
con metodi fluorescenti. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs). Micro-delezioni, micro-
insersioni. Delezioni di loci genici. Esempio delle Glutatione transferasi M1 e T1 (GSTT1 e
GSTM1). Inversione estese. L’inversione di 0.9Mb nel cromosoma umano 17q21.31 e la
divergenza evolutiva per mancanza di ricombinazione. Le duplicazioni segmentali. L’esempio del
CYP2D6.
Utilizzo dei polimorfismi per lo studio delle malattie a base genetica (mendeliane).
Applicazione dei microsatelliti nello studio di malattie genetiche. Analisi di linkage.
Calcolo del LOD score in famiglie di probandi. L’identificazione di un gene-malattia conseguente
l’analisi dei LOD score.
I caratteri complessi: la suscettibilita’ genetica.
Utilizzo degli SNPs in genetica. Il concetto “common disease, common allele”.
Le conseguenze biologiche dei polimorfismi genetici a livello aminoacidico, e nelle sequenze
regolatorie (splicing, 3’ UTR e promotore).
Approccio del “gene candidato”: l’esempio del metabolismo degli xenobiotici.
Esempio di studio di associazione caso-controllo e studio di malattie multifattoriali.
Il concetto di rischio e il calcolo dell’ Odd Ratio.
L’approccio “whole-genome scan”. Introduzione al concetto di aplotipi.
Gli aplotipi, la mappatura degli aplotipi e il concetto di “linkage disequilibrium” (LD).
Calcolo del LD. Metodi di identificazione degli aplotipi: ASO-PCR, ricostruzione tramite algoritmi
(PHASE), analisi di cellule gametiche (spermi), ricostruzione dei Trios familiari.
Utilizzo dei blocchi di LD per gli studi di associazione su tutto il genoma.
