Lo studio della maturazione e della qualità dei frutti attraverso

Review n. 4 – Italus Hortus 13 (4), 2006: 17-28
Lo studio della maturazione e della qualità dei frutti attraverso approcci
di genomica
Pietro Tonutti1*, Livio Trainotti2 e Claudio Bonghi3
1
Scuola Superiore di Studi Universitari “S. Anna”, P.za Martiri della Libertà 33, 56127 Pisa
2
Dipartimento di Biologia, Università di Padova, viale Colombo 3, 35121 Padova
3
Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali, Università di Padova, viale
dell’Università 16, 35020 Legnaro (PD)
Data di ricezione: 14 giugno 2006; data di accettazione: 4 luglio 2006
Genomics approaches to study fruit
ripening and quality
A b s t r a c t . Genomic tools are becoming common
place in many plant science laboratories including
those involved in fruit physiology studies. Increased
understanding of fruit ripening is feasible with highthroughput methodologies for comprehensive transcriptome analyses. This article reviews main results
gained by transcript profiling methods in the identification of genes involved in the regulation of fleshy-fruit
ripening, and outlines potential applications of genomic tools developed in model species and already
available in some important fruit crops. Tomato has
emerged as model for fleshy fruit ripening, due, in
part, to simple genetics, numerous characterized
mutants, cross-fertile wild germplasm and routine
transformation technology. Starting from tomato, global transcript profiling methods allowed the association of newly identified genes, such as some transcription factors, with the ripening syndrome. Furthermore,
they helped in the functional characterisation of genes
important for quality traits, such as aroma evolution
and pigmentation. Transcriptome analysis can be carried out through direct and indirect analyses.
Considering direct analyses, expressed sequence tag
(EST)s sequencing has been performed in several
plant species and more than 350,000 fruit tissue-specific ESTs are now present in the NCBI database:
apple, grapes, Prunus spp, Citrus spp and tomato are
the species or genera with the highest EST number
isolated starting from fruit tissues. Digital expression
and cDNA-AFLP analyses performed on different species revealed the presence of up- and down-regulated
genes during the transition from immature to mature
stage in both climacteric and non-climacteric fruit. As
far as indirect analyses are concerned and following
the pioneering work on strawberry, microarray technology is now used in several fruit species. Different
microarray types containing a variable number of probes corresponding to genes expressed in fruit tissues
have been constructed and data concerning transcript
*
profiles and gene clustering in relation to the ripening
process and postharvest behaviour are available.
Several genes associated with specific quality traits
have been isolated and characterized using the
microarray approach. Comparative genomics carried
out by digital analysis of EST repertoires and microarray analyses indicated that groups of genes responsible for regulatory mechanisms are shared between
climacteric and non-climacteric fruits. Gene sequences are important in determining fruit characteristics
and can be useful in marker-assisted selection of new
varieties. Further information on regulation of fruit
ripening requires an extensive analysis of the proteome. Comparative proteomics is an efficient strategy
that could be used to achieve this goal. The identification of differentially-expressed proteins is becoming
easier as a result of the rapid growth of plant DNA
databases that allow association of a protein sequence with its cognate gene.
Key words: gene expression, transcriptome, ESTs,
microarray.
Introduzione
L’evoluzione dei diversi processi ed eventi che
caratterizzano la sindrome della maturazione dei frutti
carnosi avviene sotto stretto controllo dell’espressione
genica e determina l’acquisizione sia di caratteristiche
positive e desiderate (intenerimento della polpa, bilanciamento tra zuccheri ed acidi organici, sviluppo di
una pigmentazione e di un quadro aromatico tipici
della specie) sia di attributi negativi che limitano la
conservabilità e la vita commerciale del prodotto
(eccessivo rammollimento, aumentata sensibilità ai
patogeni, ridotto contenuto di sostanze antiossidanti).
La possibilità di modulare tali processi e, di conseguenza, di esercitare un controllo dell’evoluzione
della maturazione si fonda sulla delucidazione dei
meccanismi di base che regolano la fisiologia e il
metabolismo primario e secondario dei frutti durante
[email protected]
17
Tonutti et al.
le ultime fasi di sviluppo. La recente messa a punto di
strumenti genomici sta aprendo nuove ed interessanti
prospettive anche in questo settore di ricerca soprattutto attraverso lo studio su larga scala delle variazioni
del trascrittoma (Meyers et al., 2004) associate al processo di maturazione del frutto. L’analisi dei profili di
espressione rappresenta un potente strumento di indagine in quanto, tra gli altri vantaggi, consente di mettere in luce, nel corso del processo oggetto di studio,
la posizione gerarchica di migliaia di geni nonché di
definire, con singoli esperimenti, profili di espressione
di geni di funzione nota, ipotetica o sconosciuta. Ciò è
particolarmente vero quando l’oggetto di studio è rappresentato da un organo caratterizzato, nel corso dello
sviluppo, da evidenti cambiamenti (es. frutto in maturazione) o sottoposto a specifici trattamenti (es. frutti
in conservazione refrigerata e/o in AC, frutti trattati
con etilene o suoi inibitori, ecc).
L’interesse all’adozione di queste tecniche è confermato dal sempre maggior numero di studi dei profili di trascrizione in specie vegetali differenti da quelle
normalmente utilizzate come modello, in modo particolare in alcune di interesse agronomico-produttivo.
In questa review vengono quindi riportati i risultati
più rilevanti ottenuti da diversi gruppi di ricerca che
hanno applicato approcci genomici sia di tipo diretto
sia di tipo indiretto per lo studio della maturazione e
della qualità dei frutti carnosi.
Analisi del trascrittoma con metodi diretti
Isolamento, sequenziamento e analisi di ESTs
(Expressed Sequence Tags)
Le ESTs sono sequenze delle estremità 5’ o 3’ di
cloni prelevati in modo casuale da librerie cDNA. In
molte specie frutticole l’isolamento di ESTs è ed è stato
usato come strategia alternativa al sequenziamento
completo del genoma. Infatti, sequenziare per intero un
genoma è molto costoso (siamo nell’ordine di qualche
milione di euro) e quindi per quel che riguarda specie
che producono frutti carnosi, allo stato attuale, il
sequenziamento è stato intrapreso (ma non ancora completato) solamente per pomodoro e vite. Il numero di
ESTs isolate in specie frutticole (maggio 2006) ha oramai superato il milione (vedasi il database di ESTs del
National Center for Biotechnology Information nel sito
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST-summary.html).
Considerando solamente le ESTs prodotte a partire da
tessuti del frutto (più di 350.000), le specie maggiormente rappresentate (in termini di abbondanza di
ESTs) sono melo, vite, P r u n u s spp, C i t r u s spp e
pomodoro (tab. 1). Analisi sulle tipologie e frequenza
delle ESTs (analisi di espressione di tipo “digitale”):
18
isolate da frutti immaturi e maturi hanno identificato
più di 300 geni indotti e più di 180 geni repressi
durante la transizione dallo stadio mature green a
quello di breaker in pomodoro (Fei et al., 2004).
Utilizzando il medesimo approccio, gli stessi autori
hanno individuato 95 geni indotti e 181 repressi
durante il corso della maturazione della bacca della
vite. Comparando questi gruppi di geni che evidenziano profili di trascrizione simili nelle due specie, è
stato possibile isolare 23 sequenze indotte durante la
maturazione sia in pomodoro che in uva. Tra queste
sono presenti sequenze che codificano per fattori di
trascrizione (FT) appartenenti alle famiglie MADS
box, zinc-finger e bZIP: ciò indicherebbe la presenza
e il coinvolgimento di meccanismi di controllo della
maturazione comuni in frutti climaterici e non-climaterici.
Da Silva et al. (2005) hanno effettuato un’analisi
in silico di 135.541 ESTs isolate da 58 librerie di tessuti di 7 varietà di Vitis vinifera. Durante la maturazione della bacca d’uva, a partire dall’invaiatura, sono
evidenti profondi cambiamenti nel profilo di espressione di molti geni e il raggruppamento delle ESTs
sulla base dei vari profili trascrizionali ha permesso di
assegnare anche a prodotti genici con funzione sconosciuta un ruolo nella maturazione nel caso di co-regolazione con geni già identificati come ripening-indu ced (GRIP) (Davies e Robertson, 2000). Ciò potrebbe
consentire di assegnare una funzione putativa a questi
geni ignoti.
Una delle attività intraprese dal Consorzio Italiano
per lo studio della genomica in Prunus (Consorzio
ESTree, http://linuxbox.itb.cnr.it/estree) è stata quella
dell’isolamento di ESTs a partire da mesocarpo di
pesca in diversi stadi di sviluppo, inclusa la maturazione. Un’analisi parziale di queste ESTs ha messo in
luce la presenza di geni coinvolti nella biosintesi di
etilene e nel metabolismo parietale. Tra gli altri geni,
sono stati anche individuati tre FT omologhi a
SEPALLATA3, atb2 e bHLH61 e appartenenti,
rispettivamente, alle famiglie MADS, bZIP e bHLH
(Ziliotto et al., 2005). Sempre su pesca, sono state
condotte analisi di espressione “digitale” utilizzando
15.032 ESTs isolate da frutto immaturo (stadio S3,
2417 ESTs) e maturo (stadio S4, 12.615 ESTs); sono
stati così identificati 164 geni indotti e 113 geni
repressi nella transizione da frutto pre-climaterico a
climaterico (Tonutti e Bonghi, 2006). L’annotazione
di questi geni è stata effettuata via analisi BLAST utilizzando il database non ridondante di GeneBank e ciò
ha permesso di raggrupparli in categorie in accordo
con la loro funzione putativa. Come riportato in figura
1, marcate differenze sono presenti fra geni indotti e
Approccio genomico a maturazione e qualità frutti
Tab. 1 - Numero di ESTs prodotte a partire da trascritti presenti in vari tessuti delle singole specie frutticole elencate (ESTs/specie), di
ESTs isolate nell’ambito del genere (ESTs/genere), e numero e percentuale di EST ottenute specificamente da frutto depositate nella sezione dbEST del database GeneBank dell’NCBI.
Tab. 1 - Number of ESTs corresponding to transcripts isolated from different tissues of listed fruit species (EST/specie), total ESTs of different genera (EST/genere), and number and percentage of ESTs specifically isolated from fruit tissues (EST/frutto specifiche) present in the
dbEST section of NCBI GeneBank database.
ESTs
ESTs
ESTs / ESTs /
Specie
fruttofrutto
URL o e-mail
specie genere
specifiche
%
Ananas comosus
Capsicum annuum
Carica papaya
Citrus sinensis
Citrus clementina
Citrus x paradisi x Poncirus trifoliata
Citrus aurantium
Citrus x paradisi
Citrus reticulata
Citrus unshiu
Citrus reticulata x Citrus temple
Citrus clementina x Citrus tangerina
Citrus reshni
Citrus macrophylla
Citrus sinensis x Poncirus trifoliata
Citrus jambhiri
Citrus medica
Citrus clementina x Citrus reticulata
Totale Citrus spp.
Poncirus trifoliata
Coffea arabica
Coffea canephora
Totale Coffea spp.
Cucumis melo (muskmelon)
Cucumis sativus (cucumber)
Totale Cucumis spp
Fragaria vesca
Fragaria vesca subsp. vesca
Fragaria x ananassa (strawberry)
Totale Fragaria spp
Solanum esculentum (tomato)
Solanum esculentum var. cerasiforme
Solanum esculentum x S. pimpinellifolium
Solanum habrochaites
Solanum pennellii
Solanum melongena
Total Solanum spp
Malus sieboldii
Malus x domestica (apple tree)
Malus x domestica x Malus sieversii
Totale Malus spp
Musa acuminata
Musa acuminata subsp. burmannicoides
Musa x paradisiaca
Totale Musa spp
Persea americana
Prunus armeniaca
Prunus avium
Prunus cerasus
Prunus dulcis
Prunus persica
Totale Prunus spp
5.649
31.042
44
92.521
13.942
7.954
5.060
8.039
3.640
2.569
1.823
1.766
1.443
1.076
1.052
989
650
74
5.649
31.042
44
142.598
28.723 28.723
1.071
46.907
47.978
5.591
5.268
10.859
13.661
2.726
5.376
21.763
199.873
1.160
1.008
8.000
8.346
3.181
221.568
1.163
253.660
3.944
202.881
827
2.289
22
3.138
8.735
8.735
15.105
21
12
3.864
66.249
1.548
7.840
14
24.079
4.365
27,40
25,26
31,82
26,03
31,31
4.856
3.640
2.561
60,41
100,00
99,69
1.766
100,00
74
41.341
100
28,99
8.956
8.956
3.656
1.954
5.610
19,09
18,67
65,39
37,09
51,66
3.812
3.812
37.854
70,91
17,52
19,90
37.854
1.163
94.210
17,08
100,00
37,14
95.373
126
47,01
15,24
126
4,02
15.068
99,76
55.380
83,59
70.448
82,64
http://www.pgel.com.au or [email protected]
http://plant.pdrc.re.kr/sol/pepper/index.php
[email protected]
http://int-citrusgenomics.org/
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
http://www.fruit.affrc.go.jp/cgat/
[email protected],
[email protected]
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/
[email protected]
http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/
[email protected]
autori vari
http://www.sgn.cornell.edu/content/coffee.pl
http://melon.bti.cornell.edu/
[email protected]
http://www.sgn.cornell.edu
http://www.sgn.cornell.edu
http://www.sgn.cornell.edu
http://www.sgn.cornell.edu
http://www.sgn.cornell.edu
http://plant.pdrc.re.kr/sol/eggplant/index.php
http://titan.biotec.uiuc.edu/apple/apple.shtml
http://www.hortresearch.co.nz/
[email protected]
http://www.genome.clemson.edu/projects/almond/est/
http://linuxbox.itb.cnr.it/ESTree/index.php;
http://www.genome.clemson.edu/projects/peach/est/
http://genoma.unab.cl/dr/ ([email protected])
19
Tonutti et al.
segue (Tab. 1)
Specie
Pyrus communis
Pyrus communis x P. ussuriensis
Pyrus pyrifolia
Totale Pyrus spp
Ribes americanum
Theobroma cacao
Vaccinium corymbosum
Vitis aestivalis
Vitis cinerea x Vitis riparia
Vitis cinerea x Vitis rupestris
Vitis hybrid cultivar
Vitis labrusca
Vitis pseudoreticulata
Vitis riparia
Vitis shuttleworthii
Vitis vinifera
Totale Vitis spp
ESTs totali
ESTs /
specie
ESTs /
genere
210
88,24
335
2.238
6.581
4.399
210
62,68
211.917
77.150
359.704
40,51
32,80
238
82
15
2.238
6.581
4.399
2.101
55
61
6.533
5
114
1.910
10.704
195.434
1.096.58
ESTs
ESTs
frutto
frutto%
specifiche
URL o e-mail
http://www.vitaceae.org/
E
Fig. 1 - Ripartizione dei geni indotti (in alto) e repressi (in basso) durante la transizione dalla fase pre-climaterica a quella climaterica del
frutto di pesco in relazione alla loro funzione putativa. La funzione assegnata è quella indicata per il prodotto genico di Arabidopsis
mostrante la più elevata identità di sequenza.
Fig. 1 - Classification of ripening-induced (above) and -repressed (below) genes in peach fruit based on their putative function. The assigned function is that reported for the Arabidopsis product gene showing the highest sequence identity.
20
Approccio genomico a maturazione e qualità frutti
repressi soprattutto nelle categorie riguardanti il metabolismo della parete e la risposta agli ormoni.
Analizzando oltre 150.000 ESTs isolate da diversi
tessuti di melo, Newcomb et al. (2006) hanno identificato numerosi geni che, sulla base della loro funzione
putativa assegnata attraverso l’analisi comparativa
con l’algoritmo BLASTx, potrebbero essere coinvolti
nella modulazione di importanti caratteristiche durante la maturazione del frutto di questa specie: in particolare, sono stati individuati geni coinvolti nel metabolismo glucidico e nella biosintesi di aromi (esteri in
particolare). Un elevato numero di ESTs sono state
identificate in quanto coinvolte nella biosintesi di pigmenti attraverso sia la via del 5-deoxi-xilulosio (che
porta alla sintesi dei carotenoidi) che quella dei flavonoidi (responsabile della produzione di antocianine).
E’ stato evidenziato inoltre che tra le diverse famiglie
dei fattori di trascrizione, quella MYB è la maggiormente rappresentata.
cDNA-AFLP
Un’altra tecnica di indagine indiretta del trascrittoma, usata per lo studio della maturazione dei frutti, è
il cDNA-AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism) che si basa sulla discriminazione dei
cDNA ottenuti da un’ amplificazione selettiva di loro
frammenti via PCR (Vos et al., 1995; Bachem et al.,
1998). La tecnica cDNA-AFLP, appartenente alla più
generale categoria dei metodi di Differential Display
(DD), è stata applicata per studiare l’evoluzione del
trascrittoma durante la maturazione di lampone (Jones
et al., 2000), uva (Venter et al., 2001; Burger e Botha,
2004), fragola (Martelli et al., 2003), mela (Lin,
2005), e pesca (Ziliotto et al., 2005). Questa tecnica
può essere implementata in presenza della sequenza
dell’intero genoma della specie oggetto di studio.
Volkmuth et al. (2003) hanno messo a punto un database di riferimento nel quale sono state catalogate le
sequenze e l’abbondanza relativa dei frammenti
cDNA-AFLP corrispondenti a trascritti identificati in
diversi tessuti di piante di Arabidopsis cresciute in
diverse condizioni ambientali.
Nel caso dell’uva, questa tecnica è stata utilizzata
per una migliore comprensione dei processi fisiologici
che avvengono durante i processi di sovramaturazione
e di appassimento controllato per la produzione di
tipologie di vini che vanno dalle vendemmie tardive,
ai passiti, ai vini dolci da dessert. La conoscenza degli
eventi che avvengono nelle bacche durante questi processi è scarsa ed è limitata solamente al monitoraggio
dei cambiamenti della composizione: in realtà, sia il
processo di sovramaturazione che quello di disidratazione provocano profonde alterazioni del quadro
metabolico con importanti conseguenze sulla composizione della bacca che si riflettono sulle caratteristiche dei vini. Sono state così comparate bacche di uva
(cv Raboso Piave) alla vendemmia, staccate dopo
ulteriori 7 giorni di permanenza sulla pianta, e mantenute per 7 giorni dopo la raccolta in fruttaio per una
perdita di peso fresco del 15% circa (Tonutti e
Bonghi, 2006). La tecnica, nelle due rispettive tesi, ha
messo in luce la presenza di 92 e 82 geni differenzialmente espressi nelle bucce: in particolare, 51 geni
sono risultati repressi e 41 indotti nelle bacche sottoposte ad appassimento, mentre 58 e 24 sono apparsi
rispettivamente repressi e stimolati nelle bacche in
sovramaturazione in pianta. Alcuni di questi (45 tra i
repressi e 19 fra gli indotti) sono in comune fra i due
tipi di trattamento ma altri sono specificamente modulati (in positivo o negativo) dall’appassimento in
postraccolta e dal processo di sovramaturazione in
pianta. Tra questi, è da rilevare la presenza di un gene
codificante per isoflavone riduttasi che viene indotto
in seguito a disidratazione i cui effetti potrebbero,
quindi, rivelarsi importanti anche a livello dei rapporti
quantitativi dei flavonoidi nella buccia con conseguenze non solo in termini organolettici sulle caratteristiche dei vini.
Altri metodi diretti (es. SAGE, Serial Analysis of
Gene Expression , e MPSS, Massively Parallel
Segnature Sequencing) sono stati messi a punto per
studi di profili di espressione ma, fino ad ora, non
sono mai stati utilizzati per analizzare il trascrittoma
di frutti durante lo sviluppo e la maturazione. Un
primo approccio nell’utilizzo dell’MPSS in specie
frutticole è stato recentissimamente messo in atto da
Nakano et al. (2006) che hanno allestito un database
MPSS in vite che potrà rivelarsi di grande utilità per
la annotazione di geni identificati attraverso il completo sequenziamento del genoma di questa specie.
Analisi del trascrittoma con metodi indiretti
Microarray
L’aumentata disponibilità di sequenze genomiche
e di cDNA nonché l’accelerato sviluppo delle nanotecnologie applicate al settore biologico hanno consentito la messa a punto di tecniche ed approcci analitici di tipo miniaturizzato come i microarray, oramai
ampiamente diffusi sia per gli studi di base che applicati anche nel settore vegetale (Renskin e Buell,
2005). Uno dei grandi vantaggi di questa tecnica è
dato dalla possibilità di analizzare simultaneamente
l’espressione di migliaia di geni attraverso due principali piattaforme sviluppate su supporti solidi, generalmente simili a vetrini da microscopio. Una prima tipo21
Tonutti et al.
logia è rappresentata dai microarray sui quali vengono
depositate le sonde di acidi nucleici che possono essere sia cDNA derivati da cloni presenti in specifiche
librerie (Schena et al., 1995) sia oligonucleotidi sintetici (generalmente di 50-80 pb in lunghezza) corrispondenti a specifici geni (Kane et al., 2000). Una
seconda tipologia è invece costituita dai Gene Chips
(tecnologia Affimetrix Inc. USA) nei quali corte
sequenze oligonucleotidiche (24-25 pb) vengono sintetizzate in situ sul supporto solido attraverso processi
fotolitografici (Lipshutz et al., 1999). In generale gli
oligonucleotidi hanno il vantaggio di possedere una
più elevata specificità così da rendere possibile la
distinzione tra trascritti che provengono da membri
diversi di famiglie multigeniche soprattutto se le
sequenze vengono selezionate in regioni con elevati
gradi di dissimilarità (la regione 3’ UTR dell’ mRNA)
(Kim et al., 2003). Tale discriminazione, tuttavia, non
è sempre attuabile in quanto è richiesta un’ accurata
annotazione dei geni possibile solo in presenza di
sequenze di una certa dimensione e di buona qualità.
Una caratteristica degli arrays sui quali vengono
microdepositati i cDNA o gli oligonucleotidi è quella
della elevata variabilità dei risultati delle ibridazioni,
in genere più elevata rispetto a quella che si ottiene
utilizzando i Gene Chips. Un’ulteriore fonte di variabilità, comune comunque ad entrambe le tecniche, è
rappresentata dalla preparazione dell’RNA e dalla sintesi del cDNA da impiegare negli esperimenti di ibridazione. E’ quindi fondamentale effettuare diverse
repliche per verificare la riproducibilità e la veridicità
dei dati nonché utilizzare appropriati strumenti di elaborazione statistica. Successivamente alla pionieristica applicazione di questo strumento di indagine genomica sulla fragola, grazie alla quale è stato possibile
isolare e caratterizzare il gene SAAT coinvolto nella
biosintesi di aromi (Aharoni et al., 2000), un numero
sempre maggiore di microarray è stato messo a punto
ed utilizzato in diverse specie frutticole. La tabella 2
riporta, in sintesi, le più importanti caratteristiche dei
microarray finora sviluppati e qui vengono descritti i
risultati più interessanti ottenuti mediante il loro uti-
Tab. 2 - Microarray contenenti sonde provenienti da diversi tessuti di piante con frutti carnosi e loro utilizzo nello studio dello sviluppo,
maturazione e post-raccolta dei frutti.
Tab. 2 - Available microarry platforms containing probes corresponding to transcripts isolated from different tissues and organs of fleshy
fruit species and their use in fruit physiology studies.
Descrizione
Specie
Piattaforma
Sonde
cDNA
cDNA
6.875
2.200
Nessuna ricerca specifica per il frutto
Contiene principalmente sonde provenienti dal frutto. Sviluppo e maturazione
del frutto
cDNA
1.701 Sonde da frutto maturo (red stage).
Fragola
Maturazione del frutto
cDNA
1.800 Sonde da frutto maturo
Melo
cDNA
985
Contiene sonde da frutti freschi e conservati. Qualità in post-raccolta
cDNA
1.364 Sonde da frutti in differenti fasi del ciclo
Pero
di sviluppo. Sviluppo, maturazione e
post-raccolta del frutto
oligo (70 mer) Operon 4.800 Principalmente dal frutto maturo.
Pesco
Maturazione del frutto e genomica comparativa in Rosales
cDNA
12.899 Sonde da differenti tessuti della pianta.
Sviluppo del frutto e genomica comparaPomodoro
tive nelle Solanaceae e Rosales
gene chip
10.000 Sonde da differenti tessuti della pianta
Arancio
oligo (70 mer) Operon 12.160 Sonde da differenti tessuti della pianta
cDNA
4.608 Sonde da bacche mature. Sviluppo del
frutto
gene chip
15.700 Sonde da differenti tessuti di Vitis.
Vite
oligo (50 mer) MWG 3.200 Sonde da bacche in differenti fasi del
Biotech
ciclo di sviluppo. Sviluppo del frutto
oligo (70 mer) Operon 14.562 Sonde da differenti tessuti di Vitis
22
Bibiliografia
Origine sonde e
processi fisiologici studiati
Forment et al., 2005
Shimada et al., 2005
Aharoni et al., 2000
Rosati et al., 2004
van Wordragen et al. (2003)
Fonseca et al., 2004
Trainotti et al., 2006
http://www.operon.com/arrays/oligosets_peach.php
Alba et al., 2004
http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/tomato.affx
http://www.operon.com/arrays/oligosets_Tomato.php
Waters et al., 2005
http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/vitis.affx
Terrier et al., 2005
http://www.operon.com/arrays/oligosets_grape.php
22
Approccio genomico a maturazione e qualità frutti
lizzo nelle diverse specie frutticole nello studio della
maturazione e della qualità dei frutti.
Fragola
Come sopra riportato, l’applicazione della tecnica
microarray in questa specie ha consentito di caratterizzare funzionalmente il gene che codifica per alcool
aciltransferasi
(Aharoni
et al ., 2000).
Successivamente alla messa a punto di questo primo
microchip che conteneva 1.700 sonde di cDNA da
frutto maturo e che è stato utilizzato anche per studi
sugli stress ossidativi e sull’azione delle auxine
(Aharoni et al., 2002), e sulle relazioni tra achene e
ricettacolo (Aharoni e O’Connell, 2002), non ci sono
state sue ulteriori implementazioni. Un microarray
contenente circa 1.800 sonde di cDNA sempre da
frutto maturo è stato sviluppato in Italia da Carbone et
al. (2005a) che hanno utilizzato genotipi coltivati nel
tentativo di mettere in relazione i profili trascrizionali
con le caratteristiche organolettiche come la consistenza, il colore e l’aroma ed identificare markers
molecolari da utilizzare nella selezione di nuove
varietà.
Pomodoro
In questa specie sono state messe a punto entrambe
le tipologie di microarray (Gene Chip e vetrini microdepositati sia con sonde di cDNA che di oligonucleotidi). Il microarray TOM1 contenente 12.889 sonde di
cDNA da frutto corrispondenti a circa 8.500 geni ha
consentito di identificare 869 geni differenzialmente
espressi durante le fasi finali dello sviluppo della
bacca (da immatura a rosso matura, Alba et al., 2005).
La mutazione di un recettore per l’etilene (Nr, Neverripe), che riduce la sensibilità all’etilene ed inibisce la
maturazione, altera l’espressione del 37% di questi
geni differenzialmente espressi e coinvolti nella evoluzione della forma del frutto e dello sviluppo dei
semi, nonché nella biosintesi di carotenoidi. Questi
risultati dimostrano che l’azione dell’etilene, almeno
in pomodoro, non è confinata a processi collegati alla
sindrome della maturazione. Il microarray TOM1 e
analisi via RT-PCR sono anche stati utilizzati per
delucidare le relazioni esistenti fra regime luminoso e
pigmentazione del frutto. I risultati ottenuti da
Carbone et al. (2005b) indicano che una forte induzione del citocromo del tipo A/F si verifica durante lo
sviluppo della bacca di pomodoro è ciò sarebbe da
porre in relazione con l’acquisizione della tipica pigmentazione (dovuta soprattutto all’accumulo di licopene) del frutto.
Pesco
Per questa specie è stato messo a punto da parte del
Consorzio ESTree (ESTree Consortium, 2005) il primo
microarray (µPEACH 1.0) contenente più di 4.800 oligonucleotidi (70meri) ciascuno corrispondente ad uno
specifico unigene, così come indicato nel database
dedicato (http://linuxbox.itb.cnr.it/ESTree/). Questa
collezione di unigeni proviene da ESTs isolate a partire soprattutto da mesocarpo in diverse fasi di sviluppo
(dalla S1 alla S4). Il microarray è stato fino ad ora utilizzato per studiare i cambiamenti dei profili trascrizionali durante la transizione del frutto da preclimaterico a climaterico (Trainotti et al., 2006): sono stati
così identificati 267 geni indotti e 109 repressi durante
questa transizione. Tra i geni differenzialmente
espressi sono presenti quelli coinvolti nella biosintesi,
percezione e trasduzione del messaggio dell’etilene.
In particolare e come riportato graficamente in figura
2, oltre ad ACS (ACC sintetasi) e ACO (ACC ossidasi), fra i geni stimolati sono presenti Pp-ERS1 e PpETR2, che codificano per recettori dell’ormone gassoso e Pp-EIN2 che svolge un importante ruolo nei meccanismi di trasduzione del messaggio. Altri geni coinvolti nella percezione, nella trasmissione del segnale o
nella regolazione dell’espressione di geni etilenedipendenti non sembrano, sulla base delle elaborazioni condotte, evidenziare marcate differenze nella evoluzione frutto immaturo/frutto maturo (fig. 2). Questi
dati sono in fase di validazione attraverso specifiche
analisi di espressione. Fra i geni più direttamente
coinvolti nella modulazione di tratti qualitativi, sono
stati identificati un nuovo gene codificante per pectinmetilesterasi e due per le espansine che quindi potrebbero partecipare al processo di rammollimento della
polpa. Considerando l’evoluzione della pigmentazione, è stato individuato un gene (indotto a maturazione) codificante per β-carotene idrossilasi, responsabile
della formazione di β-criptoxantina, il più abbondante
carotenoide delle pesche. Di particolare interesse per
sviluppi futuri di ricerche riguardanti i meccanismi di
regolazione è l’individuazione di 19 fattori di trascrizione differenzialmente espressi da frutto pre-climaterico a frutto climaterico. Tra questi, 6 membri della
famiglia Aux/IAA sono fortemente indotti e ciò confermerebbe l’importante ruolo giocato dalla interazione etilene-auxine nel controllo ed iniziazione del processo di maturazione. Sono anche stati individuati fattori appartenenti alle famiglie MADS-box e bZIP:
come osservato in pomodoro ed uva (Fei et al., 2004)
questi fattori sono indotti quando il frutto matura.
23
Tonutti et al.
Fig. 2 - Espressioni relative (espresse nell’istogramma come logaritmo del rapporto tra le intensità di espressione) dei geni coinvolti nella
biosintesi, percezione e traduzione del segnale dell’etilene (il cui ruolo è schematizzato sulla destra della figura) durante la transizione da
frutto preclimaterico a frutto climaterico.
Fig. 2 - Relative expression (bar chart on the left side expressed as log of mature/immature ratio) of genes involved in the biosynthesis,
perception and signal transduction of ethylene (as shown in the scheme on the right side) during the transition from preclimacteric
to climacteric stage.
Agrumi
Oltre a produrre un elevato numero di ESTs, il
consorzio spagnolo (Spanish Citrus Consortium) ha
messo a punto un microarray con 12.672 sonde di
cDNA corrispondenti a 6.875 putativi unigeni espressi
in parti diverse della pianta incluso il frutto di diverse
specie di Citrus (Forment et al., 2005). Al momento
non sono ancora stati pubblicati dati relativi all’utilizzo di questo microarray. Con un più ristretto numero
di cDNA ottenuti da frutti della cv Fortune (C. cle mentina x C. reticulata) di mandarino e di arancio
dolce è stato allestito un microarray utilizzato da Pons
et al. (2005) per lo studio dei cambiamenti del trascrittoma nel flavedo in seguito ad esposizione, nella
fase postraccolta, a temperature di 2 °C. I risultati evidenziano che un gruppo di geni è attivato in relazione
allo stress termico e che profonde differenze sono
visibili fra varietà che presentano diverse tolleranze
alle basse temperature. In particolare, nei frutti che
presentano evidenti danni da bassa temperatura risultano differentemente espressi, rispetto a frutti di
varietà tolleranti a tale tipo di stress, geni coinvolti nel
24
metabolismo della parete cellulare e delle membrane,
nella biosintesi di etilene e nella coniugazione dell’acido salicilico. Questi risultati appaiono molto promettenti nell’ottica di individuare un set di geni da
utilizzare come marcatori nella selezione di nuove
cultivar tolleranti alle basse temperature e per mettere
a punto le migliori pratiche di conservazione.
Utilizzando un microarray contenente 2.213 cDNA,
Shimada et al. (2005) hanno disegnato una mappa trascrizionale di frutti di Citrus nei diversi tessuti osservando che sono presenti diverse dinamiche di regolazione di espressione genica in relazione al tipo di tessuto e alla fase di sviluppo.
Melo
Nonostante il grande numero di ESTs disponibili
per tale specie solo pochi lavori sono stati pubblicati
sull’utilizzo di microarray costruiti, tra l’altro, con
una limitata quantità di sonde. Van Wordragen et al.
(2003) hanno riportato i risultati riguardanti una correlazione fra profili di espressione genica e sviluppo
della farinosità (mealiness) in conservazione nelle
Approccio genomico a maturazione e qualità frutti
mele Cox. Lo sviluppo di questa fisiopatia e la presenza di off-flavours sono stati messi in correlazione con
specifici profili di espressione di specifici geni che
potrebbero, di conseguenza, rivelarsi di estrema utilità
per la gestione delle mele in postraccolta.
Pero
Una collezione di 1.364 cloni di cDNA ottenuti da
due librerie di frutto di pero è stata utilizzata per allestire un microrray attraverso il quale sono stati studiati
i cambiamenti dei profili di trascrizione nel corso
dello sviluppo del frutto e durante la fase di conservazione (Fonseca et al., 2005). Centotrenta geni differenzialmente espressi sono stati raggruppati in cinque
grandi gruppi sulla base del profilo comune di espressione. In linea generale appare che il più marcato
cambiamento a carico del profilo del trascrittoma si
verifica nella transizione dalla fase pre-climaterica a
quella climaterica. Nell’ambito del gruppo V sono
presenti geni che sembrano maggiormente coinvolti
nel metabolismo postraccolta: questi geni codificano
soprattutto per proteine di difesa e coinvolte in vie
ossidative. Di particolare interesse appare il fatto che
geni responsabili di tratti aromatici risultano espressi
principalmente nei frutti staccati dalla pianta madre.
Vite
Un notevole fermento di indagini di tipo genomico
riguarda il genere Vitis. Sono state prodotte diverse
piattaforme sia come A r r a y microdepositati con
cDNA e oligonucleotidi (50 e 70 meri) sia del tipo
Gene Chip. Per quanto riguarda gli arrays microdepositati, sia quello con sonde di cDNA (4.608) sia quello
con oligonucleotidi (50meri) (3.200) sono rappresentativi di mRNA espressi durante lo sviluppo del frutto
(Terrier et al., 2005; Waters et al., 2005). L’utilizzo
dei due diversi microarrays ha portato a risultati simili
e comparabili, come evidenziato dai dati di espressione riguardanti la via biosintetica delle antocianine. In
tale via, infatti, alcuni geni (quali, ad esempio, chalcone sintetasi, F3-idrossilasi, antocianidina riduttasi)
evidenziano la presenza di due picchi di espressione:
uno presente in corrispondenza delle prime fasi di sviluppo della bacca (2 settimane dopo la fioritura), l’altro che si manifesta all’inizio della maturazione. La
precoce espressione di questi geni suggerisce che, in
corrispondenza delle fasi iniziali di sviluppo della
bacca, la via biosintetica dei flavonoidi sia attivata
probabilmente a favore della produzione di proantocianidine e tannini il cui accumulo comincia precocemente (pea stage) (Kennedy et al., 2001). Il microarray Grape ArosV1 (con sonde di oligonucleotidi
70meri) è stato utilizzato per lo studio degli effetti di
trattamenti con acido 2-cloroetilfosfonico (2-CEPA)
all’invaiatura e di etilene in postraccolta sui profili di
trascrizione in buccia: risultati preliminari (Tonutti et
al., dati non pubblicati) mettono in luce che, nonostante la bacca di V. vinifera sia non climaterica, la
trascrizione di un certo numero di geni viene indotta
dal trattamento postraccolta. Tra questi geni sono presenti alcuni che operano nelle diverse tappe della biosintesi e del metabolismo dei polifenoli, in generale, e
dei flavonoidi, in particolare. Tra quelli indotti, sono
inoltre identificabili geni la cui azione è riconducibile
alla alterazione della struttura ed architettura delle
pareti e alla modifica della permeabilità delle membrane.
I microarray sono stati anche utilizzati per studi di
tipo comparativo: nonostante le diversità di tipo botanico e/o fisiologico spesso presenti fra la specie che
ha originato le sonde e quella oggetto di studio, i
risultati di questi approcci comparativi sono di notevole interesse soprattutto per la possibilità di individuare possibili meccanismi comuni di regolazione di
specifici processi.
Utilizzando il microarray TOM1, Moore et al.
(2005) hanno allargato il campo di indagine genomica
a livello di altri frutti delle Solanacee quali il peperone e la melanzana. Questi autori hanno identificato
alcuni gruppi di ESTs che rappresentano markers
ortologhi, in quanto espressi similmente durante lo
sviluppo dei frutti, o che regolano diversi processi
nelle tre specie analizzate. Per quanto riguarda geni
che presentano un profilo di espressione comune in
pomodoro, melanzana e peperone durante la maturazione, ne sono stati identificati solo 2 indotti e 5
repressi. Restringendo l’analisi comparativa a due
specie per volta, è stato evidenziato che sono presenti
più geni con andamenti di espressione comuni fra
pomodoro e peperone rispetto alle altre due combinazioni (pomodoro/melanzana e melanzana/peperone).
L’analisi dei trascritti coinvolti nella struttura e funzionalità dei plastidi ha evidenziato importanti differenze fra melanzana da un lato e peperone e pomodoro dall’altro. Come prevedibile, trascritti coinvolti
nella biosintesi e percezione dell’etilene sono prevalenti in pomodoro (frutto climaterico) rispetto ai due
frutti di tipo non climaterico. Lo stesso microarray è
stato impiegato per comparare profili trascrizionali di
mela, uva e pesca (Ziliotto et al., 2004): tra i 22 geni
appartenenti alla famiglia MADS-box presenti nel
microarray TOM1, due possono essere considerati
come fattori comuni di regolazione. Di questi, uno è
associato positivamente mentre l’altro negativamente
al processo di maturazione: il primo, che presenta una
elevata omologia con il gene AGL62 di Arabidopsis,
25
Tonutti et al.
aumenta la trascrizione durante la maturazione dei soli
frutti climaterici (pomodoro, pesca e mela), mentre il
secondo, omologo a FBP24 di petunia è represso sia
nei frutti climaterici sia in quello non climaterico
(uva).
Ponce-Valadez et al. (2005) hanno effettuato specifiche ibridazioni del microarray TOM1 per studiare
l’effetto di tecniche di conservazione postraccolta ed,
in particolare, di elevate concentrazioni di CO 2, su
cambiamenti del trascrittoma potenzialmente associabili all’evoluzione di sostanze volatili in due cultivar
di fragola. I risultati ottenuti mettono in luce le
profonde differenze esistenti fra le due cultivar in termini di profili di trascrizione in relazione al mantenimento in condizioni di elevata CO2: alcuni geni differenzialmente espressi sono stati identificati ed isolati
per successive analisi funzionali.
Considerando che un’ analisi incrociata tra ESTs
indotte a maturazione in uva e pesca ha messo in luce
la presenza di diversi geni espressi, in questa fase di
sviluppo, in entrambi i frutti (Bonghi et al., 2005), è
stata effettuata un’ibridazione del microarray
µPEACH1.0 per studiare i cambiamenti del profilo
trascrizionale che avvengono nelle bucce delle bacche
d’uva da vino sottoposte a parziale disidratazione
(circa il 15% di perdita peso fresco) in postraccolta. I
geni che hanno evidenziato espressione differenziale
in bucce di bacche disidratate e non disidratate sono
stati raggruppati in categorie funzionali e riportati graficamente in figura 3. Alcuni di questi appartengono
alle categorie funzionali dello stress/difesa e della trasduzione del segnale e ciò indicherebbe l’attivazione
di specifiche vie metaboliche con possibili conseguenze sulla composizione della buccia. Di particolare interesse appaiono alcuni geni repressi durante il
processo di disidratazione: tra questi, il gene denominato Snakin1 che codifica per una proteina che, in
patata, è stata positivamente associata alla resistenza a
diversi tipi di patogeni tra cui la Botrite (Segura et al.,
1999). Se questo comportamento dovesse essere confermato anche nell’uva per la quale la Botrite, com’è
noto, rappresenta una delle più importanti cause di
Fig. 3 - Espressioni relative (calcolate come log del rapporto fra le intensità di espressione misurate in bacche d’uva disidratate e fresche)
dei geni corrispondenti alle sonde depositate sul microarray µPEACH1.0 mostranti variazioni significative (log>1 e <1) durante il processo
di appassimento (calo peso del 10% circa). I geni sono stati raggruppati sulla base della loro funzione putativa assegnata come indicato in
figura 1.
Fig. 3 - Relative expression (log of the ratio between transcript accumulation in dehydrated and freshly harvested grape berries) of genes
corresponding to probes spotted on µPEACH1.0 microarray showing significant changes (log>1 or <1) during dehydration (weight loss
about 10%). Genes have been grouped according to their putative function assigned as reported in figure 1.
26
Approccio genomico a maturazione e qualità frutti
perdita di prodotto, l’espressione di questo gene
potrebbe essere utilizzata come indicatore per stabilire
il grado di resistenza/suscettibilità all’attacco del patogeno e l’attitudine delle diverse tipologie di uva
all’appassimento.
Prospettive future
Oltre alla necessità di implementare le banche dati
di sequenze (trascritte e non), l’impetuoso sviluppo
delle tecniche di genomica e la loro sempre più ampia
diffusione per lo studio dei meccanismi di regolazione
che stanno alla base dei processi tipici della maturazione e dell’acquisizione dei tratti qualitativi rende
necessario l’ampliamento delle conoscenze relative ai
processi post-trascrizionali per una migliore comprensione e valutazione delle relazioni esistenti fra i livelli
di mRNA e le corrispondenti proteine. In tale contesto, lo sviluppo della proteomica è complementare a
quello della trascrittomica e risulterà di grande utilità
per colmare le lacune conoscitive esistenti fra la
sequenza del DNA genomico e lo stato biologico del
sistema oggetto di studio (Rose et al., 2004). Lo studio della maturazione dei frutti si avvantaggerà dalla
più ampia utilizzazione di tecniche quali elettroforesi
bidimensionali e DIGE (2D Differential In-Gel
Electrophoresis) nonché dallo sviluppo della metabolomica, disciplina ancora agli albori, ma che, presumibilmente potrà trovare un fertilissimo campo di applicazione nel settore delle scienze frutticole.
Riassunto
L’utilizzo di approcci e strumenti genomici applicati al settore vegetale si sta espandendo velocemente
anche per lo studio della maturazione dei frutti carnosi
e delle basi biologiche della qualità. In seguito all’isolamento di ESTs da diverse tipologie di frutto, sono
state effettuate analisi di espressione digitale che,
assieme alla tecnica del cDNA-AFLP, hanno consentito di individuare geni coinvolti nel processo di maturazione sia in frutti climaterici che non climaterici. Un
importante contributo nel settore della genomica funzionale applicata al settore frutticolo sta giungendo
dalla tecnica dei microarray: in numerose specie da
frutto sono infatti disponibili questi supporti con un
più o meno elevato numero di sonde corrispondenti a
geni espressi nei diversi tessuti dei frutti e/o in diversi
stadi di sviluppo.
Parole chiave: espressione genica, trascrittoma,
ESTs, microarray, profili di trascrizione.
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