relazione sull`attivita` di ricerca svolta nell`ambito del progetto
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RELAZIONE FINALE SULL’ATTIVITA’ DI RICERCA SVOLTA NELL’AMBITO DEL PROGETTO: “SVILUPPO DI STRATEGIE TERAPEUTICHE PER LA SINDROME DI AICARDI-GOUTIÈRES IN MODELLI SPERIMENTALI PRECLINICI” PERIODO: 1/1/2008-31/12/2010. ESTENSIONE al 21/4/2011. RESPONSABILE DELLA RICERCA: Prof. Alberto Izzotti, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova La presente relazione è composta da 31 pagine e 30 Figure allegate. Genova 21/4/2011 Prof. Alberto Izzotti 2 INDICE Introduzione............................................................................................................. pag. 3 PARTE A. Analisi dei meccanismi patogenetici Obiettivo 1. Valutazione comparativa dell‟effetto delle diverse mutazioni AGS sull‟espressione genica dei linfociti liquorali ................................................... pag. 3 Obiettivo 2. Analisi del ruolo dei microRNA nella patogenesi dell‟AGS ............... pag. 5 Obiettivo 3. Analisi delle interazioni tra riparo del DNA e mutazioni AGS ............ pag. 6 Parte B. Sviluppo di strategie terapeutiche e preventive Obiettivo 1. Modulazione farmacologia .................................................................... pag. 7 Obiettivo 2. Induzione di neuroprotezione mediante transfezione di oligonucleotidi ................................................................................... pag. 18 Obiettivo 3. Inibizione dell‟attivazione linfocitaria mediante RNA interference ....................................................................................................... pag. 23 Conclusioni................................................................................................................ pag. 26 Pubblicazioni scientifiche ........................................................................................ pag. 29 Attività congressuale ................................................................................................ pag. 30 Personale partecipante ............................................................................................ pag. 31 3 Introduzione L‟attività di ricerca svolta antecedentemente al presente progetto per conto della IAGSA ha permesso di descrivere nel dettaglio i meccanismi molecolari della patogenesi della sindrome di Aicardi-Goutières (AGS) mediante analisi su microarray dell‟espressione genica in linfociti di liquor cefalorachidiano (Izzotti et al., Neurology, 71: 1-3, 2008; Izzotti et al., Brain Pathol., 19: 650-660, 2009). Su tali basi l‟attività di ricerca sulla patogenesi dell‟AGS è proseguita nell‟ambito del progetto di ricerca qui presentato (Parte A) con tre specifici obiettivi: (1) valutare l‟effetto di diverse mutazioni AGS sull‟espressione genica dei linfociti liquorali; (2) analizzare il ruolo dei microRNA nella patogenesi dell‟AGS; (2) analizzare le interazioni tra riparo del DNA e mutazioni AGS. Sviluppataa quindi adeguatamente la conoscenza ei processi patogenetici dell‟AGS è stato possibile realizzare lo sviluppo di nuove strategie per la terapia e la prevenzione (Parte B). PARTE A. Analisi dei meccanismi patogenetici Obiettivo 1. Valutazione comparativa dell’effetto delle diverse mutazioni AGS sull’espressione genica dei linfociti liquorali Questa linea di ricerca ha prodotto un articolo in extenso intitolato „Different mutations in TREX1 and RNAse H genes affect clinical features by selective gene expression dysregulation‟ attualmente inviato per la pubblicazione. L‟abstract dell‟articolo è di seguito riportato: “Aicardì-Goutières syndrome (AGS) is a rare severe encephalopathy of mutational origin characterised by increased levels of interferon-alpha in cerebrospinal fluid (CSF), that arises in newborns during the first year of life. Molecular mechanisms relating interferon-alpha and brain damage have been recently depicted by microarray analysis performed in CSF lymphocytes, which demonstrated that inhibition of angiogenesis and activation of neurotoxic lymphocytes were the major pathogenic mechanisms involved. As microarray highlighted a remarkable interindividual variation, we explored the influence of different AGS mutations on AGS clinical course. We detected the occurrence of the following mutations in twenty-one AGS patients: AGS1 biallelic mutation, AGS2 bi- and mono-allelic mutations, AGS4 biallelic mutation, and mutation occurring in other sites than AGS1, 2, 4 genes. The most frequent mutation was AGS2 biallelic (11 patients). Mutational status affected clinical feature mainly through high interferon-alpha levels, brain atrophy, occurrence of epileptic symptoms, and skin lesions. 4 Gene expression alterations detected in CSF lymphocytes using cDNA microarray revealed that different mutations resulted in specific gene expression signatures. AGS1 mutation targets TREX gene, a pivotal intracellular exonuclease, AGS2 and AGS4 mutations target genes that encode RNaseH subunits. Gene expression data indicated that the increased half-life of intracellular nucleic acid, resulting from different AGS mutations, triggers interferon-alpha production through different molecular pathways”. I principali risultati di questo lavoro sono riportati nella Fig. 1. La specificità dell‟effetto neurotossico indotta nel linfociti da mtuazioni AGS è stata studiata da un altro lavoro intitolato „Anti-angiogenic and neurotoxic properties of AGS mutated lymphocytes‟ inviato per la pubblicazione di cui si riporta di seguito l‟abstract: “T lymphocytes play a major role in counteracting cancer appearance and development. Immune therapies against cancer are focused on eliciting a cytotoxic T cell response. This anticancer activity is related to a variety of mechanisms including activation of cytokines and proapoptotic mediators. Interferon (IFN)-alpha is an established inhibitor of cancer cell growth. A clinical situation involving the coexistence of high IFN-alpha levels and lymphocyte activation is the Aicardi-Goutières Syndrome (AGS), a progressive encephalopathy arising during the first year of life characterized by basal ganglia calcifications, leukodistrophy, and microcephaly. Both IFN-alpha and lymphocytes are characteristically increased in the cerebro-spinal fluid of AGS patients in absence of any infections. AGS1 mutation silences TREX1 gene, a major endogenous nuclease. The herein presented in vitro study aims at evaluating the possibility that TREX1 mutation is able to potentiate the anticancer properties of T cells. TREX1-mutated lymphocytes were collected from an AGS patient and co-cultured with vascular endothelial cells and neuroblastoma cells in presence of IFN-alpha. Obtained results indicate that TREX1-mutated lymphocytes synergizes with interferonalpha in inhibiting the growth of neuroblastoma cancer cells and angiogenesis displayed by vascular endothelial cells, as detected by matrigel assay. These effects were not detected using normal (TREX1 wild type) lymphocytes. Cathepsin D was recognized by QPCR as the main mediator produced by TREX1 mutated lymphocytes able to reduce neuroblastoma cell growth. In conclusion, our study provides evidence that mutations silencing TREX1 gene dramatically increase the capability of T-lymphocytes of inhibiting angiogenesis and growth of neoplastic neuronal cells.”. I principali risultati di questo lavoro sono riportati nelle Fig. 2-4. 5 Obiettivo 2. Analizzare il ruolo dei microRNA nella patogenesi dell’AGS Gli studi effettuati hanno dimostrato come l‟accumulo di RNA endogeno sia alla base della patogenesi dell‟AGS. Tra gli RNA i microRNA svolgono un ruolo fondamentale nel controllo della maturazione e della crescita tissutale ivi incluso il sistema nervoso centrale. Pertanto si è voluto studiare se le mutazioni AGS potessero ostacolare questo fondamentale processo fisiologico di crescita. Il lavoro sperimentale svolto ha dimostrato come le mutazioni AGS blocchino in modo specifico il turnover dei microRNA coinvolti nello sviluppo del sistema nervoso centrale. Tale lavoro intitolato “The Aicardi-Goutières Syndrome. Molecular and clinical features of RNAse deficiency and microRNA overload” è attualmente in corso di pubblicazione. L‟abstract dell‟articolo è di seguito riportato: “Intracellular RNAses are involved in various functions, including microRNA maturation and turnover. Mutations occurring in genes encoding RNAses cause Aicardi-Goutiéres Syndrome (AGS). AGS mutations silence RNAse activity, thus inducing accumulation of endogenous RNAs, mainly consisting of short RNAs and microRNAs. Overload of intracellular RNA triggers Toll like receptors-dependent interferon-alpha production in the brain, which in turn activates neurotoxic lymphocytes and inhibits angiogenesis thus inducing the typical clinical phenotype of AGS. However, these pathogenic mechanisms are attenuated after three years of age by the endogenous production of DNAJP58IPK and Cystatin F, which arrest AGS progression. Because RNAses are involved in microRNA turnover, we evaluated the expression of 957 microRNAs in lymphocytes from AGS patients and control patients. Our results indicate that microRNA overload occurs in AGS patients. This upregulation inhibits microRNA turnover impeding the synthesis of the novel microRNAs required for the differentiation and myelination of the brain during the initial period of postnatal life. These pathogenic mechanisms result in AGS, a neurological syndrome characterized by irritability, mild hyperpyrexia, pyramidal and extrapyramidal signs, and spastic-dystonic tetraplegia. Typical cerebrospinal fluid alterations include lymphocytosis and elevated interferon-alpha levels. Brain imaging demonstrates cerebral calcifications, white matter abnormalities, and progressive cerebral atrophy. Thus, evidence exists that mutations silencing intracellular RNases affect microRNA turnover resulting in the severe clinical consequences in the brain characterizing the clinical feature of AGS” I principali risultati di questo lavoro sono riportati nelle Figure 5-7. 6 Obiettivo 3. Analisi delle interazioni tra riparo del DNA e mutazioni AGS A seguito dell‟incontro con Francesca Storici presso l‟Istuto Mondino tenutosi nel dicembre 2010 era stato deciso di esaminare la possibilità che il sovraccarico citoplasmatico di RNA avesse un effetto retroattivo sul DNA inducendo a livello del nucleo l‟attivazione incontrollato di processi di riparo del DNA e di blocco della citodieresi. Questa ipotesi era basata sulla dimostrazione sperimentale comprovante che l‟RNA citoplasmatico ha un ruolo importante nell‟attivazione del riparo del DNA (Storici et al., RNA-templated DNA repair. Nature, 447:338-341, 2007). Date tali premesso i dati di espressione genica relativi i pazienti AGS prodotti nel database realizzato nel corso del precedente studio (Izzotti et al., Brain Pathol., 19: 650-660, 2009) sono stati analizzati verificando il livello di espressione di geni coinvolti nel DNA repair nei pazienti AGS rispetto ai controlli. I risultati ottenuti, hanno dimostrato che esiste un aumento dell‟espressione di almeno alcuni tra questi geni, come riportato nel lavoro in corso di pubblicazione di cui si riporta di seguito il paragrafo dedicato a questi risultati: “…Recent data indicate the possibility that another pathogenic mechanism of AGS is activated by the inappropriate intracellular accumulation of RNA oligonucleotides might be related to the exceedingly high activation of DNA repair genes, which induce cell cycle arrest. Indeed, it has been reported that RNA can serve as a direct template for DNA double-strand break (DSB) repair, as demonstrated in yeast, bacteria, and mammalian cells [Storici et al., Nature, 447:338-341, 2007]. An RNA/DNA hybrid is the molecular intermediate necessary to allow transfer of information from RNA to DNA. Among the factors most likely affecting the RNA/DNA hybrid‟s stability in vivo are ribonucleases H (RNase H, type 1 and 2), which are known to hydrolyze RNA and RNA/DNA hybrids. Based on this premise, AGS could be interpreted as a DNA-repair overload syndrome. This view is supported by the finding that several DNA repair genes are upregulated in AGS patients, compared with control patients. Specifically, this feature includes significant (P<0.05) upregulation of DNA helicase 3 (3.8fold), postmeiotic segregation-increased protein 2 PMS2 (3.1-fold), DNA helicase homologue 1 PIF1 (2.1-fold), DNA polymerase 2 (2.8-fold), and XRCC1 (2.4-fold), as inferred from the gene-expression database available from studies performed in AGS patients [Izzotti et al., Brain Pathol., 19: 650-660, 2009]”. 7 Parte B. Sviluppo di strategie terapeutiche e preventive Gli studi svolti per indagare la patogenesi dell‟AGS hanno dimostrato il ruolo patogenetico fondamentale di alcuni meccanismi che possono rappresentare importanti bersagli per interventi di prevenzione secondaria e di terapia attuabili mediante farmaci, introduzione di oligonucleotidi ed inibizione dell‟espressione genica. L‟efficacia di tali interventi tesi a modulare il processo patogenetico dell‟AGS è stata valutata in vitro nel modelli di co-coltura tra linfociti AGS e (A) cellule neuronali, mirato a valutare la modulazione della neurotossicità linfocitaria; (B) cellule endoteliali vascolari angiopoietiche, mirato a valutare la modulazione dell‟inibizione dell‟angiogenesi. La messa a punto di tale modello sperimentale è stata ampiamente descritta nelle predenti relazioni annuali. Obiettivo 1. Modulazione farmacologia Base di partenza scientifica I farmaci di un possibile interesse sono stati inizialmente identificati mediante “literature database discovery” come descritto nei precedenti report. Tra i farmaci potenziali sono quindi stati selezionate le molecole di maggiore interesse da sottoporre alla sperimentazione preclinica sulla base della loro efficacia potenziale verso i meccanismi patogenetici dell‟AGS, della loro attuale disponibilità farmacologica, e della reale possibilità di utilizzo in pazienti in vivo.Sono quindi risultati idonee per la sperimentazione le seguenti molecole farmacologicamente attive: - rapamicina; - FK506 (Tacrolimus); - medi-545 (Sifalimumab); - eritropoietina; - cistatina; - ciclofosfamide. Si riporta di seguito la base di conoscenze scientifiche cha hanno suggerito di selezionare ognuna di queste molecole e la sua specifica potenziale relazione con i meccanismi patogenetici propri dell‟AGS. 8 Rapamicina (Sirolimus) Questa molecola rappresenta un derivato del noto agente immunosoppressore ciclosporina A il quale ha però presentato caratteristiche di neurotossicità, angiotossicità arteriolare e nefrotossicità tali da limitarne il possibile utilizzo nell‟AGS. La rapamicina è un derivato non neurotossico della ciclosporina A dotato di attività immunosoppressiva, privo di effetti antiangiogenici, e dotato di attività non neurotossica ma anzi neurotrofica. La Rapamicina riconsce come meccanismo molecolare principale d‟azione l‟inibizione intracellulare di mTOR, proteina fondamentale nell‟attivazione dei meccanismi intracellulari conseguenti alla trasduzione del segnale indotta da IFN-alfa. Tale inibizione è esercitata dal complesso Rapamicina-FKBP-12. Le FKBP sono appunto immunofiline endogene in grado di inibire mTOR distinte in base al loro peso molecolare espresso in kd. L‟inibizione di mTOR blocca la produzione di interleuchine immunostimolanti (IL2) (Patel et al. Expert Opin. Drug Saf. (2009) 8(4):421-434) e la proliferazione linfocitaria (Ackler et al. Mol Cancer Ther 2008;7(10). October 2008). E‟ stata inoltre specificatamente dimostrata la capacità della Rapamicina di superare la barriera emtaoencefalica (Davies DM et al. N Engl J Med 2008; 358:200-203). Lo specifico effetto neuroprotettivo della Rapamicina appare correlato con l‟inbizione parziale di mTOR (Malagelada C et al. The Journal of Neuroscience, January 20, 2010:30(3):1166). Inoltre la Rapamicina migliora la produzione della proteina di mielinizzazione 22 (PMP22) incrementando la quantità e la lunghezza degli internodi mielinici e l‟espressione di proteine mieliniche facilitando così i processi di ri-mielinizzazione (Rangaraju S et al. The Journal of Neuroscience, August 25, 2010 • 30(34):11388 –11397). Il fatto che mTOR sia il bersaglio principale della Rapamicina indica l‟esistenza di un potenziale sinergismo d‟azione della Rapamicina o dei suoi analoghi con altri farmaci che inibiscono la stessa molecola quali il MEDI-545. L‟inibizione di mTOR indotta dalla Rapamicina alla dose di soli 50 ng/ml potrebbe è stata però anche correlata con l‟aumenti di autofagia e il rallentamento della crescita cellulare in quanto mTOR è anche l‟effettore intracellulare dell‟Insulin Growth Facotr 1 (IGF-1) che attiva mTOR via AKT (IGF1→ AKT→mTOR). Pertanto la Rapamicina è un agente in grado di mimare farmacologicamente la restrizione calorica (Gjengju Conference, Nutrion an dphysical Activity, Korea, 2011, Izzotti, personal communication). Derivati della Rapamicina quali il Tacrolimus sono oggi caratterizzati da minori effetti collaterali e da una maggiore biodisponibilità (Le Tourneau et al. British Journal of Cancer (2008) 99, 1197 – 1203). 9 FK-506 (Tacrolimus) E‟ un derivato della Rapamicina approvato dall‟FDA quale agente immunosoppressore. Il suo meccanismo d‟azione è legato all‟inattivazione di mTOR tramite il legame a monte con due diverse immunofiline, FKBP12 (analogamente alla Rapamicina) ma soprattutto con FKBP506 e anche con FKBP52. I complessi Tacrolimus-FKBP12/506 inibiscono non solo mTOR ma anche l‟attivazione della calcineurina responsabile a sua volta della produzione di interleuchnine immunostimolanti (IL2) e dell‟attivazione e della moltiplicazione dei linfociti T (Patel et al. Expert Opin. Drug Saf. (2009) 8(4):421-434 ). Il Tacrolimus passa la barriera ematoencefalica. Il Tacrolimus è dotato di neurotropismo grazie alla sua capacità di proteggere i neuroni dalla morte cellulare indotta dalla liberazione di calcio grazie ad una inibizione selettiva dei canali del calcio. Inoltre il Tacrolimus promuove la crescita dei filopodi neuronali (neuriti) attraverso l‟attivazione della FKBP52 (Ruan et al. PNAS January 8, 2008 vol. 105). Tacrolimus tramite l‟attivazione di FKBP506 promuove nei neuroni la rigenerazione assonale e lo sviluppo di fibre motorie e sensoriali avendo una vera azione di fattore di crescita neuronale (Chabas et. Journal of neurotrauma 26:97–108, 2009). La rigenerazione assonale indotta è dovuta all‟attivazione della proteina di crescita 43 (growth associated protein GAP43) conseguente all‟inibizione dell‟attività fosfatasica della calcineurina esercitata dal Tacrolimus. Lo stesso meccanismo determina inoltre la stimolazione dei altri fattori di crescita neuronali quali il TGFB1 che determina incremento della proliferazione delle cellule di Shwann con facilitazione dei processi di rimielinizzazione (Fansa H et al. J. Hand Surg.Br., 24:38–42, 1999). Tra i diversi derivati della Rapamicina quali Temsirolimus (CCI-779, Wyeth), Everolimus (RAD001, Novartis Pharmaceutical), Edeforolimus (AP23573, Ariad Pharmaceutical) il Tacrolimus appare quello dotato della migliore solubilità e farmacocinetica con un a rapida conversione in vivo nei metaboliti attivi e una maggiore emivita di questi rispetto alla Rapamicina; possibile effetto collaterale riferito la miopatia iopreflessica (Le tourneau et al. British Journal of Cancer (2008) 99, 1197 – 1203). Il Tacrolimus è specificatamente attivo anche contro linfociti T a differenza di RITUXIMAB selettivamente attivo solo verso i linfociti B e pertanto usato solo nella terapia dei linfomi B (Fillaci G., Immunologia Clinica, Università di Genova, personnal communication). Per quanto riguarda possibili effetti collaterali oltre alla miopatia ipotonica è stato segnalato che protratti trattamenti possono indurre edema della parte vascolare (Wijdicks EF.Liver Transpl 2001;7:937–42). Appare pertanto opportuna nel caso della sussistenza di 10 micorangiopatie, così come accade nell‟AGS, la co-somministrazione di farmaci angioproiettori quali ad esempio l‟eirtropoietina. Sifalimumab (MEDI-545) Si tratta di un anticorpo monoclonale umano specificatamente diretto contro l‟ INF-α a cui è in grado di legarsi neutralizzandolo. Tale farmaco è già in corso di utilizzato sperimentale clinico in patologie dermatologiche (dermatiti atopiche, psoriasi) senza avere riscontrato effetti collaterali correlati alla riattivazione di virus lisogeni quali EBV e HSV1/2 (Bissonnette R et al. J Am Acad Dermatol. 62:427-436, 2010). L‟utilizzo di questo farmaco è consigliato esclusivamente nelle situazioni cliniche con dimostrato aumentato livello di IFNalfa con specifico riferimenti ai casi di dermatite e soprattutto lupus erythematosus systemicus (LES) in cui questo accade. La capacità del farmaco di abbassare i livelli di interferone alfa è stata clinicamente dimostrata in pazienti affetti da LES (Yao et al. Use of type I interferoninducible mRNAs as pharmacodynamic markers and potential diagnostic markers in trials with sifalimumab, an anti-IFNalpha antibody, in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 12:s6, 2010). Il farmaco è attualmente commercializzato dalla ditta AstraZeneca/MedImmune. Esiste un trial di fase 2 in corso in pazienti in LES (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00979654; http://www.nature.com/nbt/journal/v27/n9/fig_tab/nbt0909-779_T1.html). Tutte le ricerche effettuate hanno dimostrato il ruolo fondamentale dell‟IFN-alfa nella patogenesi dell‟AGS con particolare riferimento alla sua capacità di attivare la neurotossicità linfocitaria e l‟inibizione dell‟angiogenesi cerebrale (Izzotti et al., BrainPathol., 2009). Inoltre i livelli di IFN-alpha sono fortemente associati con l‟acuzie del quadro clinico e tendono progressivamente ad attenuarsi con l‟entrata dei pazienti nella fase di stato (LanziG., Fazzi E. et al., Neurology, 64: 1621-1624, 2005). Eritropoietina (EPO) Sebbene l‟EPO sia ampiamente utilizzata nell‟uomo da molto tempo, solo negli ultimi anni sono emerse importanti evidenze scientifiche che dimostrano l‟efficacia di questo farmaco come agente neuroportettore. L‟EPO passa facilmente la barriera ematoencefalica. EPO è risultata meuroportettiva sul sistema nervosa centrale limitando i danni indotti in un modello sperimentale murino dall‟occlusione all‟arteria cerebrale. Tale effetto protettivo è realizzato attraverso l‟attivazione di specifiche metallotioneine e l‟incremento dell‟attivazione degli astrociti (K. Wakida et al. Neuroscience 148 (2007) 105–114). 11 EPO si è dimostrata in grado di diminuire in modo importante l‟infiammazione e l‟attivazione della glia diminuendo I livelli I interleuchine immunostimolanti (IL6) in modelli sperimentali murini di encefalite autoimmune. Un effetto protettivo specifico è stato osservato nei confronti della demileinizzazione (D. Agnello et al. Brain Research 952 (2002) 128–134). Tali effetti protettivi ed in particolare la diminuzione dell‟attivazione astrocitica sono dovuti all‟azione inibitoria esercitata dall‟EPO nei confronti dell‟attivazione degli agonisti del glutammato mGluR del gruppo I la cui attivazione induce rapide variazioni dei flussi di calcio con conseguente attivazione dell‟apoptosi (Gunnarson E et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(5):1602-7). La EPO si è dimostrata protettiva anche se somministrato a posteriori rispetto all‟induzione del danno neuronale. Infatti 48 h dopo l‟induzione chimica di danno neuronale EPO ha protette dalla eccito tossicità glutammato dipendente non solo grazie all‟inibizione gliale ma anche ad opera di un effetto diretto sui neuroni (Yoo et al. Journal of Neuroscience Research 87:150–163 (2009). EPO facilita la rigenerazione neuronale e gliale dopo il verificarsi di danni encefalici di tipo ischemico od occlusivo (Iwai et al. Stroke 2010). Uno specific blocco dell‟angiogenesi EPO dipendente è stata dimostrata nei pazienti AGS (Izzotti et al., Brain Pathol., 2009). Cistatina Le Cistatine sono una famiglia di inibitori naturali delle cistein proteasi secrete negli spazi extracellulari al fine di controllare ed inibire l‟eccessiva attività delle proteasi responsabili della degradazione proteica in generale e specificatamente dei processi de mielinizzazione. Le Cistatine C ed F sono espresse in cellule attivate e differenziate del sistema immunitario La Cistatitna C umana ha dimostrato attività neuroprotettiva in vitro proteggendo dal danno neuronale indotto in vario modo quale la deprivazione nutrizionale, il trattamento con colchicina, staurosporina e stress ossidativo (N. Kopitar-Jerala. FEBS Letters 580 (2006) 6295–6301). La Cistatina C esercita un ruolo protettivo verso i neuroni attraverso l‟inibizione dell‟attivazione di mTOR ed è pertanto ipotizzabile un suo utilizzo terapeutico nelle malattia neurodegenerative patogeneticamente caratterizzate dall‟attivazione di questa proteina (Tizon et al. PLoS ONE 5(2010): e9819). L‟attivazione di mTOR si verifica soprattutto in seguito a stimolazione con FINa e rappresenta quindi un meccanismo importante nella patogenesi dell‟AGS. L‟inibizione di mTOR da parte della Cistatina C rende plausibile un suo sinergismo d‟azione con altri farmaci aventi un simile bersaglio molecolare quali il Tacrolimus e il Sifalimumab. La demielinizzazione induce di rimbalzo la attivazione 12 protettiva dell‟espressione della Cistatina F in un modello murino di topo knockout emizigote (plptg/– mice) che presenta un quadro patologico di demielinizzazione analogo a quello della sclerosi multipla (Ma et al. Journal of Neuroscience Research 89:639–649 (2011). La espressione di Cistatina F nei linfociti liquorali di pazienti AGS risulta inversamente correlata al livello di IFNa liquorale. Inoltre il suo progressivo incremento con l‟età è correlata con un‟attenuazione del danno encefalico e con la stabilizzazione del quadro clinico (Izzotti et al., Brain PAhtil., 2009). Un‟eccessiva espressione delle catepsine non bilanciata dall‟attivazione del loro principale inibitore, la Cistatina C, determina demielinizzazione. Tale dato indica come il rapporto catepsine/cistatine sia un fondamentale elemento che determina l‟instaurarsi del processo di demielinizzazione e l‟eventuale impedimento dei seguenti processi di rimielinizzazione come dimostrato i n un modello murino knock out di sclerosi multipla (Ma et al. Neurochem Res (2007) 32:311–320). Anche nell‟GAS sussiste demielinizzazione caratterizzata a livello di espressione genica nei linfociti liquorali da una eccessiva produzione di Catepsina D. Quando questa sovra espressione è bilanciata dall‟attivazione dell‟espressione del suo inibitore, la Cistatina F, si osserva l‟attenuazione del quadro clinico; tale fenomeno si verifica in media dopo i 3 anni di età (Izzotti et al., Brain Pathol., 2009). Il deficit di Cistatina determina nel topo knockout l‟insorgenza di disordini della coordinazione motoria, atrofia cerebellare, atrofia neuronale cerebellare ed encefalica; tali fenomeni patologici sono arrestati dalla Cistatina C (Kaur et al. The American Journal of Pathology, Vol. 177, No. 5, November 2010). Ciclofosfamide La Ciclofosfamide è un potente agente alchilante comunemente usato in terapia oncologica. Stante il suo tropismo per le cellule immunocompetenti e però anche utilizzato quale agente immunosoppressore in diverse patologie autoimmuni quali lupus e artrite reumatoide. Sia il pro metabolita che i metaboliti attivati passano la barriera ematoencefalica. La Ciclofosfamide diminuisce i l numero e l‟attività di cellule proinfiammatorie T helper 1 (Th1), la produzione di IFNg, interleuchine immunostimolanti (IL12) mentre aumenta il numero e l‟attività di cellule anti-infiammatorie T helper 2 (Th2) e citochine immunosoppressive IL4 e IL10 sia nel liquor cerebrospinale che nel sangue. La Ciclofosfamide risutla ben tollerata e pertanto viene utilizzata anche in terapia pediatrica. Esercita inoltre una specifica azione immunosoppressiva e immuno-modulante sulla componente linfocitaria presente nel sistema nervoso centrale. Pertanto è plausibile il suo 13 utilizzo anche dopo il verificarsi di attivazione linfocitaria in sede intratecale per arrestare il qudro clinico e prevenirne l‟ulteriore evoluzione (Awad et al. Ther Adv Neurol Disord (2009) 2(6) 357368). L‟azione immunomodulante intratecale diretta della Ciclofosfamide è stata provata non solo nella sclerosi multipla ma anche in altre patologie neurologiche (Kanter et al. Epilepsia 49: 914920 ). La Ciclofosfamide è correntemente utilizzata nella terapia delle vasculiti encefalitiche T (Fillaci G., personal communication). Vista l‟ampia disponibilità di materiale sperimentale e soprattutto clinico relativo all‟utilizzo di questo farmaco non si è ritenuto necessario procedere sperimentalmente ad una sua ulteriore valutazione nell‟ambito delle ricerche presentate in questa relazione. Materiali e Metodi Viste tali premesse i farmaci citati sono stati valutati per la loro capacità di inbire la neurotossicità e l‟angioinibizione esercitata da linfociti AGS in vitro. Tutti i farmaci sono stati valutati con l‟eccezione della ciclofosfamide di cui esiste già una ampia e documentata sperimentazione pre-clinica e clinica. I farmaci sono stati valutati da soli od in associazione tra loro alle seguenti dosi: - Sifalimumab: 36 ug/piastra - Rapamicina:25 uM - Tacrolimus: 25 uM - Eritropoietina: 80 UI - Cistatina C: 0.1 uM Tali dose sono state scelte previa esecuzione di curve dose-risposta al fine di accertare la non tossicità delle posologie utilizzate. Linfociti immortalizzati prelevati da pazienti AGS e controllo non portatore sono state messe a disposizione dall‟IRCSS Mondino a cura della Prof.ssa E. Fazzi e della Dott.ssa S. Orcesi prelevati da pazienti AGS sono state co-coltivate con astrociti in linea continua U87MG per valutare l‟effetto neurotossico. Gli stessi linfociti sono stati co-coltivati con cellule endoteliali angiogeniche in linea continua HUVEC coltivate su matrigel per valutare l‟effetto angioinibitore. Al fine di riprodurre la reale situazione esistente in vivo i linfociti sono stati attivati mediante aggiunta di IFN-alfa (2,500 UI). 14 Gli end point di effetto analizzati sono stati (a) valutazione microscopica della morfogenesi vascolare; (b) valutazione della vitalità cellulare mediante colorazione con cristal violetto delle cellule in adesione e valutazione spettrofotometrica a fibra ottica; (c) quantificazione dell‟espressione della catepsina D linfocitaria mediante qPCR. Ogni condizione sperimentale è stata valutata in triplicato tre esperimenti indipendenti. Risultati 1. Neurotossicità Valutazione della neurotossicità linfocitaria La Figura 8 A e B riporta i risultati ottenuti valutando quantitativamente la sopravvivenza cellulare neuronale mediante colorazione con cristal violetto delle cellule in adesione cocoltivate con linfociti. La presenza di linfociti ha di per sé un moderato effetto neurotossisco diminuendo la sopravvivenza neuronale rispettivamente del 31% nel caso di linfociti di controllo (C) e del 21% nel caso di linfociti patologici AGS, senza quindi alcuna differenza significativa tra linfociti C e AGS in condizioni basali. La presenza di IFN-alfa ha aumentato in modo significativo la neurotossicità linfocitaria nei C ma soprattutto negli AGS che si sono pertanto dimostrati più sensibili all‟attivazione interferonica rispetto ai controlli. Tale dato suggerisce l‟opportunità di utilizzare contemporaneamente non solo farmaci linfo-inbiitori ma anche IFN-alfa inibitori. Modulazione farmacologica della nerutossicità linfocitaria Eritropoietina (EPO) Come riportato in Fig. 9 A e B, EPO da sola non esercita effetto neuro protettivo né in presenza di linfociti C o AGS né in assenza o presenza di IFN-a. Appare pertanto non opportuno il suo utilizzo come singolo agente farmacologico. Rapamicina (RAP) Come riportato in Fig. 10 A e B, RAP esercita un significativo effetto di inibizione della neurotossicità linfocitaria solo nei confronti dei linfociti C. Tuttavia tale azione scompare in presenza di IFNa. Nessun effetto protettivo viene invece esercitato nei confronti di linfociti AGS sia in assenza che presenza di IFNa. Non viene riscontrata nessuna azione sinergica tra RAP ed EPO. Pertanto se viene confermato che RAP ha nel caso di linfociti normali attività inibitoria e neuroprotettiva tale effetto non è consistente in modo tale da sussistere quando i meccanismi 15 di neurotossicità sono incrementati o dalla presenza di IFNa o dalla presenza di mutazione AGS o da entrambi. Non sembra pertanto opportuno l‟utilizzo di RAP da sola in pazienti AGS. Tacrolimus Come riportato in Fig. 11 A e B, TACR esercita neuroprotezione in linfociti C sia in assenza che in presenza di IFNa, . In tale situazione l‟effetto protettivo aumenta in presenza di EPO (sinergismo). Effetto protettivo esercitato anche sui linfociti AGS soprattutto in presenza di IFNa, situazione in cui si rileva un forte sinergismo con EPO. Pertanto TACR sembra agire soprattutto nei confronti di linfociti particolarmente attivati o da IFNa o da mutazione AGS. Tale situazione è dovuta al fatto che il farmaco inibisce l‟attivazione di mTOR, proteina specificatamente attivata da IFNa. Pertanto appare opportuno l‟utilizzo del TACR per contrastare l‟azione patogenetica dei linfociti AGS soprattutto in presenza di IFNa e in sinergismo con EPO. Il sinergismo con EPO è giustificato dal fatto che è noto che trattamenti protratti con TACR inducono edema della parete vascolare (Wijdicks EF.Liver Transpl 2001;7:937–42). Tale effetto è appunto controllato dall‟associazione con un angio-protettore quale la EPO. Sifalimumab Come riportato in Fig. 12 A e B, SIF non esercita effetto protettiva in linfociti sia C che AGS in assenza di IFNa. SIF annulla completamente l‟effetto di IFNa sia in C che AGS. Utilizzando entrambi i tipi di linfociti si osserva sinergismo con EPO. Tali risultati sono in linea con lo specifico meccanismo di inibizione selettiva dell‟IFNa. Pertanto appare opportuno l‟utilizzo di SIF esclusivamente in presenza di IFNa, eventualmente in sinergismo con EPO. Cistatina C (CIST) Come riportato in Fig. 13 A e B, CIST esercita effetto protettivo sia in C che AGS ma solo in assenza di IFNa. Si osserva moderato sinergismo con EPO. Pertanto non appare opportuno l‟utilizzo della sola CYST in presenza di IFNa su linfociti AGS. Inoltre l‟effetto protettivo appare di entità meno rilevante rispetto ad altri farmaci come il Tacrolimus. 16 Farmacoterapia combinata I risultati ripostati dimostrano come alcuni tra i farmaci testati siano risultati in grado di inibire l‟azione neurotossica di linfociti AGS attivati da IFNa. Il farmaco più efficace è risultato essere il Tacrolimus, moderata l‟attività della Cistatina C, modesta quella della Rapamicina. L‟EPO da sola non ha effetto neuro protettivo ma è in grado di potenziare l‟azione esercitata dagli altri faramci. IUl Sifalimumab risulta molto efficace nell‟inibire specificatamente l‟azione dell‟IFNa. Date queste premesse, appare interessante verificare se l‟associazione razione di più farmaci sia in grado di risultare maggiormente efficace rispetto alla somministrazione di singoli farmaci. Abbiamo così valutato l‟associazione TACR+SIF+EPO. Tale associazione permette infatti di inibire l‟azione linfocitaria inibendo mTOR (TACR), inibire l‟effetto di IFNa (SIF), potenziare l‟effetto neuro protettivo (EPO). Come riportato in Fig. 14 A e B, tale associazione si è rivelata particolarmente efficace nell‟inibire l‟effetto neurotossico di linfociti AGS in presenza di IFNa. In particolare, come valutato in quadruplicato in 4 esperimenti indipendenti tutti riportati in Fig.18, la sopravvivenza neuronale scende al 59.1% nel caso di co-coltura con linfociti AGS attivati da IFNa. Tale sopravvivenza risale sistematicamente al 97.8% nel caso di co-trattamento con TACR+SIF+EPO. 2.Angio-inbizione Come riportato in Fig. 15, i linfociti di controllo anche in presenza di IFNa non hanno un effetto particolarmente rilevante sulla formazione di corpi a morfologia angiogenica da parte delle cellule endoteliali. Al contrario l‟inibizione dei fenomeni di angiogenesi risulta particolarmente spiccata nel caso dei linfociti AGS stimolati dall‟IFNa. In tale situazione infatti le cellule endoteliali crescono più lentamente, appaiono maggiormente sofferenti e con citoplasma più sottile. Risulta inoltre evidente la difficoltà alla giunzione con la carente formazione dei ponti vascolari che risultano grossolanamente incompleti. Come riportato in Fig. 16, il trattamento con EPO è in grado di attenuare in modo rilevante in fenomeno di angio-inibizione specificatamente osservato nei linfociti AGS stimolati con IFNa. LA presenza di EPO migliora infatti significativamente la connessione dei ponti vascolari e i completamente della formazione dei corpi angiomorfici. Sussiste tuttavia ancora una certa differenza rispetto ai linfociti di controllo. dell‟EPO è rilevante ma non completo. Pertanto l‟effetto angioprotettore 17 Come riportato in Fig. 17, il trattamento con Sifalimumab non è in grado di esercitare fenomeni specifici di angioprotezione né nei linfociti di controllo né in quelli AGS. Pertanto la sola azione di inibizione dell‟IFNa non sembra sufficiente ad inibire l‟effetto antiangiogenico che appare quindi prevalentemente dovuto all‟attivazione linfocitaria. Come riportato in Fig. 18., il trattamento combinato EPO+SIF appare in grado di inibire significativamente l‟inibizione dell‟angiogenesi sia nei linfociti di controllo che AGS. Tuttavia tale effetto protettivo e maggiore nel caso dei linfociti AGS ove è ancora più rilevante di quello esercitato dalla EPO da sola. La Fig. 19 mostra come l‟uso combinato di EPO+SIF+TACR sia in grado di inibire in modo quasi totale l‟effetto antiangiogenico estrinsecato dai linfociti AGS sotto l‟azione dell‟IFNa. Infatti utilizzando questa farmacoterapia combinata si assiste a una costituzione dei corpi angiomorfici pressoché analoga a quella osservata con i linfociti nomali ed addirittura assimilabile a quella realizzata dalle cellule endoteliali coltivate in assenza di linfociti e di IFNa. (Vedi Fig. 20, pannello a destra). Tale rilevante effetto protettivo è dovuto al sienergismo di diversi meccanismi d‟azione specificatamente riconducibili ai singoli farmaci utilizzati. L‟EPO realizza infatti un effetto vaso protettore direttamente sulle cellule endoteliali, il SIF inibisce l‟azione antiangiogenica dell‟IFNa che però è estrinsecata soprattutto ad opera dei linfociti la cui attivazione è a sua volta inibita dal TACR. Conclusioni Le prove in vitro effettuate indicano che l‟associazione TACR+SIF+EPO è un potente inibitore dei meccanismi patogenetici attivati dalla mutazione AGS e dalla presenza di IFNa. Tale effetto vale sia per i fenomeni di attivazione linfocitaria ed ai loro conseguenti effetti neurotossici che per i fenomeni di inibizione dell‟angiogenesi. Tali farmaci sono già stati testati ampiamente in vivo nell‟uomo anche se con finalità terapeutiche diverse da quelle dell‟AGS e mai finora in associazione. Sembra pertanto realizzabile una valutazione della loro efficacia protettiva nella fase clinicamente acuta dell‟AGS caratterizzata da elevato IFNa nel CSF e linfocitosi liquorale. L‟eventuale utilizzo della Cistatina C richiede invece ulteriori approfondimenti preclinici. 18 Obiettivo 2. Induzione di neuroprotezione mediante transfezione di oligonucleotidi Base di partenza scientifica Le RNAsi intracellulari sono coinvolte in varie funzioni tra cui la maturazione e il turnover dei microRNA. Le mutazioni che interessano i geni che codificano per le RNAsi sono alla base della eziopatogenesi dell‟AGS. Le mutazioni AGS producono infatti un deficit nelle attività dell‟RNAsi inducendo un accumulo di RNA endogeno, per buona parte costituito da microRNA (Pulliero et al., Mutat Res., 2011). I microRNA sono una classe di piccole (2023nt) molecole di RNA non codificanti che agiscono come regolatori negativi della espressione degli RNA messaggeri e quindi dell‟espressione genica a livello posttrascrizionale. I microRNA rappresentano una famiglia di molecole regolatrici coinvolte nel ciclo cellulare, nell‟apoptosi e nello sviluppo neurale. Nel cervello dei mammiferi i microRNA sembrano essere fondamentali per l‟identità delle cellule durante lo sviluppo neuronale e nel regolare la plasticità sinaptica neuronale, svolgendo un ruolo importante nella crescita dei neuriti (Presutti C et al., 2006). Gli oligodendrociti, le cellule della glia specializzate nel rivestimento degli assoni dei neuroni dell‟encefalo e del midollo spinale, originano da precursori in rapida proliferazione il cui processo di differenziazione è oggetto di molti studi. Recentemente sono stati pubblicati due lavori che hanno evidenziato un ruolo cruciale dei microRNA (miRNA) nella regolazione genica che, nel corso dello sviluppo, determina il destino di questi elementi gliali (Dugas J. C., et al. Dicer1 and miR-219 are requiered for normal oligodendrocyte differentiation and myelination. Neuron 65 (5), 597611, 2010; Zhao X., et al. MicroRNA-mediated control of oligodendrocyte differentiation. Neuron 65 (5), 612-626, 2010). Gli autori citati dimostrano che la neutralizzazione dei processi dipendenti dai miRNA negli oligodendrocyte precursor cell (OPC) mediante l‟inattivazione dell‟endoribonucleasi Dicer, impedisce lo sviluppo di oligodendrociti maturi e compromette la mielinizzazione del sistema nervoso centrale. Da questo, segue che i miRNA intervengono nella repressione post-trascrizionale di geni implicati nella proliferazione degli OPC, determinando l‟uscita dal ciclo delle forme immature e l‟entrata nella via dei processi maturativi. Dugas et al., hanno identificato tre miRNA che sono marcatamente sovra regolati negli OPC durante la differenziazione degli oligodendrociti nel topo: miR-219, miR-138 e miR-338. Fra questi, miR-219 ha dimostrato di essere necessario e sufficiente alla promozione della differenziazione dei precursori in cellule mature e, inoltre, in grado di compensare parzialmente gli effetti della delezione condizionale di Dicer. Dugas et al., hanno accertato che miR-219 ha come bersaglio l‟espressione di geni noti come promotori della proliferazione degli OPC (platelet-derived growth factor receptor-α) e inibitori della 19 differenziazione delle cellule della linea oligodendrogliale (SOX6). Inoltre, miR-219 agisce su fork-head box protein J3 and zinc finger protein 238, fattori di trascrizione che reprimono la differenziazione in oligodendrociti. A conferma di questi risultati, lo studio condotto da Zhao X (Neuron 2010) del Department of Developmental Biology and Kent Waldrep Foundation Center for Basic Neuroscience Research on Nerve Growth and Regeneration, University of Texas, ha riscontrato nel midollo spinale di topo che miR-219 e miR-338, all‟inizio della differenziazione oligodendrocitica, sono marcatamente sovra- regolati e che l‟espressione esogena di questi miRNA nel tubo neurale di pollo o nella corteccia di embrioni di topo promuoveva una prematura specificazione e differenziazione degli oligodendrociti. Gli stessi autori hanno poi rilevato negli embrioni di Danio rerio che il knockdown di miR-219 e miR338 endogeni blocca la maturazione di queste cellule gliali. Sono quindi stati determinati altri targets di miR-219 e miR-338: HES5, un altro fattore di trascrizione implicato nell‟inibizione della differenziazione oligodendrogliale e vari geni implicati nella differenziazione dei neuroni, quali il fattore di differenziazione neurogenica 1, ISL1 E OTX2. Questi studi hanno messo in rilievo un ruolo un ruolo generale dei micro RNA nello sviluppo degli oligodendrociti e identificando nuovi mediatori della differenziazione di queste cellule, ma suggeriscono anche la possibilità di un impiego terapeutico di questi piccoli acidi nucleici, per promuovere la riparazione della mielina del sistema nervoso centrale. Le nostre ricerche hanno dimostrato che nei pazienti AGS sussite un blocco del turnover dei miRNA che impedisce, tramite un meccanismo di feed back negativo, la fisiologica evoluzione della produzione dei microRNA che accompagna la maturazione neuronale (Pulliero et al., Mut Res., 2011). L‟espressione dei 3 miRNA indicati come neuroportettivi nei linfociti liquorali di pazienti AGS è risultata essere in controtendenza rispetto alla generale tendenza all‟accumulo di miRNa rispetto ai soggetti di controllo. Infatti, mir-138 è risultato invariato (AGS/Controlli 1.0), mir-338 moderatamente diminuito (AGS/Controlli 0.8), più marcatamente diminuita la espressione di mir-219 (AGS/Controlli 0.6) (Izzotti et al., unpublished data). E‟ apparso pertanto interessante verificare se la transfezione di mir-219 è in grado di proteggere le cellule neuronali dal danno indotto da linfociti AGS attivati da IFNa. Scopo di questa linea di ricerca è stato quindi quello di analizzare mediante modelli in vitro, l‟eventuale effetto di neuroprotezione utilizzando cellule di astrocitoma U87mg transfettate con mir-219 in co-coltura con linfociti AGS attivati con IFNa e linfociti di controllo. 20 Materiali e metodi Trasfezione di cellule atrocitiche U87MG con mir-219 Sono state utilizzate cellule di astrocitoma umano U87MG (Banca Cellule IST Genova) mantenute in coltura con terreno DMEM completo con 10% di FBS e 1% di Glutammina. Tali cellule crescono in adesione a 37°C con 5% di CO2. Le cellule U87MG sono state seminate in piastre da coltura da 24 pozzetti alla densità di 7x104 cellule/pozzetto in un volume di 500µl. Il giorno successivo, le cellule U87mg sono state transfettate utilizzando l‟agente trasfettante jetPRIME della Polyplus (Polyplus-transfection SA) con 0.5µl di un plasmide contenente OriGene pre-microRNA (60-70nt); ogni sequenza è stata amplificata e clonata in Origene pCMV6-Mir Vector. Dopo 4 ore dalla transfezione il terreno di coltura è stato cambiato con terreno fresco ed inseriti i cestelli con i linfociti AGS e i linfociti di controllo in un volume di 500µl. Le cellule in co-coltura con i linfociti AGS e di controllo, con e senza interferone alfa alla concentrazione di 2500U/ml (Sigma-aldrich) sono state monitorate nelle 72 ore per la durata della trasfezione. I linfociti AGS e di controllo, immortalizzati presso il laboratorio diretto della Prof.ssa E. Fazzi in collaborazione con la Dott.ssa S. Orcesi presso l‟IRCSS Mondino di Pavia, sono stati mantenuti in coltura con terreno RMPI completo con 20% FBS e 1% di glutammina (Fig. 20). Risultati La procedura di transfezione è riuscita a veicolare miR-219 all‟interno delle cellule astrocitiche, come dimostrato in microscopia mediante premarcatura con fluorocromo verde (GFP) della sonda stessa e microscopia a fluorescenza delle cellule transfettate (Fig. 21). Le conseguenze di tale transfezione sulle funzioni cellulari sono state valutate utilizzando diversi end points come di seguito descritto. Valutazione dell’efficienza di transfezione e della differenziazione cellulare mediante citofluorimetria L‟efficienza di trasfezione sulle cellule di astrocitoma U87MG trasfettate con mir-219 è stata valutata mediante citofluorimetria a flusso (FACS Canto, Beckton Dickinson) (Fig. 22). La sonda era marcata con flurocromo fluorescente GFP. Quale marcatore di differenziazione cellulare è stato utilizzato il recettore di membrana CCR5. Tale recettore è espresso selettivamente nelle cellule mature differenziate e on in quelle immature. L‟espressione del CCR5 sulle cellule U87MG è stata analizzata mediante citometria a flusso con anticorpo monoclonale Anti- Human CD 195 (CCR5) coniugato con ficoeritrina. 21 La Fig. 23 riporta la selezione (cell sorting) e la quantificazione delle cellule efficacemente transfettate con mir-219 rispetto alla popolazione totale. Dall‟analisi citofluorimetrica della popolazione cellulare U87MG è emerso che 1.4% delle cellule totali si è transfettata con mir219 dopo 48 h di trattamento. Sulle cellule transfettate si è visto il 15.4% della popolazione cellulare esprime il recettore chemochinico CCR5, mentre nella popolazione totale l‟espressione di tale recettore è pari a 0.2%. Tale recettore costituisce un importante marcatore di differenziamento cellulare. Pertanto il suo marcato aumento dopo transfezione (↑ 30.8 volte) indica che mir-219 è in grado di indurre differenziazione delle cellule astrocitiche senza interferire sulla loro crescita (vedi di seguito “analisi della proliferazione cellulare”). Valutazione e quantificazione della morte cellulare per apoptosi mediante citofluroimetria La valutazione dell‟apoptosi e della morte cellulare è stata condotta sulle cellule U87mg utilizzando il kit APC Annexin V e valutate al citofluorimetro. La colorazione con Annessina V è stata usata con un colorante vitale (7AAD) per discriminare le cellule pre-apoptotiche (7AAD neg, Annexin V pos), dalle cellule morte (7AAD pos, e Annexin V pos) e dalle cellule vive (7-AAD neg, e Annexin V neg). Un esempio della fluorescenza rilevata mediante microscopia ottica e citofluorimetria di flusso utilizzando questi traccianti è riportato in Fig. 24. I risultati ottenuti, riportati in Fig. 25, indicano che la vitalità cellulare è stata ridotta notevolmente, come già precedentemente dimostrato, dalla neurotossicità indotta da linfociti attivati con IFNa ed ancora maggiormente in presenza di linfociti patologici AGS. La transfezione com mir-219 non ha di persè alterato tale parametro. Le cellule astrocitiche transfettate com mir-219 (colonne blu) si sono rivelate più resistenti alla neurotossicità indotta da linfociti+IFNa soprattutto nel caso di linfociti AGS. Il principale meccanismo di morte cellulare indotto dal sistema linfociti+IFNa è risultato essere l‟apoptosi che aumento infatti in modo importante soprattutto in presenza di linfociti AGS+IFNa. La transfezione con mir-219 risulta molto protettiva nei confronti di questo specifico tipo di morte cellule soprattutto nel caso di neurotossicità indotta da linfociti AGS. Al fine di controllare la specificità dei risultati ottenuti è stato indotto nelle colture cellulare un meccanismo di morte cellulare aspecifica, la necrosi da deprivazione. Tale necrosi è stata indotta omettendo di sostituire il terreno nutrizionale per 48h. In tale situazione tutte le cellule indipendentemente dalle condizioni sperimentali hanno dimostrato n elevata mortalità. La transfezione con mir-219 non è risultata protettiva nei confronti di questo tipo di morte cellulare aspecifica per necrosi. 22 Pertanto la necrosi da deprivazione è un fenomeno di morte cellulare aspecifico indipendente dalla neurotossicità linfocitaria su cui mir-219 non ha effetto. Mir-219 è risultato protettivo specificatamente nei confronti della morte cellulare per apoptosi indotta dal meccanismo patogenetico dell‟AGS derivante dall‟attivazione di linfociti AGS mutati da parte dell‟IFNa. Valutazione della proliferazione cellulare mediante citofluorimetria La proliferazione della linea U87MG è stata monitorata utilizzando il colorante Cell Trace Violet (Invitrogen) mediante “dye dilution assay” in citometria a flusso, in quanto tale approccio permette di osservare la cinetica della divisione cellulare elaborando i dati citometrici con il software di analisi ModFIT. Questo sistema è utilizzato in-vitro ed in vivo per l'etichettatura delle cellule che nella divisione in cellule figlie vengono rintracciate in base alla diluizione del colorante fornito. L'eccitazione viola e blu di emissione del CellTrace Violet può essere utilizzato con una vasta gamma di fluorofori blu-eccitabile senza interferire con la fluorescenza emessa da cellule transfettate con sonde GFP. Le cellule U87MG proliferanti sono state monitorate nelle 48h successive alla transfezione con mir-219. La Fig. 26 mostra le cinetiche di proliferazione cellulare della popolazione di cellule U87MG in co-coltura con linfociti di controllo e AGS in assenza e presenza di transfezione con mir219. Risulta evidente un cospicuo rallentamento della crescita cellulare indotto da linfociti AGS+IFNa. Tale situazione di blocco viene rimossa dalla transfezione con mir-219 che ripristina la normale citodieresi cellulare. Conclusioni La transfezione con mir-219 appare in grado di indurre differenziazione astrocitaria senza alterare la proliferazione cellulare. Il ripristino della normale cinetica di proliferazione cellulare si accompagna ad un aumentato differenziamento e ad un‟incrementata maturazione astrocitica come dimostrato dall‟aumentata espressione di CCR5 nelle cellule transfettate. Tuttavia la percentuale di cellule transfettate rispetto alla popolazione totale risulta modesta e sono quindi necessari miglioramenti al metodo di transfezione prima di passare a possibili valutazioni in vivo. 23 Obiettivo 3. Inibizione dell’attivazione linfocitaria mediante RNA interference Base di partenza scientifica I risultati ottenuti dei nostri studi precedenti indicano che la sinergia dei linfociti con la mutazione TREX1 e l‟interferone alfa inibisce la crescita di cellule di neuroblastoma e inibisce l‟angiogenesi di cellule endoteliali in vitro (Izzotti et al., inviato per la pubblicazione). Questi effetti non sono stati rilevati utilizzando linfociti normali (TREX1 wild type). La catepsina D è stata riconosciuta dalla QPCR come mediatore principale prodotto dai linfociti mutati (TREX1) in grado di ridurre la crescita delle cellule di neuroblastoma. Mediante QPCR si è visto che l'espressione della catepsina D è raddoppiata in condizioni basali in linfociti AGS TREX1 mutati rispetto ai controlli. Inoltre, studi di RNA interfering confermano che la catepsina D ha un ruolo nella attivazione dell‟infiammazione. Si è visto che nel processo di attivazione della caspasi-1 e la successiva maturazione proteolitica della caspasi-3, l'apoptosi precede l'attivazione dei macrofagi che avevano riconosciuto RNA citoplasmatici (Rintahaka et al., Recognition of cytoplasmic RNA results in cathepsin- dependent inflammasome activation and apoptosis in human macrophages. Immunol. 2011 Mar 1;186(5):3085-92). Questi studi indicano che l'apoptosi innescata dalla stimolazione di dsRNA dovuta a infezione da virus è stata bloccata dalla inibizione della catepsina, sottolineando l'importanza della catepsine nella risposta immunitaria innata all'infezione virale). Il meccanismo della RNA interference (RNAi) consiste nella somministrazione di sonde oligonucleotidiche specifiche per un determinato RNA messaggero di cui si voglia annullare la traduzione a proteina. La sonda RNAi viene nel citoplasma degradata da specifiche nucleasi che convertono il segnale iniziale in frammenti di 21-23 nucleotidi denominati small interfering RNA (siRNA). Tali siRNA si legano all‟RNA messaggero bersaglio formando così un ibrido double strand RNA costituito dalla sonda inbiente (siRNA) e del massaggerro bersaglio (mRNA) dando luogo a un ibrido a doppia elica (dsRNA siRNA/mRNA). Il dsRNA formato è riconosciuto e degradato ad opera di specifiche ribonucleasi (e.g., argonauta2) contenute nel complesso effettore RISC (RNA-induced silencing comoplex). L‟applicazione di tale tecnologia di manipolazione genetica post-trascrizionale ha trovato recenti applicazioni nello sviluppo di terpie per malattie autoimmuni quali ad esempio il Lupus Erythmatosus Systemicus (LES). Sono stati fatti studi di terapia genica, creando un vaccino terapeutico mediante sperimentazione in vivo su topo dai colleghi immunologi del CEBR (Genova). Le molecole di Ig, contengono epitopi in grado di indurre risposte immunitarie cellule T-mediate. Lo scopo della ricerca era di verificare l‟ipotesi che le cellule 24 T che riconoscono una sequenza consenso Ig da parte delle cellule B, possano modulare la malattia nei topi lupus-patologici. (Ferrera et al., . Protection against renal disease in (NZB x NZW)F(1) lupus-prone mice after somatic B cell gene vaccination with anti-DNA immunoglobulin consensus peptide. Arthritis Rheum. 2007 Jun;56(6):1945-53). Questo studio ha dimostrato che è possibile riparare in vitro linfociti patologici LES reiniettandoli in vivo ed attenuando così in modo drastico il quadro patologico. Per quanto riguarda l‟attività noi sviluppato, scopo di questa linea di ricerca è stato dunque quello di verificare la possibilità di riparare in vitro linfociti AGS mediante RNAi. In particolare, sulla base di studi bioinformatica precedentemente attuati in collaborazione con il CNR (Dott. Patrizio Arrigo), si à deciso di silenziare l‟espressione linfocitaria della catepsina D. Tale gene infatti risulta quello maggiormente espresso in vivo nei linfociti liquorali di pazienti AGS (Izzotti et al., Brain Pathol., 2009). La catepsina D è una potente attività proapoptotica, neurotossica e demielinizzante se non adeguatamente inibita dall‟attività delle leucocistatine. Pertanto obiettivo di questa linea di ricerca è stato quello di silenziare la espressione di catepsina D nei linfociti AGS al fine di attenuare i processi apoptotici e citotossici indotti in presenza di IFN alfa nella co-coltura eterologa con astrociti U87MG. Materiali e metodi Mediante la tecnica della double –strand RNA interference è stato indotto un silenziamento post trascrizionale del gene della catepsina D, su linfociti AGS rispetto ai controlli, utilizzando un kit di silenziamento (Origene Trilencer-27 siRNA) dotato di tre oligonucleotidi specifici per la catepsina D. Le sequenze dei 3 oligo di silenziamento sono state disegnate e bioinformaticamente testate per (a) la loro efficienza di legarsi all‟RNA messaggero del gene della catepsinea D; (b) la loro specificità nei confronti di questo mRNA in assenza di cross reattività aspecifica con altri mRNA mediante BLAST genomico completo. Per tali procedure è stato utilizzato il software Beacon designer, Dopo tali analisi le sequenze interferenti identificate e quindi sperimentalmente utilizzate sono risultate essere le seguenti: - SR301070A AGACUCCAAGUAUUACAAGGGUUCT - SR301070B GCUCAAGAACUACAUGGACGCCCAG 25 - SR301070C CGCCAGCACAGAAACAGAGGAGAGT Al fine di verificare l‟avvenuta transfezione le sonde sono state marcata con proteina fluorescente GFP. Per aumentare l‟efficienza di transfezione, risultata piuttosto bassa nei precedenti esperimenti condotti per la transfezione di mir-219, è stato utilizzato un elettroporatore multi-pozzetto ad alta efficienza (Lonza 4D) (Fig. 27). Questa procedura permette l‟applicazione di un campo elettrico di bassa intensità che altera la permeabilità di membrana delle cellule facilitando così l‟ingresso nel citoplasma delle sonde oligonucleotidiche. Risulta cruciale in tali conduzioni modulare adeguatamente per intensità e durata l‟applicazione del campo elettrico al fine di massimizzare la penetrazione della sonda molecolare senza indurre effetti di sofferenza cellulare. L‟utilizzo di un elettroporatore multipozzetto ha permesso di analizzare contemporaneamente molteplici condizioni sperimentali identificando così rapidamente quella migliore per la transfezione di linfociti con sonda RNAi per catepsina D. Risultati E‟ stata condotta una prova di transfezione con sonda GFP su linfociti T sani isolati da sangue periferico. I risultati ottenuti sono riportati nella Fig. 28, che indica mediante microscopia a fluorescenza come la sonda sia stata efficacemente transfettata all‟interno delle cellule linfocitarie. L‟efficienza della transfezione in tali condizioni sperimentali è risultata essere pari al 28.0%. Tale percentuale da ritenersi estremamente elevata rispetto ai precedente esperimenti condotti senza elettroporazione che avevano realizzato efficienze di transfezione pari a 1.4% (mir-219 su astrociti) e 1.1% (linfociti inprove preliminari). Si è proceduto quindi ad effettuare la stessa procedura su linfociti immortalizzati AGS ottenendo performance di tansfezione analoghe (27.2%). E‟ stata quindi valutata la mediante qPCR l‟espressione della catepsina D sulla popolazione generale linfocitaria (transfettata + non transfettata) sottoposta alla procedura rispetto ad una analoga popolazione trattata solo con i reagenti di transfezione in assenza degli oligonucleotidi RNAi (controllo). La Fig. 29 riporta l‟intensità di espressione, valutata mediante qPCR, della catepsina D in linfociti di controllo e AGS attivati da IFNa (2.500 UI). La transfezione ha indotto silenziamento dopo 24h della catepsina D sia su linfociti AGS che di controllo. Utilizzando i tre oligonucleotidi forniti, la resa di efficienza di silenziamento non è particolarmente diversa tra i tre oligonueclotidi utilizzati. Comunque la maggiore inibizione è stata ottenuta con 26 l‟oligonucleotide a che ha permesso di ridurre al 31% l‟espressione della catepsina nei linfociti AGS stimolati con IFNa. La Fig. 30 riporta come i linfociti AGS+IFNa la cui espressione di catepsina D sia stata inibita mediante RNA interference abbiano una ridotta attività neurotossica rispetto ai linfociti AGS non transfettati Conclusioni I risultati ottenuti indicano come sia possibile inibire la sovra-produzione di catepsina D presente nei linfociti AGS attivati con IFNa mediante RNA interference. L‟entità di tale inibizione è rilevante e riporta a livelli parafisiologici l‟espressione di questo gene nei linfociti AGS. L‟elevata efficienza di transfezione permette di ipotizzare di trattare in vitro linfociti AGS e re-inocularli in vivo al fine di valutare l‟efficacia di questo approccio per attenuare il meccanismo patogenetico dell‟AGS. CONCLUSIONI GENERALI I lavoro di ricerca effettuato ha permesso quindi di sviluppare nuove strategie per la terapia e la prevenzione secondaria dell‟AGS. In particolare si sono identificate tre diverse strategie: (a) farmacologica; (b) neuro-protettiva; (c) di riparo genico) . L‟approccio farmacologico (a), ha identificato una combinazione di farmaci (EPO+SIF+TACR) efficace nell‟inibire in vitro i meccanismi patogenetici della malattia. I farmaci utilizzati sono tutti caratterizzati dall‟esistenza di una già concreta applicazione in clinica e pertanto possono già rappresentar una concreta opzione terapeutica. Tuttavia alcuni limitazioni dei risultati ottenuti non garantiscono a priori l‟efficacia clinica di questo approccio. In particolare la sperimentazione in vitro è stata effettuata su cellule immortalizzate, caratterizzate quindi da un prevalente fenotipo B anzichè T come invece verosimilmente accade in vivo nel liquor cerebro spinale dei soggetti affetti. Tuttavia allo stato attuale non è ancora stata effettuata una caratterizzazione citofluorimetrica in vivo delle cellule liquorali AGS responsabile della tipica linfocitosi IFNa associata. Tale analisi costituisce una priorità per eventuali studi futuri. Va però rilevato che i farmaci utilizzati (EPO+SIF+TACR) hanno bersagli indipendenti rispetto alla caratterizazione linfocitica T o B. Infatti EPO agisce su astrociti, neuroni e cellule vascolari endoteliali; SIF inibisce 27 specificatamente IFNa; TACR ha un‟azione specifica già dimostrata proprio sui linfociti T è pertanto è verosimile che il suo effetto inibitorio su tali linfociti sia ancora maggiore rispetto a quello rilevate nella sperimentazione qui presentata sui linfociti B. L‟approccio neuro-protettivo (b) è stato realizzato mediante transfezione con mir-219 in astrociti. Tale situazione modula lo specifico meccanismo patogenetico dell‟AGS costituito dal blocco della crescita e del differenziamento neuronale fisiologicamente realizzato dai microRNA e specificatamente bloccato in corso di AGS. La transfezione con mir-219 migliora sia la crescita che il differenziamento astrocitico e permette alle cellule neuronali di incrementare significativamente la propria resistenza alla neurotossicità indotta dai linfociti AGS in presenza di IFNa. Il limite principale della sperimentazione effettuata è la bassa efficienza di transfezione. Tuttavia tale limite appare risolvibile almeno in vitro dall‟utilizzo della metodica dell‟elettroporazione. Maggiori problemi potenziali sussistono invece per l‟applicazione di questo metodo in modelli sperimentali in vivo. Sarà quindi necessario nel corso di eventuali studi futuri condotti in modelli sperimentali animali utilizzare differenti vettori quali ad esempio vettori lenti virali defettivi o vettori a nano particelle. Sarà inoltre interessante verificare se altri micoRNA sono dotati di proprietà neuro protettive analoghe o superiori a quelle di mir-219 con l‟obiettivo finale di realizzare transfezioni combinate di microRNA in grado di rendere massimo l‟effetto neuroportettivo. L‟approccio di riparo genico (c) è stato realizzato inibendo mediante RNA interference l‟espressione della catepsina D in linfociti AGS attivati da IFNa. Tale approccio si è dimostrato molto potente nell‟attenuare la produzione di questa proteasi demielinizzante alla base del meccanismo patogenetico della neurotossicità dei linfociti AGS. L‟elevata efficienza di transfezione ottenuta mediante elettroporazione rende plausibile un eventuale sperimentazione in vivo basata sulla raccolta di linfociti AGS mutati, la loro riparazione mediante RNA interference con silenziamento della catepsina D, loro re-inoculazione in vivo. E‟ da notare come procedure simili siano già state proposte nel modello sperimentale animale per la terapia del LES e siano già utilizzate in clinica per la immunoterapia di tumori solidi in fase avanzata. Un limite generale dei risultati ottenuti è che la sperimentazione è stata, per ovvie ragioni logistiche stante la complessità delle ricerche effettuate, su linea cellulare immortalizzata prelevata da un solo paziente AGS (COD. NIMBI005, femmina in quanto matched con il controllo anch‟esso femmina). Pertanto resta ancora da valutare la risposte interindividuale in diversi pazienti AGS agli approcci terapeutici proposti . Appare pertanto opportuno valutare 28 in eventuali studi futuri se i risultati ottenuti sono riproducibili anche su diversi pazienti AGS caratterizzati da stato mutazionale AGS diverso. Va infine ricordato le tre strategie terapeutiche proposte sono rivolte al blocco dei meccanismi patogenetici priori della fase acuta dell‟AGS caratterizzata da linfocitosi liquorale, ipersecrezione di IFNa e insorgenza del danno neurologico. Perché tali approcci possano quindi essere efficace devono essere realizzati precocemente nel corso della storia clinica della malattia al fine di attenuare l‟instaurarsi del danno neurologico. Non sembra invece possibile allo stato attuale delle conoscenze recuperare il danno neurologico dopo che si è instaurato. In conclusione quindi l‟attività di ricerca svolta ha identificato strategie terapeutiche e preventive che appaiono di un certo interesse per il controllo dell‟AGS. Tali strategie sono tra loro complementari ed è possibile pensare alla loro applicazione contemporanea al fine di ottimizzare l‟effetto terapeutico. I risultati ottenuti vanno validati in modelli sperimentali animali in vivo e in situazioni ex vivo su cellule raccolte da diversi pazienti al fine di confermarne la validità sperimentale e la potenziale applicazione cinica. 29 STATO DELLE PUBBLICAZIONI SCIENTIFICHE La produzione di articoli scientifici da pubblicare su riviste impattate internazionali costituisce il prodotto finale del presente progetto. L‟attività di ricerca è volta alla produzione dei seguenti articoli. In parentesi è riportato la stato di avanzamento del lavoro: 1: Different mutations in TREX1 and RNaseH2 genes affect clinical features in AicardiGoutières Syndrome Alberto Izzotti, Mariagrazia Longobardi, Cristina Cartiglia, Francesco Anzuini, Patrizio Arrigo, Elisa Fazzi, Simona Orcesi, Roberta La Piana, Alessandra Pulliero Status: Submitted to Journal of Child Nurology. major revisions requested. 2. Anti-angiogenic and neurotoxic properties of AGS mutated lymphocytes. Izzotti A., Marenco B., Domenicotti., Cantoni, Travaini G., Pulliero A. Status: Submitted to the European Journal of Cancer. Submitted by the Editor for external referees‟ evaluation. 3. The Aicardi-Goutières Syndrome. Molecular and clinical features of RNAse deficiency and microRNA overload Pulliero A, Fazzi E, Cartiglia C., Orcesi S., Balottin U., Uggetti C., La Piana R., Olivieri I., Galli J, Izzotti A. Status: Mutat. Res., 2011. In stampa. 4. Pre-clinical development of a multidrug therapeutic strategy for the AicardiGoutièeres Syndrome. Izzotti A., La Maestra S., Fazzi E., Orcesi S., Micale R., Pulliero A., Anzuini F. Status: Fase sperimentale conclusa. Manoscritto in preparazione. 5. Prevention neurotoxic effects of AGS-mutated lymphocytes by microRNA delivery in astrocytes. Pulliero A., Fenoglio D., Parodi A, Fazzi E., Orcesi S., Izzotti A. Status: Fase sperimentale conclusa. Manoscritto in preparazione. 6. Inhibition of de-myelinizing properties of AGS lymphocytes by cathepsin D silencing. Pulliero A., Fenoglio D., Parodi A, Cartiglia C., Longobardi M., Fazzi E., Orcesi S., Izzotti A. Status: Fase sperimentale conclusa. Manoscritto in preparazione. 30 ATTIVITÀ CONGRESSUALE INTERNAZIONALE Sono indicati i congressi a cui il responsabile del progetto Prof. Alberto Izzotti ha presentato i risultati prodotti dall’attività di ricerca supporta dalla IAGSA menzionando specificatamente il suo ruolo di supporto. - 10th International World Conference on Environmental Mutagenesis. Firenze, 20-25 agosto 2009 (Relatore e Chairman) - 4th Academic congress of International Chinese Neurological Sciences, Chengdu, Cina, 18-20 giugno 2010 (Relatore) - Int. Conf. On Mechanisms of Anticarcinogenesis and Anticarcinogenesis. Guarujà, Sao Paulo (Brasile), 26-29 settembre 2010 (Relatore) - Epidemiologia e prevenzione delle malattie cronico-degenerative. Università di Siena, 26 novembre 2010 (Relatore) E‟ stata inoltre curata in qualità di relatore dal responsabile del progetto la seguente tesi sperimentale per il conseguimento del titolo di dottore di ricerca: - Il danno indotto da interferone alfa nel sistema nervoso centrale. IL modello della Sindrome di Aicardi-Goutieres. (Tesi di Dottorato di Ricerca della Dott.ssa Mariagrazia Longobardi nell‟ a.a. 2009/10). Con questa tesi la Dottssa Longobardi ha ricevuto il premio quale migliore giovane ricercatrice nel 2009 dalla Società Italiana di Mutagenesi Ambientale essendo quindi stata invitata a presentare tale relazione al 10th International World Conference on Environmental Mutagenesis. (Firenze, 20-25 agosto 2009). 31 PERSONALE COINVOLTO NELLA RICERCA (UNIVERSITA’ DI GENOVA) Prof. Alberto Izzotti (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott.ssa Alessandra Pulliero (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott. Patrizio Arrigo CNR (Istituto per lo studio delle macromolecole, Centro Nazionale Ricerche, Genova) Dott.ssa Cristina Cartiglia (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott.ssa Maria Grazia Longobardi (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott.ssa Patrizia Larghero (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott.ssa Giorgia Travaini (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott.ssa Barbara Marenco (Dipartimento di Medicina Sperimentale, Università di Genova) Dott. Sebastiano La Maestra (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott.ssa Rosanna Micale (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova) Dott.ssa Cinzia Domenicotti (Dipartimento di Medicina Sperimentale, Università di Genova) Dott.ssa Daniela Fenoglio Centro di Eccellenza Ricerche Biologia Molecolare Università di Genova, CEBR) Alessia Parodi (Centro di Eccellenza Ricerche Biologia Molecolare Università di Genova, CEBR) Francesco Anzuini (Dipartimento di Scienze della Salute, Università di Genova)
