Progetto di ricerca per il bando di Ricercatore a tempo determinato:
“Alterazioni molecolari e bersagli terapeutici nelle neoplasie mieloproliferative croniche”
Descrizione del progetto e del suo potenziale impatto scientifico. Le neoplasie mieloproliferative
croniche (MPN) includono disordini, quali policitemia vera (PV), trombocitemia essenziale (ET) e
mielofibrosi primaria (PMF), che originano dalla incontrollata proliferazione di un clone
emopoietico che determina una produzione esagerata di cellule mature del sangue (1) (2). Si tratta
di patologie croniche, relativamente frequenti; l’aspettativa di vita è di poco ridotta rispetto alla
popolazione di controllo nella PV e ET, ma fortemente accorciata (mediana, 5 anni) nella PMF. Il
decorso è gravato da varie complicazioni, soprattutto di tipo trombo-embolico ed emorragico, e
nelle forme più avanzate vi è una compromissione sistemica che riduce la qualità di vita; possono
culminare, in una proporzione variabile, in leucemia acuta, resistente ai trattamenti correnti,
eventualmente attraverso una fase di mielofibrosi post-PV o post-ET. La terapia attuale è palliativa,
volta al controllo dei sintomi, alla prevenzione delle complicanze, ma non induce remissione
clonale né previene la comparsa della trasformazione leucemica. Il trapianto di cellule staminali
emopoietiche è potenzialmente curativo, ma è riservato ad una minoranza di pazienti. Questo
settore della ematologia, largamente trascurato, ha ricevuto un impulso straordinario a seguito della
scoperta, nel 2005, della mutazione V617F nel gene JAK2, che si riscontra nel 95% almeno delle
PV e in circa il 60% delle ET e PMF. Questa scoperta ha focalizzato l’attenzione sulla via di
segnale JAK/STAT, ed è stata seguita dall’identificazione di altre mutazioni sia in geni connessi a
questa stessa via (MPL, Lnk) sia in oncogeni (TET2, CBL, IDH1, IDH2 e EZH2) il cui significato
funzionale è ancora da definire (3). La scoperta di queste anomalie molecolari ha rappresentato un
importante avanzamento nelle conoscenze circa la patogenesi di queste malattie(4), il loro
inquadramento diagnostico, e il potenziale impiego di nuovi farmaci e/o una rivisitazione di farmaci
già da tempo in uso (5). Peraltro, rimangono ancora aspetti non ben caratterizzati circa la (le)
lesion(i) molecolari di base, le eventuali anomalie aggiuntive che sono responsabili della evoluzione
delle malattie fino alla trasformazione leucemica, e i meccanismi attraverso i quali queste lesioni
molecolari condizionano lo sviluppo e il fenotipo clinico. Una migliore comprensione di questi
aspetti potrebbe aiutare nella identificazione di nuovi bersagli terapeutici, nuovi farmaci
potenzialmente attivi, e/o nel migliorare l’uso di farmaci già disponibili, eventualmente in
combinazione. La opportunità di procedere in queste direzioni è sostenuta dalla osservazione che i
farmaci anti-JAK2 sviluppati negli ultimi anni hanno un importante effetto clinico, ma non incidono
significativamente sul clone patologico né certamente sono in grado di colpire con efficacia la
cellula staminale neoplastica.
Principali punti del programma:
1. Identificazione e caratterizzazione di nuove mutazioni somatiche nelle MPN. L’obiettivo di
questi studi è di identificare regioni del genoma caratterizzate da variazione del numero di copie di
geni per delezione o incremento (copy number variation,CNV) e da perdita di eterozigosità (LOH),
mediante tecnologia SNP ARRAY con piattaforma Affimetrix. Verrà analizzato il DNA estratto da
cellule CD34+, immunoselezionate dal midollo o sangue periferico, confrontato con il DNA
germinale (buccale o da T-linfociti). Da nostri dati preliminari è emerso che mentre le regioni di
CNV sono relativamente infrequenti esistono diverse regioni di LOH “non-private” che potrebbero
contenere geni “putativi” di potenziale interesse patogenetico. Ci proponiamo pertanto di sottoporre
ad analisi SNP almeno 50 casi di ciascuna delle tre MPN, oltre ad almeno 50 casi di evoluzione
mielofibrotica post-PV/post-ET, e casi di trasformazione leucemica con disponibilità di campioni
seriali nella fase cronica e acuta di malattia. Sulle regioni di CNV o LOH individuate si procederà
ad analisi per determinare il livello di espressione di geni putativi deleti o potenzialmente iperespressi, mediante real-time PCR, e per ricercare mutazioni puntiformi, sia con approccio di
sequenza diretto nel caso di geni putativi sia con tecnologia di deep-sequencing nel caso di regioni
1 più complesse. Le alterazioni eventualmente confermate saranno validate su una più ampia casistica
di pazienti con MPN, e si ricercheranno le correlazioni clinico-diagnostiche. Di particolare interesse
potrebbe risultare l’eventuale identificazione di lesioni acquisite nel passaggio dalla fase cronica
alla fase leucemica; in tal caso lo studio di validazione comprenderà anche soggetti con leucosi
primaria e secondaria ad altre patologie o terapia. Una volta identificate una o più regioni geniche
con anomalie somatiche acquisite si procederà alla caratterizzazione funzionale delle proteine
mutate attraverso iperespressione/down-regolazione delle sequenze mutate in linee e in cellule
primarie da pazienti con MPN mediante saggi clonogenici, di differenziazione e apoptosi, analisi
delle vie di segnalazione e del profilo di espressione genico. Per uno uno-due geni ritenuti di
particolare di interesse verranno eseguiti esperimenti di trapianto in modelli murini per la
caratterizzazione del fenotipo risultante. Risultati attesi: identificazione di regioni geniche con
anomalie di sequenza, loro caratterizzazione funzionale, e definizione del loro impatto diagnosticoclinico, e di potenziale bersaglio terapeutico. Sviluppo temporale: mesi 1-36.
2. Definizione del profilo di espressione genica (geni codificanti e microRNA) nei progenitori
emopoietici delle MPN. L’obiettivo di questi studi è di definire il profilo di espressione genica dei
geni codificanti e dei microRNA in progenitori emopoietici CD34+ di pazienti con MPN, con la
finalità di identificare un network di vie di segnalazione la cui alterazione potrebbe rappresentare un
valido bersaglio terapeutico. Utilizzeremo un set di campioni come descritto per gli esperimenti di
cui al punto precedente. Questi studi verranno effettuati in cellule CD34+ purificate tramite
immunoselezione, e sulla frazione blastica nel caso delle trasformazioni leucemiche. Il profilo di
espressione genica (GEP) verrà determinato utilizzando una piattaforma Affimetrix e il chip HGU133 plus 2.0, con procedure già utilizzate (6). L’analisi bioinformatica verrà effettuata con R
Bioconductor e Partek Genomic Suite. Lo studio di espressione dei microRNA verrà condotto
utilizzando il sistema TaqMan Human MicroRNA Array v3.0. L’analisi dei dati verrà effettuata
utilizzando diversi software di predizione dei target (PITA, Miranda, TargetScan, etc) e di
integrazione. Il passo successivo consisterà nell’analisi integrata delle pathways identificate
dall’analisi di espressione per identificare ulteriori circuiti di regolazione ed una loro eventuale
alterazione. Dalla lista di geni e di microRNA espressi in maniera anomala rispetto ad una
popolazione di soggetti sani di controllo, si identificherà un subset di geni che, in base al livello di
espressione differenziale e/o alla funzione, verrà validato mediante metodiche di real-time PCR in
una più ampia casistica di pazienti. Risultati attesi: Identificazione di geni codificanti e microRNA
espressi in maniera anomala che rappresentino potenziali bersagli per la terapia. Sviluppo
temporale: mesi 1-48.
3. Validazione di nuovi bersagli terapeutici e caratterizzazione del meccanismo d’azione dei
farmaci. L’obiettivo di questi studi è duplice: da un lato, validare funzionalmente i possibili
bersagli terapeutici identificati dalle analisi mutazionali e di espressione sopra descritte; dall’altro,
definire i punti di azione di farmaci innovativi che sono in corso di impiego clinico, da soli o in
combinazione con altri. Nel primo caso, si valuterà in sistemi appropriati di coltura l’effetto di
molecole inibenti bersagli putativi, che siano già disponibili (piccole molecole inibitrici; anticorpi)
o sintetizzate custom (siRNA, shRNA) valutandone l’effetto sulla proliferazione, apoptosi,
differenziazione cellulare, ed espressione genica/microRNA. Nel secondo caso, verranno utilizzati
farmaci che abbiano già dimostrato attività clinica nelle NPM per valutare, con approccio di
espressione genica/microRNA globale, nuovi meccanismi di azione non ancora conosciuti. La(e)
molecola(e) che, da sola o in combinazione, abbiano dimostrato gli effetti più significativi, verranno
saggiate in vivo utilizzando un modello murino di animali con espressione inducibile di
JAK2V617F (KI) nelle cellule emopoietiche. Si indagheranno gli effetti ematologici, si valideranno
i bersagli terapeutici, e si effettueranno studi di espressione genica per identificare modificazioni
complesse risultanti in vivo dal trattamento con tali farmaci Risultati attesi: identificazione di nuovi
farmaci e definizione dei bersagli terapeutici. Sviluppo temporale: mesi 12-48.
2
