Titolo del progetto:
Variabilità fenotipica nella sindrome di Klinefelter dell'età adulta: il ruolo dei polimorfismi genetici nel
potenziale spermatogenetico
Stato dell’arte: Una caratteristica tipica dei soggetti con KS è la grave compromissione della
spermatogenesi (nella maggior parte dei casi azoospermia), con un fenotipo testicolare variabile dalla
Sindrome a Sole Cellule di Sertoli all’ipospermatogenesi.E’ probabile che la combinazione di polimorfismi
capaci di influenzare la produzione di spermatozoi possa contribuire alla variabilità del fenotipo testicolare
e seminale dei soggetti affetti dalla sindrome. Diversi polimorfismi sono stati descritti come potenziali
regolatori dell’efficienza della spermatogenesi e tra questi quelli più promettenti sono i “CAG repeats” del
gene del recettore androgenico (AR), i “TA repeats” del gene del recettore estrogenico (ESR1), la
delezione “gr/gr” del cromosoma Y e il numero di copie del gene TSPY1. Il ruolo cruciale degli androgeni
e degli estrogeni nella regolazione endocrina della spermatogenesi è ben nota, quindi non è sorprendente
che i polimorfismi nei loro recettori possano modulare l’efficienza della spermatogenesi.
Obiettivo: chiarire la correlazione genotipo-fenotipo dei soggetti con sindrome di Klinefelter (KS) e
determinare il ruolo del background genetico nella variabilità fenotipica che si osserva a livello testicolare
Scopi specifici: Caratterizzazione accurata dei soggetti con KS dal punto di vista clinico, e valutazione di
tre polimorfismi con effetto accertato sull’efficienza della spermatogenesi (delezione gr/gr, numero di
copie del gene TSPY1, ripetizioni (TA)n del ESR1.
Descrizione del progetto: Analisi di polimorfismi con accertato effetto sulla spermatogenesi. lo scopo è
di comprendere se i polimorfismi che influenzano il potenziale spermatogenetico ((TA)n del ESR1, la
delezione “gr/gr” del cromosoma Y e il numero di copie del gene TSPY1) possono spiegare l’eterogeneità
del fenotipo testicolare e seminale.
Le analisi molecolari comprenderanno:
1) ANALISI DELLE DELEZIONI AZF E “gr/gr” DEL CROMOSOMA Y
La procedura per lo screening delle delezioni AZF del cromosoma Y comprende due fasi: 1) analisi di
routine per le microdelezioni descritta nelle linee guida EAA (Simoni et al. 2004) utilizzando 10 markers
(STS); 2) screening per le delezioni gene-specifiche per i geni situati nelle tre regioni AZF: DBY, USP9Y
(per quest’ultimo due esoni); HSFY, eIF-1AY; BPY2, CDY1 (Krausz et al. 1999; Krausz et al. 2001). In
caso di delezioni parziali AZF (AZFa, AZFb) o di delezioni di singoli geni saranno disegnati primers
appropriati in base alla localizzazione della delezione. Infine sarà eseguito il sequenziamento diretto per
definire l’esatto punto di rottura. La mappatura fine delle delezioni parziali o gene-specifiche sarà
effettuata anche per i pazienti provenienti alle altre Unità partecipanti.Tutti i soggetti reclutati saranno
inoltre sottoposti allo screening per le delezioni “gr/gr” (delezione parziale della regione AZFc) usando 8
STSs originariamente descritti da Repping et al. (2003): sY1291, sY1191, sY1161, sY1206, sY1201,
sY142, sY1258, sY1197. La delezione “gr/gr” è caratterizzata dai seguenti risultati: sY1291 assente;
sY1191, sY1161, sY1206, sY1201, sY142, sY1258, sY1197 tutti presenti. Le condizioni di PCR sono
descritte nel lavoro di Repping et al. (2003) e Machev et al. (2004). Dato che riarrangiamenti o
polimorfismi della regione AZFc possono essere responsabili di “false delezioni”, l’analisi quantitativa
(dosaggio) e qualitativa delle copie geniche di DAZ e di CDY1 risulta di fondamentale importanza per
confermare le delezioni identificate con il metodo STS plus/minus ed evitare quindi falsi positivi.
2) ANALISI DEL NUMERO DI COPIE DEL GENE TSPY1
L’analisi verrà effettuata con la metodica PCR Real Time descritta da Giachini et al. 2009 che prevede la
quantificazione relativa del numero di copie TSPY1, utilizzando come locus di controllo una regione del
gene PMP22 (singola copia). Il numero assoluto di copie geniche TSPY1 viene poi determinato utilizzando
come riferimento campioni di DNA con numero di copie noto ottenuto misurando la lunghezza del
frammento di ibridazione XbaI mediante analisi su gel in campo pulsato (Mathias et al., 1994; Oakey and
Tyler-Smith, 1990). Per l’analisi statistica sarà utilizzato il cut-off di 33 copie per la suddivisione della
casistica in due gruppi per successivi confronti.
3) ANALISI DEL (TA)n DEL GENE ESR1
L’analisi del numero di ripetizioni TA sarà effettuata in base al metodo descritto da Guarducci et al.
(2006) utilizzando il sequenziatore automatico (ABI Prism® 310 PE) e il software GeneScan. Come
nell’articolo di Guarducci et al. (2006) gli alleli verranno classificati in 3 gruppi sulla base della lunghezza
del numero di ripetizioni TA: H (TA sopra 20), M (TA compreso tra 15e 20), L (TA inferiore a 15). Le sei
possibili combinazioni alleliche verranno poi raggruppate in due “genotipi” principali – genotipo A (HH e
HM) e genotipo B (HL, MM, LM e LL) – che secondo i dati preliminari conferiscono effetti differenti
sull’efficienza della spermatogenesi. La popolazione di studio sarà quindi suddivisa sulla base del
“genotipo” per ulteriori confronti.
4) ANALISI STATISTICA
L’elaborazione dei dati e l’analisi statistica sarà fatta utilizzando il pacchetto statistico SPSS per Windows
(versione 17.0, SPSS Inc. Chicago, Il. USA).
Risultati attesi: Una maggiore conoscenza delle variazioni fenotipiche di questa sindrome, con
particolare attenzione all’efficienza della spermatogenesi.
