" Studio mutazionale di geni coinvolti nel controllo epigenetico dell'espressione genica e
correlazioni genotipo-fenotipo in pazienti affetti da neoplasie mieloproliferative croniche
Ph-negative"
INTRODUZIONE
Con il termine “neoplasie mieloproliferative croniche (MPN) Ph-negative" vengono identificate un
gruppo di patologie ematologiche, relativamente frequenti nella popolazione che originano da una
alterazione neoplastica di una cellula staminale pluripotente con conseguente proliferazione clonale
di uno o più progenitori cellulari ematopoietici sia a livello midollare che extramidollare. Le neoplasie
mieloproliferative croniche comprendono oltre ai disordini definiti "non classici", quelli "classici"
quali la policitemia vera, la trombocitemia essenziale e la mielofibrosi primaria. La Policitemia vera è
sostenuta da un’iperplasia generalizzata del midollo osseo con espansione prevalente della linea
eritroide che è in larga parte indipendente dal fattore di crescita fisiologico, l’eritropoietina (EPO). La
Trombocitemia
Essenziale
(TE),
invece,
è
caratterizzata
da
un'abnorme
proliferazione
megacariocitaria che determina un aumento del numero di piastrine circolanti. La mielofibrosi,
infine, può presentarsi non solo come patologia “de novo” (e in questo caso è detta primaria, PMF)
ma anche come evoluzione di una MPN
precedentemente diagnosticata, sia che si tratti di
policitemia vera che di trombocitemia essenziale (Mesa et al., 2007) e, come tale, viene definita
mielofibrosi secondaria post-PV (PPV-MF) o post-ET (PET-MF). In entrambi i casi, si caratterizza per la
presenza di fibrosi del midollo osseo, citopenia, anisopoichilocitosi, incremento della densità
microvascolare
del
midollo
osseo,
ematopoiesi
extramidollare
con
splenomegalia
leucoeritroblastosi nel sangue (Vardiman et al., 2009; Hoffman et al., 2005; Barosi et al., 2003).
Lo studio della patogenesi molecolare di questi disordini ha portato nel 2005 a dimostrare la
presenza, nei pazienti con PV, TE e MF (Levine et al,2005) della mutazione “gain of function”
V617F a livello dell'esone 14 del gene codificante la tirosina chinasi citosolica Janus Kinase 2
(Levine et al., 2005; James et al., 2005; Kralovics et al., 2005; Baxter et al., 2005) attivata
normalmente a seguito del legame di un fattore di crescita (es. Epo, IL-3 ) al proprio recettore. Tale
mutazione porta ad una attivazione costitutiva della via di segnalazione JAK/STAT e dunque ad
una alterazione dell' espressione dei geni
regolati da quest' ultima. La mutazione ha una
frequenza di oltre il 95% nelle PV, del 50% in media tra le TE e PMF. Nel 2007, sono state descritte
anche una serie di mutazioni dell’esone 12
in pazienti JAK2V617F negativi con PV in cui
l’eritrocitosi era il fattore dominante (Scott et al., 2007). Dopo la dimostrazione dell’associazione
tra la mutazione JAK2V617F e la MPN Ph-negative, sono state scoperte altre mutazioni “gain of
e
function” a livello, però, del gene codificante il recettore per la trombopoietina MPL: MPLW515L,
(presente in pazienti affetti da PMF ma JAK2V617F negativi (Pikman et al., 2006)) e MPLW515K; la
prevalenza di entrambe è stata stimata approssimativamente attorno al 5% per PMF e all’ 1% per
l’ ET (Pardanani et al., 2006). La scoperta delle mutazioni a carico dei geni JAK2 e MPL, pur
essendo stata una tappa importante nella comprensione del meccanismo alla base delle malattie
mieloproliferative Ph-negative, sembra non essere capace di spiegare a pieno la patogenesi di tali
disordini. Tra i geni potenzialmente mutati e che potrebbero anche precedere la mutazione di
JAK2 nelle MPNs, diversi partecipano normalmente al controllo epigenetico della trascrizione. I
cambiamenti epigenetici sono anomalie ereditabili che riguardano il controllo dell’espressione
genica e che dunque non riguardano alterazioni nella sequenza del DNA. Esistono diversi
meccanismi principali che controllano l’espressione genica attraverso cambiamenti epigenetici tra
i quali la metilazione diretta del DNA, l'acetilazione e la metilazione istonica.
La metilazione del DNA e degli istoni è responsabile del silenziamento genico mentre l'acetilazione
determina attivazione della trascrizione. L’alterazione di entrambi questi processi è considerata da
tempo un fattore comune nello sviluppo di numerose forme tumorali.
La conoscenza di ciò, associata, come si diceva precedentemente, alla consapevolezza che la
mutazione di JAK2 e di MPL non giustifichino completamente lo sviluppo delle diverse forme di
malattie mieloproliferative Ph-negative ha portato, di recente, a pensare di condurre studi
proprio sulla regolazione epigenetica dell’espressione genica nell’ambito di questo tipo di
patologie focalizzandosi in particolare sulla ricerca di mutazioni a carico di singoli geni accreditati
come potenzialmente coinvolti nella patogenesi di questi disordini.
Tra i diversi geni già oggetto di studio risultati essere mutati nelle neoplasie mieloproliferative
classiche vi sono alcuni in cui l’identificazione di mutazioni ricorrenti evidenzia l’alterazione del
controllo epigenetico come TET2, IDH1/2, EZH2, ASXL1 , DNMT3A (Oh et al., 2010; Lasho et al.,
2010; Pardanani et al., 2010; Delhommeau et al., 2009; Tefferi et al., 2009; Tefferi et al., 2010;
Tefferi, 2010; Ernst et al.,2010; Carbuccia et al., 2009; Abdel-Wahab et al., 2011; Stegelmann et
al., 2011). Alcuni di questi geni sono stati recentemente associati anche alla possibile progressione
delle MPN in leucemia acuta, assumendo un importante ruolo prognostico.
SCOPO DEL PROGETTO
Alla luce delle recenti acquisizioni riguardo alla possibile associazione tra alterazione dei fattori
coinvolti nella regolazione epigenetica dell'espressione genica e sviluppo delle neoplasie
mieloproliferative Ph-negative, l'obiettivo del progetto è quello di effettuare uno screening
mutazionale tramite tecnica di sequenziamento diretto di geni (comprendente anche quelli
precedentemente citati) già noti in letteratura come codificanti per fattori epigenetici, al fine di
determinare eventuali correlazioni tra un particolare genotipo mutato e un determinato fenotipo
clinico in pazienti affetti da MPN.
Per la realizzazione di questo progetto verrà utilizzato uno strumento da poco disponibile per il
sequenziamento diretto, lo "Ion Personal Genome Machine™ (PGM™) sequencer" (Life
Technologies™), in grado di effettuare sequenziamento genico diretto sfruttando una tecnologia di
ultimissima generazione. La tecnica su cui si basa lo "Ion Torrent™" consiste nella trasformazione
diretta di informazioni espresse chimicamente (A, C, G, T) in linguaggio digitale (0, 1) attraverso un
"semiconductor chip". I chips sono costituiti da numerosi micro pozzetti e ciascun pozzetto può
contenere differenti DNA templato. Il processo biochimico sfruttato per il sequenziamento consiste,
dunque, nel rilevamento di uno ione idrogeno rilasciato normalmente come sottoprodotto nel corso
della replicazione del DNA, quando la polimerasi incorpora all'interno del nuovo filamento di DNA, un
ulteriore nucleotide. La presenza dello ione idrogeno infatti determina, a seconda della base
incorporata, una variazione del PH della soluzione, la quale viene rivelata attraverso un sensore.
Questo sequenziatore, dunque, è il più piccolo misuratore di PH allo stato solido in grado di
riconoscere la variazione associandola ad una determinata base, ideale per il sequenziamento di
piccoli genomi, sets di geni o per determinare i profili di espressione genica. In particolare lo Ion
PGM- sequencer è il più rapido tra i next-generation sequenze attualmente disponibili.
Questa tecnologia di sequenziamento di tipo "chimico", non basata, dunque, nè su meccanismi
enzimatici, nè su proprietà come fluorescenza o chemioluminescenza è attualmente la più semplice,
veloce e con un costo molto più basso rispetto ad altre tecniche fin'ora a disposizione.
Il progetto di ricerca quindi si propone di analizzare lo stato mutazionale di una serie di geni ritenuti
potenzialmente implicati nella patogenesi molecolare delle NMP. Tra questi particolare attenzione
sarà rivolta nei riguardi di geni coinvolti nel controllo epigenetico della trascrizione genica, quali
TET2, IDH1/2, DNMT3A, ASXL1, EZH2 ed altri geni codificanti proteine incluse nel complesso PRC2
(polycomb repressive complex 2) come EED, SUZ12 e JARID2. Lo studio sarà effettuato utilizzando
DNA di oltre 500 pazienti con MPN che potrà essere immediatamente disponibile per lo studio delle
suddette anomalie genetiche.
