TITOLO ASSEGNO DI RICERCA:
Studio dei profili di metilazione e di microRNA in cellule di neoplasie
mieloproliferative
SOMMARIO. Oltre alla via di JAK/STAT, molte altre vie di segnalazione risultano
deregolate nelle neoplasie mieloproliferative croniche. Tali vie giocano un ruolo chiave
nella proliferazione e sopravvivenza cellulare, incluse alterazioni di natura epigenetica. Lo
scopo del progetto sarà quello di indagare sul contributo delle alterazioni epigenetiche
nella patogenesi delle neoplasie mieloproliferative croniche con lo scopo di fornire i
presupposti per l’utilizzo combinato di questi farmaci nel trattamento di queste patologie.
Le Neoplasie Mieloproliferative Croniche (MPN) sono un gruppo di disordini
ematologici che originano dalla trasformazione neoplastica di una cellula staminale
pluripotente, e sono caratterizzate dalla proliferazione clonale di uno o più progenitori
emopoietici nel midollo osseo e in sedi extramidollari. La WHO (World Health
Organization) ha incluso in questo gruppo di patologie la Policitemia Vera (PV), la
Mielofibrosi Primaria (PMF) e la Trombocitemia Essenziale (TE). La patogenesi
molecolare delle MPN è associata ad alterazioni genetiche ricorrenti, le più frequenti delle
quali sono la mutazione V617F nell’esone 14 del gene JAK2, mutazioni dell’esone 12 del
gene JAK2 e del codone 515 del gene MPL. Sono poi state riportate anche mutazioni
meno frequenti nei geni TET2, ASXL1, IDH1/IDH2, CBL, LNK, IKZF1 ed EZH2 (Ernst T,
2010). Tali anomalie sono associate ad una costitutiva attivazione della via JAK/STAT e
contribuiscono ad una ipersensibilità alle citochine, e inoltre agiscono a livelo della
regolazione epigenetica di molti geni che, come oncogeni o geni onco-protettori, sono
cruciali per l’instaurarsi di un fenotipo tumorale (Guertin DA, 2007). Recenti studi nel
nostro laboratorio hanno dimostrato (Vannucchi AM et al, Leukemia 2013) che la presenza
di anche uno solo di geni della regolazione epigenetica (EZH2, ASXL1, IDH1/2) o dello
spliceasoma (SRSF2) permettono di identificare una categoria di apzienti con mielofibrosi
a più alto rischio di morte precoce e di trasformazione leucemica, rafforzando pertanto al
convinzione che queste anomalie siano fondamentali nella patogenesi e nella
progressione delle malattie mieloproliferative. La disponibilità di farmaci che sono attivi
nela modificazione del livello di acetilazione degli istoni HDAC, inbitori delle istone
deacetilasi) e/o del livello di metilazione del DNA (azacitidina, decitabina) rendono queste
anomalie cellulari acquisite potenzialmente bersaglio di una terapia mirata, come suggerito
anche dai risultati con alcu8ni di questi farmaci (Givinostat, un HDACi) già pubblicati dal
nostro gruppo (Rambaldi A et al, BJH 2011; G Finazzi
et al,
2013) o in corso di
svolgimento.
Infine, abbiamo ottenuto il profilo di espressione di microRNA mediante NGS con
tecnologia Illumina di 4 pazienti con mielofibrosi, utilizzando cellule CD34+ altamente
purificate da sangue periferico. L’analisi bioinformatica, condotta in collaborazione con il
gruppo di Bioinformatica della Università di padova, è risultata nela descrizione di una lista
di microRNA differenzialmente espressi, che intendiamo quindi validare anch’essa
funzionalmente e in popolazione di pazienti.
Recentemente abbiamo prodotto un’analisi mediante Met-Aray del profilo di
metilazione in 5 campioni di cellule CD34+ ottenute da pazienti con mielofibrosi primaria
sia dal sangue periferico che dalle milze ottenute dopo splenectomia. Le cellule CD34+
sono state purificate e quindi sottoposte da analisi mediante array, seguita da una
valutazione bioinformatica. Questa, dopo una serie di accurati filtering e selezione dei geni
differenzialmente metilati, ci ha permesso di ottenere un profilo di geni differenzialmente
metilati, sia nelle regioni CpG che anche in intergeniche e intergeniche, che rappresentano
un punto di partenza per gli esperimenti successivi, oggetto del presente progetto di
ricerca.
Lo scopo primario del progetto è quello di validare, in più ampia casisitica di
pazienti, le anomalie di metilazione descritte nello studio di Meth—array e di validarne la
possibile funzione utilizzando diversi modelli cellulari e anche animali, in uno stadio
successivo qualora i primi risultati ottenuti nei modelli cellulari e nei apzienti abbiamo dati
apprezzabili segnali.
Infine, abbiamo ottenuto il profilo di espressione di microRNA mediante NGS con
tecnologia Illumina di 4 pazienti con mielofibrosi, utilizzando cellule CD34+ altamente
purificate da sangue periferico. L’analisi bioinformatica, condotta in collaborazione con il
gruppo di Bioinformatica della Università di padova, è risultata nela descrizione di una lista
di microRNA differenzialmente espressi, che intendiamo quindi validare anch’essa
funzionalmente e in popolazione di pazienti.
Saranno utilizzate linee cellulari di MPN umane e murine, recanti la mutazione
JAK2V617F o JAK2WT. Inoltre verranno isolate ed utilizzate cellule primarie provenienti
da pazienti affetti da MPN. Per valutare la vitalità delle cellule esprimenti mutazioni diverse
sarà utilizzato il test do proliferazione WST1. La sopravvivenza cellulare sarà determinata
tramite valutazione citofluorimetrica utilizzando la marcatura con annessinaV e ioduro di
propidio. L’analisi del ciclo cellulare verrà effettuata con tecnica citofluorimetrica in seguito
ad una marcatura con ioduro di propidio. Per i test clonogenici linee cellulari verranno
piastrate su agar in presenza delle diverse concentrazioni di farmaci e valutate dopo 7
giorni. Per i test clonogenici di progenitori ematopoietici verranno utilizzate cellule
mononucleate isolate da pazienti affetti da MPM e soggetti di controllo e piastrate su
metilcellulosa supplementata con citochine per la crescita di BFU-E e CFU-GM, su
metilcellulosa senza aggiunta di EPO per la crescita di EEC. Per la crescita di CFU-MK,
CD34+ verranno seminate nel mezzo Megacult con l’aggiunta di lipidi e collageno
supplementato da citochine . Le colonie saranno contate dopo 14 giorni. Per effettuare la
genotipizzazione di singole colonie recanti mutazioni in uno dei geni epigenetici verrà
utilizzata una PCR allele specifica. I risultati ottenuti in vitro verranno essere
eventualmente validati con due modelli in vivo: il modello SCID BaF3 JAK2V617F-Luc+ ed
il modello C57Bl6/J JAK2V617F KI: il primo è generato in seguito all’inoculo intravenoso in
un topo SCID di cellule leucemiche murine proB BaF3 esprimenti la mutazione
JAK2V617F e l’enzima luciferasi; Questo modello sarà utilizzato per valutare l’impatto di
mutazioni target, prodotte mediante mutagenesi specifica in cellule Ba/F3 JAK2 mutate e
wt, sulla aggressività di malattia grazie ad un imaging in vivo sfruttando la capacita
dell’enzima luciferasi di generare un segnale bioluminescente tramite la sua azione
catabolica sulla d-luciferina; l’intensità del segnale bioluminescente sarà proprorzionale al
burden leucemico. L’altro modello murino è generato con l’inserzione del genoma murino
della sequenza invertita JAK2V617F mutata che sarà attivata in seguito al mating con un
topo transgenico VavCre esprimente la ricombinasi Cre sotto il controllo del promotore
Vav nel tessuto ematopoietico ed endoteliale. La progenie sarà eterozigote V617F e
svilupperà una MPN dalla nascita con i sintomi caratteristici come un alto ematocrito, alte
piastrine e conta di globuli bianchi, splenomegalia e fibrosi midollare. In questo modello
valuteremo lo stato di altera regolazione epigenetica di geni target con lo scopo di
esplorare eventuali correlazioni tra lo stato mutazionale di JAK2 e lo stato di
metilazione/espressione (mediante RT-QPCR e/o gene expression arays) di geni
bersaglio selezionati.
Infine, ci proponiamo di validare, in almeno 50 pazienti con mielfoibrosi e profilo
mutazione predefinito, alcune delle alterazioni a livello di metilazione del DNA descritte nei
meth-aray, utilizzando la tecnica del bisulfito e la sequenza mediante NGS con l’approccio
IonTorrent/PGM.
Un approccio analogo sarà seguito per quanto riguarda la validazione di microRNA
differenzialmente espressi.
Lo studio ha come scopo quello di incrementare le conoscenze sulle anomalie indotte
dalla presenza di geni epigenetici mutati nelle neoplasie mieloproliferative croniche e le
possibili implicazioni terapeutiche.
Prof. A.M. Vannucchi
