Approccio ribonomico allo studio di una malattia genetica rara
e complessa che predispone al cancro: la sindrome MEN1 come
modello
E Luzi
Regional Center on Endocrine Hereditary Tumors,
AOUC, Department of Internal Medicine, University of Firenze
La Neoplasia Endocrina Multipla di tipo 1 (MEN1;
MIM#131100) è caratterizzata dalla presenza di tumori delle
paratiroidi, del pancreas endocrino e dell’ipofisi anteriore, ed
include oltre 20 diverse combinazioni di tumori endocrini e non
endocrini
Il gene MEN1 umano comprende 10 esoni distribuiti lungo una
regione di 7kb nel cromosoma 11q13. Il gene MEN1 codifica per
una proteina, menin, di 67kDa.
Il trascritto principale MEN1 mRNA e’ di 2.8 kb ma almeno
sei trascritti alternativi sono stati caratterizzati con
variazioni nella regione 5’-UTR.
Menin e’ espressa ubiquitariamente con ortologhi in vertebrati e
invertebrati ma senza alcuna omologia con altre proteine o
sequenze note eccetto 3 segnali di localizzazione nucleare
(NLSs) alla estremita’C-terminale.
Mutazioni germinali del gene MEN1 sono presenti in circa
l’90% dei pazienti MEN1.
La perdità di eterozigosità (LOH) al locus 11q13 è stata
riscontrata in tumori MEN1
La contemporanea presenza di LOH e mutazioni germinali
inattivanti nei pazienti MEN1 suggerisce che il gene MEN1 e’ un
oncosoppressore in accordo con il modello “two hit” postulato da
Knudson.
Sono state descritte 1.133 mutazioni: 23% non-senso;
9%splice-sites, 41% delezioni o inserzioni frameshift,
6% delezioni o inserzioni in-frame , 20% missense e 1%
delezione totale.
Un totale di 24 differenti polimorfismi del gene MEN1
sono stati riportati (12 nella regione codificante, 9 negli
introni, 3 nella regione 3’-UTR).
Il 10%-30% dei pazienti MEN1 non ha mutazioni nella
regione codificante ne’nei siti di splicing cosicche’ le
mutazioni potrebbero cadere nelle regioni 5’-UTR e/o 3’UTR, negli introni o essere fenocopie.
La questione fondamentale che si pone nella Sindrome MEN1
e’la tessuto-specificita’ della tumorigenesi .
Perche’, in un sindrome tumorale ereditaria, le manifestazioni
cliniche sono limitate ai tessuti endocrini, adiposo e dell’epidermide
mentre menin e’ espressa in tutti i tessuti?
Una ipotesi e’ che la tessuto-specificita’ sia governata da
un meccanismo di controllo trascrizionale e/o post-trascrizionale .
A supporto di questa ipotesi ci sono due evidenze :
Cellule linfoblastoidi eterozigoti: un meccanismo regolativo
mantiene costante il livello di espressione della proteina “wild-type”.
Menin-Serial Analysis of Chromatin Occupancy (SACO):
menin si lega a regioni promotrici, codificanti e 3’-UTR.
Menin stessa potrebbe regolare trascrizionalmente e/o
post-trascrizionalmente il meccanismo di compensazione.
RUOLO DEL GENE MEN1, DEL SUO mRNA
E DELLA PROTEINA MENIN
Fibroblasti di due pazienti MEN1 con due diverse mutazioni
troncanti eterozigoti e in fibroblasti normali.
I pazienti A e B sono due sorelle con mutazione germinale
eterozigote, frameshift 738del4 nell’esone 3, che introduce
nella proteina un codone di stop prematuro.
Il paziente C presenta una mutazione germinale eterozigote
nonsense R460X nell’esone 10.
MEN1 mRNA expression
MEN1 mRNA and menin expression in MEN1
parathyroid adenomas
siRNA-mediated silencing of MEN1 mRNA
Ribozyme-mediated silencing of MEN1 mRNA
Band-shift assay of
menin-MEN1 mRNA binding
1 2 3
1 2 3 4 5
Western blot of menin
UV-crosslinking
Western blot
immunoprecipitation
Menin
-UV
+UV
+UV NSP
SP
Anti
Menin
IgI
Menin
control
PROBE
2.9kb
In vitro menin recognized its mRNA and specific RNA-proteins
complexes bound to MEN1 mRNA in MEN1 patient fibroblast
extracts.
TargetScan analysis predicted MEN1 3’-UTR as a putative target for the
miR-24a
TGA
MEN1 3’-UTR 818 nt
AAAAAAA
Predicted consequential pairing of target region (top) and miRNA (bottom))
Position 599-605 of MEN1 3' UTR
hsa-miR-24
ΔGtotal = -12.455
5' ...CAGCCUAUGAGCAUCCUGAGCCC...
||
|||||||
3'
GACAAGGACGACUU-GACUCG
HS: AUCCUGAGCCCCG
Mm: AUACUGAGCCUCG
Rn: AUACUGAGCCUCG
Cf: AUCCUGAGCCCUG
∆ ° = -256,40
miR-24a binds also p27, TGF-beta, caspase 8, p16, all involved in MEN1
tumorigenesis
microRNAS AS TUMOR SUPPRESSORS OR ONCOGENES
The MEN1 3’-UTR is a target for miR-24a
Northern blot of miR-24a
1
2
3
4
Western blot of menin
miR-24a
menin
5S
actin
1
1 : 2’-O-MeRNA AS24-a
2 : 2’-O-MeRNA ASMuta4-a
3 : pre-miRControl
4 : pre-miR24-a
2
3
4
Expression of miR-24 and menin protein in MEN1 tissues
Northern blot of miR-24a
Western blot of menin
5S
menin
actin
miR-24a
1 2 3 4 5
1 2 4 5
1: sporadic insulinoma
2: MEN1 insulinoma
3: MEN1 gastrinoma
4: MEN1 pancreatic cancer
5: normal pancreas of MEN1 patient
Control of microRNA biogenesis
miRNAs involved in feedback motifs.
Some biological processes involve
stochastic decisions, which make use
of noise.
Gene regulatory networks involving
positive and negative feedback have
the potential to control the effects of
noise, by buffering its impact on
gene expression.
Computational analysis has
suggested that miRNAs are
overrepresented in gene regulatory
networks, suggesting that they
confer useful regulatory
possibilities.
CONCLUSIONI
La tessuto-specificita'della tumorigenesi MEN1 potrebbe originare da
perturbazioni del feedback regolativo costituito mir-24-menin-MEN1 mRNA
sotto forma di complesso ribonucleoproteico (RNA REGULON)
L’interazione del miR-24 con altri geni coinvolti nella tumorigenesi MEN1
potrebbe essere alla base di un meccanismo EPISTATICO
che governa la complessita’ della patologia.
Questi risultati hanno un importante significato funzionale per la comprensione
della sindrome MEN1 e lo sviluppo di una “RNA-based” therapy per il
controllo della tumorigenesi nei pazienti MEN1
RNA-based therapy in MEN1 syndrome
REGIONAL CENTER FOR HEREDITARY ENDOCRINE TUMORS
Prof.ssa.Maria Luisa Brandi
Laboratory of Molecular Genetics
Clinicians
Dott.ssa Francesca Marini
Dott. Alberto Falchetti
Dott.ssa. Silvia Carbonell Sala
Dott.ssa. Laura Masi
Dott.ssa. Isabella Tognarini
Dott.ssa. Federica Cioppi
Dott.ssa. Gianna Galli
Dott.ssa. Antonietta Amidei
…and all the other lab members !
Prof. FrancescoTonelli
S.O.D. Chirurgia Generale
