Review n. 4 – Italus Hortus 13 (4), 2006: 17-28 Lo studio della maturazione e della qualità dei frutti attraverso approcci di genomica Pietro Tonutti1*, Livio Trainotti2 e Claudio Bonghi3 1 Scuola Superiore di Studi Universitari “S. Anna”, P.za Martiri della Libertà 33, 56127 Pisa 2 Dipartimento di Biologia, Università di Padova, viale Colombo 3, 35121 Padova 3 Dipartimento di Agronomia Ambientale e Produzioni Vegetali, Università di Padova, viale dell’Università 16, 35020 Legnaro (PD) Data di ricezione: 14 giugno 2006; data di accettazione: 4 luglio 2006 Genomics approaches to study fruit ripening and quality A b s t r a c t . Genomic tools are becoming common place in many plant science laboratories including those involved in fruit physiology studies. Increased understanding of fruit ripening is feasible with highthroughput methodologies for comprehensive transcriptome analyses. This article reviews main results gained by transcript profiling methods in the identification of genes involved in the regulation of fleshy-fruit ripening, and outlines potential applications of genomic tools developed in model species and already available in some important fruit crops. Tomato has emerged as model for fleshy fruit ripening, due, in part, to simple genetics, numerous characterized mutants, cross-fertile wild germplasm and routine transformation technology. Starting from tomato, global transcript profiling methods allowed the association of newly identified genes, such as some transcription factors, with the ripening syndrome. Furthermore, they helped in the functional characterisation of genes important for quality traits, such as aroma evolution and pigmentation. Transcriptome analysis can be carried out through direct and indirect analyses. Considering direct analyses, expressed sequence tag (EST)s sequencing has been performed in several plant species and more than 350,000 fruit tissue-specific ESTs are now present in the NCBI database: apple, grapes, Prunus spp, Citrus spp and tomato are the species or genera with the highest EST number isolated starting from fruit tissues. Digital expression and cDNA-AFLP analyses performed on different species revealed the presence of up- and down-regulated genes during the transition from immature to mature stage in both climacteric and non-climacteric fruit. As far as indirect analyses are concerned and following the pioneering work on strawberry, microarray technology is now used in several fruit species. Different microarray types containing a variable number of probes corresponding to genes expressed in fruit tissues have been constructed and data concerning transcript * profiles and gene clustering in relation to the ripening process and postharvest behaviour are available. Several genes associated with specific quality traits have been isolated and characterized using the microarray approach. Comparative genomics carried out by digital analysis of EST repertoires and microarray analyses indicated that groups of genes responsible for regulatory mechanisms are shared between climacteric and non-climacteric fruits. Gene sequences are important in determining fruit characteristics and can be useful in marker-assisted selection of new varieties. Further information on regulation of fruit ripening requires an extensive analysis of the proteome. Comparative proteomics is an efficient strategy that could be used to achieve this goal. The identification of differentially-expressed proteins is becoming easier as a result of the rapid growth of plant DNA databases that allow association of a protein sequence with its cognate gene. Key words: gene expression, transcriptome, ESTs, microarray. Introduzione L’evoluzione dei diversi processi ed eventi che caratterizzano la sindrome della maturazione dei frutti carnosi avviene sotto stretto controllo dell’espressione genica e determina l’acquisizione sia di caratteristiche positive e desiderate (intenerimento della polpa, bilanciamento tra zuccheri ed acidi organici, sviluppo di una pigmentazione e di un quadro aromatico tipici della specie) sia di attributi negativi che limitano la conservabilità e la vita commerciale del prodotto (eccessivo rammollimento, aumentata sensibilità ai patogeni, ridotto contenuto di sostanze antiossidanti). La possibilità di modulare tali processi e, di conseguenza, di esercitare un controllo dell’evoluzione della maturazione si fonda sulla delucidazione dei meccanismi di base che regolano la fisiologia e il metabolismo primario e secondario dei frutti durante [email protected] 17 Tonutti et al. le ultime fasi di sviluppo. La recente messa a punto di strumenti genomici sta aprendo nuove ed interessanti prospettive anche in questo settore di ricerca soprattutto attraverso lo studio su larga scala delle variazioni del trascrittoma (Meyers et al., 2004) associate al processo di maturazione del frutto. L’analisi dei profili di espressione rappresenta un potente strumento di indagine in quanto, tra gli altri vantaggi, consente di mettere in luce, nel corso del processo oggetto di studio, la posizione gerarchica di migliaia di geni nonché di definire, con singoli esperimenti, profili di espressione di geni di funzione nota, ipotetica o sconosciuta. Ciò è particolarmente vero quando l’oggetto di studio è rappresentato da un organo caratterizzato, nel corso dello sviluppo, da evidenti cambiamenti (es. frutto in maturazione) o sottoposto a specifici trattamenti (es. frutti in conservazione refrigerata e/o in AC, frutti trattati con etilene o suoi inibitori, ecc). L’interesse all’adozione di queste tecniche è confermato dal sempre maggior numero di studi dei profili di trascrizione in specie vegetali differenti da quelle normalmente utilizzate come modello, in modo particolare in alcune di interesse agronomico-produttivo. In questa review vengono quindi riportati i risultati più rilevanti ottenuti da diversi gruppi di ricerca che hanno applicato approcci genomici sia di tipo diretto sia di tipo indiretto per lo studio della maturazione e della qualità dei frutti carnosi. Analisi del trascrittoma con metodi diretti Isolamento, sequenziamento e analisi di ESTs (Expressed Sequence Tags) Le ESTs sono sequenze delle estremità 5’ o 3’ di cloni prelevati in modo casuale da librerie cDNA. In molte specie frutticole l’isolamento di ESTs è ed è stato usato come strategia alternativa al sequenziamento completo del genoma. Infatti, sequenziare per intero un genoma è molto costoso (siamo nell’ordine di qualche milione di euro) e quindi per quel che riguarda specie che producono frutti carnosi, allo stato attuale, il sequenziamento è stato intrapreso (ma non ancora completato) solamente per pomodoro e vite. Il numero di ESTs isolate in specie frutticole (maggio 2006) ha oramai superato il milione (vedasi il database di ESTs del National Center for Biotechnology Information nel sito http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST-summary.html). Considerando solamente le ESTs prodotte a partire da tessuti del frutto (più di 350.000), le specie maggiormente rappresentate (in termini di abbondanza di ESTs) sono melo, vite, P r u n u s spp, C i t r u s spp e pomodoro (tab. 1). Analisi sulle tipologie e frequenza delle ESTs (analisi di espressione di tipo “digitale”): 18 isolate da frutti immaturi e maturi hanno identificato più di 300 geni indotti e più di 180 geni repressi durante la transizione dallo stadio mature green a quello di breaker in pomodoro (Fei et al., 2004). Utilizzando il medesimo approccio, gli stessi autori hanno individuato 95 geni indotti e 181 repressi durante il corso della maturazione della bacca della vite. Comparando questi gruppi di geni che evidenziano profili di trascrizione simili nelle due specie, è stato possibile isolare 23 sequenze indotte durante la maturazione sia in pomodoro che in uva. Tra queste sono presenti sequenze che codificano per fattori di trascrizione (FT) appartenenti alle famiglie MADS box, zinc-finger e bZIP: ciò indicherebbe la presenza e il coinvolgimento di meccanismi di controllo della maturazione comuni in frutti climaterici e non-climaterici. Da Silva et al. (2005) hanno effettuato un’analisi in silico di 135.541 ESTs isolate da 58 librerie di tessuti di 7 varietà di Vitis vinifera. Durante la maturazione della bacca d’uva, a partire dall’invaiatura, sono evidenti profondi cambiamenti nel profilo di espressione di molti geni e il raggruppamento delle ESTs sulla base dei vari profili trascrizionali ha permesso di assegnare anche a prodotti genici con funzione sconosciuta un ruolo nella maturazione nel caso di co-regolazione con geni già identificati come ripening-indu ced (GRIP) (Davies e Robertson, 2000). Ciò potrebbe consentire di assegnare una funzione putativa a questi geni ignoti. Una delle attività intraprese dal Consorzio Italiano per lo studio della genomica in Prunus (Consorzio ESTree, http://linuxbox.itb.cnr.it/estree) è stata quella dell’isolamento di ESTs a partire da mesocarpo di pesca in diversi stadi di sviluppo, inclusa la maturazione. Un’analisi parziale di queste ESTs ha messo in luce la presenza di geni coinvolti nella biosintesi di etilene e nel metabolismo parietale. Tra gli altri geni, sono stati anche individuati tre FT omologhi a SEPALLATA3, atb2 e bHLH61 e appartenenti, rispettivamente, alle famiglie MADS, bZIP e bHLH (Ziliotto et al., 2005). Sempre su pesca, sono state condotte analisi di espressione “digitale” utilizzando 15.032 ESTs isolate da frutto immaturo (stadio S3, 2417 ESTs) e maturo (stadio S4, 12.615 ESTs); sono stati così identificati 164 geni indotti e 113 geni repressi nella transizione da frutto pre-climaterico a climaterico (Tonutti e Bonghi, 2006). L’annotazione di questi geni è stata effettuata via analisi BLAST utilizzando il database non ridondante di GeneBank e ciò ha permesso di raggrupparli in categorie in accordo con la loro funzione putativa. Come riportato in figura 1, marcate differenze sono presenti fra geni indotti e Approccio genomico a maturazione e qualità frutti Tab. 1 - Numero di ESTs prodotte a partire da trascritti presenti in vari tessuti delle singole specie frutticole elencate (ESTs/specie), di ESTs isolate nell’ambito del genere (ESTs/genere), e numero e percentuale di EST ottenute specificamente da frutto depositate nella sezione dbEST del database GeneBank dell’NCBI. Tab. 1 - Number of ESTs corresponding to transcripts isolated from different tissues of listed fruit species (EST/specie), total ESTs of different genera (EST/genere), and number and percentage of ESTs specifically isolated from fruit tissues (EST/frutto specifiche) present in the dbEST section of NCBI GeneBank database. ESTs ESTs ESTs / ESTs / Specie fruttofrutto URL o e-mail specie genere specifiche % Ananas comosus Capsicum annuum Carica papaya Citrus sinensis Citrus clementina Citrus x paradisi x Poncirus trifoliata Citrus aurantium Citrus x paradisi Citrus reticulata Citrus unshiu Citrus reticulata x Citrus temple Citrus clementina x Citrus tangerina Citrus reshni Citrus macrophylla Citrus sinensis x Poncirus trifoliata Citrus jambhiri Citrus medica Citrus clementina x Citrus reticulata Totale Citrus spp. Poncirus trifoliata Coffea arabica Coffea canephora Totale Coffea spp. Cucumis melo (muskmelon) Cucumis sativus (cucumber) Totale Cucumis spp Fragaria vesca Fragaria vesca subsp. vesca Fragaria x ananassa (strawberry) Totale Fragaria spp Solanum esculentum (tomato) Solanum esculentum var. cerasiforme Solanum esculentum x S. pimpinellifolium Solanum habrochaites Solanum pennellii Solanum melongena Total Solanum spp Malus sieboldii Malus x domestica (apple tree) Malus x domestica x Malus sieversii Totale Malus spp Musa acuminata Musa acuminata subsp. burmannicoides Musa x paradisiaca Totale Musa spp Persea americana Prunus armeniaca Prunus avium Prunus cerasus Prunus dulcis Prunus persica Totale Prunus spp 5.649 31.042 44 92.521 13.942 7.954 5.060 8.039 3.640 2.569 1.823 1.766 1.443 1.076 1.052 989 650 74 5.649 31.042 44 142.598 28.723 28.723 1.071 46.907 47.978 5.591 5.268 10.859 13.661 2.726 5.376 21.763 199.873 1.160 1.008 8.000 8.346 3.181 221.568 1.163 253.660 3.944 202.881 827 2.289 22 3.138 8.735 8.735 15.105 21 12 3.864 66.249 1.548 7.840 14 24.079 4.365 27,40 25,26 31,82 26,03 31,31 4.856 3.640 2.561 60,41 100,00 99,69 1.766 100,00 74 41.341 100 28,99 8.956 8.956 3.656 1.954 5.610 19,09 18,67 65,39 37,09 51,66 3.812 3.812 37.854 70,91 17,52 19,90 37.854 1.163 94.210 17,08 100,00 37,14 95.373 126 47,01 15,24 126 4,02 15.068 99,76 55.380 83,59 70.448 82,64 http://www.pgel.com.au or [email protected] http://plant.pdrc.re.kr/sol/pepper/index.php [email protected] http://int-citrusgenomics.org/ http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/ [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] http://www.fruit.affrc.go.jp/cgat/ [email protected], [email protected] http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/ http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/ http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/ http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/ [email protected] http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es/ [email protected] autori vari http://www.sgn.cornell.edu/content/coffee.pl http://melon.bti.cornell.edu/ [email protected] http://www.sgn.cornell.edu http://www.sgn.cornell.edu http://www.sgn.cornell.edu http://www.sgn.cornell.edu http://www.sgn.cornell.edu http://plant.pdrc.re.kr/sol/eggplant/index.php http://titan.biotec.uiuc.edu/apple/apple.shtml http://www.hortresearch.co.nz/ [email protected] http://www.genome.clemson.edu/projects/almond/est/ http://linuxbox.itb.cnr.it/ESTree/index.php; http://www.genome.clemson.edu/projects/peach/est/ http://genoma.unab.cl/dr/ ([email protected]) 19 Tonutti et al. segue (Tab. 1) Specie Pyrus communis Pyrus communis x P. ussuriensis Pyrus pyrifolia Totale Pyrus spp Ribes americanum Theobroma cacao Vaccinium corymbosum Vitis aestivalis Vitis cinerea x Vitis riparia Vitis cinerea x Vitis rupestris Vitis hybrid cultivar Vitis labrusca Vitis pseudoreticulata Vitis riparia Vitis shuttleworthii Vitis vinifera Totale Vitis spp ESTs totali ESTs / specie ESTs / genere 210 88,24 335 2.238 6.581 4.399 210 62,68 211.917 77.150 359.704 40,51 32,80 238 82 15 2.238 6.581 4.399 2.101 55 61 6.533 5 114 1.910 10.704 195.434 1.096.58 ESTs ESTs frutto frutto% specifiche URL o e-mail http://www.vitaceae.org/ E Fig. 1 - Ripartizione dei geni indotti (in alto) e repressi (in basso) durante la transizione dalla fase pre-climaterica a quella climaterica del frutto di pesco in relazione alla loro funzione putativa. La funzione assegnata è quella indicata per il prodotto genico di Arabidopsis mostrante la più elevata identità di sequenza. Fig. 1 - Classification of ripening-induced (above) and -repressed (below) genes in peach fruit based on their putative function. The assigned function is that reported for the Arabidopsis product gene showing the highest sequence identity. 20 Approccio genomico a maturazione e qualità frutti repressi soprattutto nelle categorie riguardanti il metabolismo della parete e la risposta agli ormoni. Analizzando oltre 150.000 ESTs isolate da diversi tessuti di melo, Newcomb et al. (2006) hanno identificato numerosi geni che, sulla base della loro funzione putativa assegnata attraverso l’analisi comparativa con l’algoritmo BLASTx, potrebbero essere coinvolti nella modulazione di importanti caratteristiche durante la maturazione del frutto di questa specie: in particolare, sono stati individuati geni coinvolti nel metabolismo glucidico e nella biosintesi di aromi (esteri in particolare). Un elevato numero di ESTs sono state identificate in quanto coinvolte nella biosintesi di pigmenti attraverso sia la via del 5-deoxi-xilulosio (che porta alla sintesi dei carotenoidi) che quella dei flavonoidi (responsabile della produzione di antocianine). E’ stato evidenziato inoltre che tra le diverse famiglie dei fattori di trascrizione, quella MYB è la maggiormente rappresentata. cDNA-AFLP Un’altra tecnica di indagine indiretta del trascrittoma, usata per lo studio della maturazione dei frutti, è il cDNA-AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) che si basa sulla discriminazione dei cDNA ottenuti da un’ amplificazione selettiva di loro frammenti via PCR (Vos et al., 1995; Bachem et al., 1998). La tecnica cDNA-AFLP, appartenente alla più generale categoria dei metodi di Differential Display (DD), è stata applicata per studiare l’evoluzione del trascrittoma durante la maturazione di lampone (Jones et al., 2000), uva (Venter et al., 2001; Burger e Botha, 2004), fragola (Martelli et al., 2003), mela (Lin, 2005), e pesca (Ziliotto et al., 2005). Questa tecnica può essere implementata in presenza della sequenza dell’intero genoma della specie oggetto di studio. Volkmuth et al. (2003) hanno messo a punto un database di riferimento nel quale sono state catalogate le sequenze e l’abbondanza relativa dei frammenti cDNA-AFLP corrispondenti a trascritti identificati in diversi tessuti di piante di Arabidopsis cresciute in diverse condizioni ambientali. Nel caso dell’uva, questa tecnica è stata utilizzata per una migliore comprensione dei processi fisiologici che avvengono durante i processi di sovramaturazione e di appassimento controllato per la produzione di tipologie di vini che vanno dalle vendemmie tardive, ai passiti, ai vini dolci da dessert. La conoscenza degli eventi che avvengono nelle bacche durante questi processi è scarsa ed è limitata solamente al monitoraggio dei cambiamenti della composizione: in realtà, sia il processo di sovramaturazione che quello di disidratazione provocano profonde alterazioni del quadro metabolico con importanti conseguenze sulla composizione della bacca che si riflettono sulle caratteristiche dei vini. Sono state così comparate bacche di uva (cv Raboso Piave) alla vendemmia, staccate dopo ulteriori 7 giorni di permanenza sulla pianta, e mantenute per 7 giorni dopo la raccolta in fruttaio per una perdita di peso fresco del 15% circa (Tonutti e Bonghi, 2006). La tecnica, nelle due rispettive tesi, ha messo in luce la presenza di 92 e 82 geni differenzialmente espressi nelle bucce: in particolare, 51 geni sono risultati repressi e 41 indotti nelle bacche sottoposte ad appassimento, mentre 58 e 24 sono apparsi rispettivamente repressi e stimolati nelle bacche in sovramaturazione in pianta. Alcuni di questi (45 tra i repressi e 19 fra gli indotti) sono in comune fra i due tipi di trattamento ma altri sono specificamente modulati (in positivo o negativo) dall’appassimento in postraccolta e dal processo di sovramaturazione in pianta. Tra questi, è da rilevare la presenza di un gene codificante per isoflavone riduttasi che viene indotto in seguito a disidratazione i cui effetti potrebbero, quindi, rivelarsi importanti anche a livello dei rapporti quantitativi dei flavonoidi nella buccia con conseguenze non solo in termini organolettici sulle caratteristiche dei vini. Altri metodi diretti (es. SAGE, Serial Analysis of Gene Expression , e MPSS, Massively Parallel Segnature Sequencing) sono stati messi a punto per studi di profili di espressione ma, fino ad ora, non sono mai stati utilizzati per analizzare il trascrittoma di frutti durante lo sviluppo e la maturazione. Un primo approccio nell’utilizzo dell’MPSS in specie frutticole è stato recentissimamente messo in atto da Nakano et al. (2006) che hanno allestito un database MPSS in vite che potrà rivelarsi di grande utilità per la annotazione di geni identificati attraverso il completo sequenziamento del genoma di questa specie. Analisi del trascrittoma con metodi indiretti Microarray L’aumentata disponibilità di sequenze genomiche e di cDNA nonché l’accelerato sviluppo delle nanotecnologie applicate al settore biologico hanno consentito la messa a punto di tecniche ed approcci analitici di tipo miniaturizzato come i microarray, oramai ampiamente diffusi sia per gli studi di base che applicati anche nel settore vegetale (Renskin e Buell, 2005). Uno dei grandi vantaggi di questa tecnica è dato dalla possibilità di analizzare simultaneamente l’espressione di migliaia di geni attraverso due principali piattaforme sviluppate su supporti solidi, generalmente simili a vetrini da microscopio. Una prima tipo21 Tonutti et al. logia è rappresentata dai microarray sui quali vengono depositate le sonde di acidi nucleici che possono essere sia cDNA derivati da cloni presenti in specifiche librerie (Schena et al., 1995) sia oligonucleotidi sintetici (generalmente di 50-80 pb in lunghezza) corrispondenti a specifici geni (Kane et al., 2000). Una seconda tipologia è invece costituita dai Gene Chips (tecnologia Affimetrix Inc. USA) nei quali corte sequenze oligonucleotidiche (24-25 pb) vengono sintetizzate in situ sul supporto solido attraverso processi fotolitografici (Lipshutz et al., 1999). In generale gli oligonucleotidi hanno il vantaggio di possedere una più elevata specificità così da rendere possibile la distinzione tra trascritti che provengono da membri diversi di famiglie multigeniche soprattutto se le sequenze vengono selezionate in regioni con elevati gradi di dissimilarità (la regione 3’ UTR dell’ mRNA) (Kim et al., 2003). Tale discriminazione, tuttavia, non è sempre attuabile in quanto è richiesta un’ accurata annotazione dei geni possibile solo in presenza di sequenze di una certa dimensione e di buona qualità. Una caratteristica degli arrays sui quali vengono microdepositati i cDNA o gli oligonucleotidi è quella della elevata variabilità dei risultati delle ibridazioni, in genere più elevata rispetto a quella che si ottiene utilizzando i Gene Chips. Un’ulteriore fonte di variabilità, comune comunque ad entrambe le tecniche, è rappresentata dalla preparazione dell’RNA e dalla sintesi del cDNA da impiegare negli esperimenti di ibridazione. E’ quindi fondamentale effettuare diverse repliche per verificare la riproducibilità e la veridicità dei dati nonché utilizzare appropriati strumenti di elaborazione statistica. Successivamente alla pionieristica applicazione di questo strumento di indagine genomica sulla fragola, grazie alla quale è stato possibile isolare e caratterizzare il gene SAAT coinvolto nella biosintesi di aromi (Aharoni et al., 2000), un numero sempre maggiore di microarray è stato messo a punto ed utilizzato in diverse specie frutticole. La tabella 2 riporta, in sintesi, le più importanti caratteristiche dei microarray finora sviluppati e qui vengono descritti i risultati più interessanti ottenuti mediante il loro uti- Tab. 2 - Microarray contenenti sonde provenienti da diversi tessuti di piante con frutti carnosi e loro utilizzo nello studio dello sviluppo, maturazione e post-raccolta dei frutti. Tab. 2 - Available microarry platforms containing probes corresponding to transcripts isolated from different tissues and organs of fleshy fruit species and their use in fruit physiology studies. Descrizione Specie Piattaforma Sonde cDNA cDNA 6.875 2.200 Nessuna ricerca specifica per il frutto Contiene principalmente sonde provenienti dal frutto. Sviluppo e maturazione del frutto cDNA 1.701 Sonde da frutto maturo (red stage). Fragola Maturazione del frutto cDNA 1.800 Sonde da frutto maturo Melo cDNA 985 Contiene sonde da frutti freschi e conservati. Qualità in post-raccolta cDNA 1.364 Sonde da frutti in differenti fasi del ciclo Pero di sviluppo. Sviluppo, maturazione e post-raccolta del frutto oligo (70 mer) Operon 4.800 Principalmente dal frutto maturo. Pesco Maturazione del frutto e genomica comparativa in Rosales cDNA 12.899 Sonde da differenti tessuti della pianta. Sviluppo del frutto e genomica comparaPomodoro tive nelle Solanaceae e Rosales gene chip 10.000 Sonde da differenti tessuti della pianta Arancio oligo (70 mer) Operon 12.160 Sonde da differenti tessuti della pianta cDNA 4.608 Sonde da bacche mature. Sviluppo del frutto gene chip 15.700 Sonde da differenti tessuti di Vitis. Vite oligo (50 mer) MWG 3.200 Sonde da bacche in differenti fasi del Biotech ciclo di sviluppo. Sviluppo del frutto oligo (70 mer) Operon 14.562 Sonde da differenti tessuti di Vitis 22 Bibiliografia Origine sonde e processi fisiologici studiati Forment et al., 2005 Shimada et al., 2005 Aharoni et al., 2000 Rosati et al., 2004 van Wordragen et al. (2003) Fonseca et al., 2004 Trainotti et al., 2006 http://www.operon.com/arrays/oligosets_peach.php Alba et al., 2004 http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/tomato.affx http://www.operon.com/arrays/oligosets_Tomato.php Waters et al., 2005 http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/vitis.affx Terrier et al., 2005 http://www.operon.com/arrays/oligosets_grape.php 22 Approccio genomico a maturazione e qualità frutti lizzo nelle diverse specie frutticole nello studio della maturazione e della qualità dei frutti. Fragola Come sopra riportato, l’applicazione della tecnica microarray in questa specie ha consentito di caratterizzare funzionalmente il gene che codifica per alcool aciltransferasi (Aharoni et al ., 2000). Successivamente alla messa a punto di questo primo microchip che conteneva 1.700 sonde di cDNA da frutto maturo e che è stato utilizzato anche per studi sugli stress ossidativi e sull’azione delle auxine (Aharoni et al., 2002), e sulle relazioni tra achene e ricettacolo (Aharoni e O’Connell, 2002), non ci sono state sue ulteriori implementazioni. Un microarray contenente circa 1.800 sonde di cDNA sempre da frutto maturo è stato sviluppato in Italia da Carbone et al. (2005a) che hanno utilizzato genotipi coltivati nel tentativo di mettere in relazione i profili trascrizionali con le caratteristiche organolettiche come la consistenza, il colore e l’aroma ed identificare markers molecolari da utilizzare nella selezione di nuove varietà. Pomodoro In questa specie sono state messe a punto entrambe le tipologie di microarray (Gene Chip e vetrini microdepositati sia con sonde di cDNA che di oligonucleotidi). Il microarray TOM1 contenente 12.889 sonde di cDNA da frutto corrispondenti a circa 8.500 geni ha consentito di identificare 869 geni differenzialmente espressi durante le fasi finali dello sviluppo della bacca (da immatura a rosso matura, Alba et al., 2005). La mutazione di un recettore per l’etilene (Nr, Neverripe), che riduce la sensibilità all’etilene ed inibisce la maturazione, altera l’espressione del 37% di questi geni differenzialmente espressi e coinvolti nella evoluzione della forma del frutto e dello sviluppo dei semi, nonché nella biosintesi di carotenoidi. Questi risultati dimostrano che l’azione dell’etilene, almeno in pomodoro, non è confinata a processi collegati alla sindrome della maturazione. Il microarray TOM1 e analisi via RT-PCR sono anche stati utilizzati per delucidare le relazioni esistenti fra regime luminoso e pigmentazione del frutto. I risultati ottenuti da Carbone et al. (2005b) indicano che una forte induzione del citocromo del tipo A/F si verifica durante lo sviluppo della bacca di pomodoro è ciò sarebbe da porre in relazione con l’acquisizione della tipica pigmentazione (dovuta soprattutto all’accumulo di licopene) del frutto. Pesco Per questa specie è stato messo a punto da parte del Consorzio ESTree (ESTree Consortium, 2005) il primo microarray (µPEACH 1.0) contenente più di 4.800 oligonucleotidi (70meri) ciascuno corrispondente ad uno specifico unigene, così come indicato nel database dedicato (http://linuxbox.itb.cnr.it/ESTree/). Questa collezione di unigeni proviene da ESTs isolate a partire soprattutto da mesocarpo in diverse fasi di sviluppo (dalla S1 alla S4). Il microarray è stato fino ad ora utilizzato per studiare i cambiamenti dei profili trascrizionali durante la transizione del frutto da preclimaterico a climaterico (Trainotti et al., 2006): sono stati così identificati 267 geni indotti e 109 repressi durante questa transizione. Tra i geni differenzialmente espressi sono presenti quelli coinvolti nella biosintesi, percezione e trasduzione del messaggio dell’etilene. In particolare e come riportato graficamente in figura 2, oltre ad ACS (ACC sintetasi) e ACO (ACC ossidasi), fra i geni stimolati sono presenti Pp-ERS1 e PpETR2, che codificano per recettori dell’ormone gassoso e Pp-EIN2 che svolge un importante ruolo nei meccanismi di trasduzione del messaggio. Altri geni coinvolti nella percezione, nella trasmissione del segnale o nella regolazione dell’espressione di geni etilenedipendenti non sembrano, sulla base delle elaborazioni condotte, evidenziare marcate differenze nella evoluzione frutto immaturo/frutto maturo (fig. 2). Questi dati sono in fase di validazione attraverso specifiche analisi di espressione. Fra i geni più direttamente coinvolti nella modulazione di tratti qualitativi, sono stati identificati un nuovo gene codificante per pectinmetilesterasi e due per le espansine che quindi potrebbero partecipare al processo di rammollimento della polpa. Considerando l’evoluzione della pigmentazione, è stato individuato un gene (indotto a maturazione) codificante per β-carotene idrossilasi, responsabile della formazione di β-criptoxantina, il più abbondante carotenoide delle pesche. Di particolare interesse per sviluppi futuri di ricerche riguardanti i meccanismi di regolazione è l’individuazione di 19 fattori di trascrizione differenzialmente espressi da frutto pre-climaterico a frutto climaterico. Tra questi, 6 membri della famiglia Aux/IAA sono fortemente indotti e ciò confermerebbe l’importante ruolo giocato dalla interazione etilene-auxine nel controllo ed iniziazione del processo di maturazione. Sono anche stati individuati fattori appartenenti alle famiglie MADS-box e bZIP: come osservato in pomodoro ed uva (Fei et al., 2004) questi fattori sono indotti quando il frutto matura. 23 Tonutti et al. Fig. 2 - Espressioni relative (espresse nell’istogramma come logaritmo del rapporto tra le intensità di espressione) dei geni coinvolti nella biosintesi, percezione e traduzione del segnale dell’etilene (il cui ruolo è schematizzato sulla destra della figura) durante la transizione da frutto preclimaterico a frutto climaterico. Fig. 2 - Relative expression (bar chart on the left side expressed as log of mature/immature ratio) of genes involved in the biosynthesis, perception and signal transduction of ethylene (as shown in the scheme on the right side) during the transition from preclimacteric to climacteric stage. Agrumi Oltre a produrre un elevato numero di ESTs, il consorzio spagnolo (Spanish Citrus Consortium) ha messo a punto un microarray con 12.672 sonde di cDNA corrispondenti a 6.875 putativi unigeni espressi in parti diverse della pianta incluso il frutto di diverse specie di Citrus (Forment et al., 2005). Al momento non sono ancora stati pubblicati dati relativi all’utilizzo di questo microarray. Con un più ristretto numero di cDNA ottenuti da frutti della cv Fortune (C. cle mentina x C. reticulata) di mandarino e di arancio dolce è stato allestito un microarray utilizzato da Pons et al. (2005) per lo studio dei cambiamenti del trascrittoma nel flavedo in seguito ad esposizione, nella fase postraccolta, a temperature di 2 °C. I risultati evidenziano che un gruppo di geni è attivato in relazione allo stress termico e che profonde differenze sono visibili fra varietà che presentano diverse tolleranze alle basse temperature. In particolare, nei frutti che presentano evidenti danni da bassa temperatura risultano differentemente espressi, rispetto a frutti di varietà tolleranti a tale tipo di stress, geni coinvolti nel 24 metabolismo della parete cellulare e delle membrane, nella biosintesi di etilene e nella coniugazione dell’acido salicilico. Questi risultati appaiono molto promettenti nell’ottica di individuare un set di geni da utilizzare come marcatori nella selezione di nuove cultivar tolleranti alle basse temperature e per mettere a punto le migliori pratiche di conservazione. Utilizzando un microarray contenente 2.213 cDNA, Shimada et al. (2005) hanno disegnato una mappa trascrizionale di frutti di Citrus nei diversi tessuti osservando che sono presenti diverse dinamiche di regolazione di espressione genica in relazione al tipo di tessuto e alla fase di sviluppo. Melo Nonostante il grande numero di ESTs disponibili per tale specie solo pochi lavori sono stati pubblicati sull’utilizzo di microarray costruiti, tra l’altro, con una limitata quantità di sonde. Van Wordragen et al. (2003) hanno riportato i risultati riguardanti una correlazione fra profili di espressione genica e sviluppo della farinosità (mealiness) in conservazione nelle Approccio genomico a maturazione e qualità frutti mele Cox. Lo sviluppo di questa fisiopatia e la presenza di off-flavours sono stati messi in correlazione con specifici profili di espressione di specifici geni che potrebbero, di conseguenza, rivelarsi di estrema utilità per la gestione delle mele in postraccolta. Pero Una collezione di 1.364 cloni di cDNA ottenuti da due librerie di frutto di pero è stata utilizzata per allestire un microrray attraverso il quale sono stati studiati i cambiamenti dei profili di trascrizione nel corso dello sviluppo del frutto e durante la fase di conservazione (Fonseca et al., 2005). Centotrenta geni differenzialmente espressi sono stati raggruppati in cinque grandi gruppi sulla base del profilo comune di espressione. In linea generale appare che il più marcato cambiamento a carico del profilo del trascrittoma si verifica nella transizione dalla fase pre-climaterica a quella climaterica. Nell’ambito del gruppo V sono presenti geni che sembrano maggiormente coinvolti nel metabolismo postraccolta: questi geni codificano soprattutto per proteine di difesa e coinvolte in vie ossidative. Di particolare interesse appare il fatto che geni responsabili di tratti aromatici risultano espressi principalmente nei frutti staccati dalla pianta madre. Vite Un notevole fermento di indagini di tipo genomico riguarda il genere Vitis. Sono state prodotte diverse piattaforme sia come A r r a y microdepositati con cDNA e oligonucleotidi (50 e 70 meri) sia del tipo Gene Chip. Per quanto riguarda gli arrays microdepositati, sia quello con sonde di cDNA (4.608) sia quello con oligonucleotidi (50meri) (3.200) sono rappresentativi di mRNA espressi durante lo sviluppo del frutto (Terrier et al., 2005; Waters et al., 2005). L’utilizzo dei due diversi microarrays ha portato a risultati simili e comparabili, come evidenziato dai dati di espressione riguardanti la via biosintetica delle antocianine. In tale via, infatti, alcuni geni (quali, ad esempio, chalcone sintetasi, F3-idrossilasi, antocianidina riduttasi) evidenziano la presenza di due picchi di espressione: uno presente in corrispondenza delle prime fasi di sviluppo della bacca (2 settimane dopo la fioritura), l’altro che si manifesta all’inizio della maturazione. La precoce espressione di questi geni suggerisce che, in corrispondenza delle fasi iniziali di sviluppo della bacca, la via biosintetica dei flavonoidi sia attivata probabilmente a favore della produzione di proantocianidine e tannini il cui accumulo comincia precocemente (pea stage) (Kennedy et al., 2001). Il microarray Grape ArosV1 (con sonde di oligonucleotidi 70meri) è stato utilizzato per lo studio degli effetti di trattamenti con acido 2-cloroetilfosfonico (2-CEPA) all’invaiatura e di etilene in postraccolta sui profili di trascrizione in buccia: risultati preliminari (Tonutti et al., dati non pubblicati) mettono in luce che, nonostante la bacca di V. vinifera sia non climaterica, la trascrizione di un certo numero di geni viene indotta dal trattamento postraccolta. Tra questi geni sono presenti alcuni che operano nelle diverse tappe della biosintesi e del metabolismo dei polifenoli, in generale, e dei flavonoidi, in particolare. Tra quelli indotti, sono inoltre identificabili geni la cui azione è riconducibile alla alterazione della struttura ed architettura delle pareti e alla modifica della permeabilità delle membrane. I microarray sono stati anche utilizzati per studi di tipo comparativo: nonostante le diversità di tipo botanico e/o fisiologico spesso presenti fra la specie che ha originato le sonde e quella oggetto di studio, i risultati di questi approcci comparativi sono di notevole interesse soprattutto per la possibilità di individuare possibili meccanismi comuni di regolazione di specifici processi. Utilizzando il microarray TOM1, Moore et al. (2005) hanno allargato il campo di indagine genomica a livello di altri frutti delle Solanacee quali il peperone e la melanzana. Questi autori hanno identificato alcuni gruppi di ESTs che rappresentano markers ortologhi, in quanto espressi similmente durante lo sviluppo dei frutti, o che regolano diversi processi nelle tre specie analizzate. Per quanto riguarda geni che presentano un profilo di espressione comune in pomodoro, melanzana e peperone durante la maturazione, ne sono stati identificati solo 2 indotti e 5 repressi. Restringendo l’analisi comparativa a due specie per volta, è stato evidenziato che sono presenti più geni con andamenti di espressione comuni fra pomodoro e peperone rispetto alle altre due combinazioni (pomodoro/melanzana e melanzana/peperone). L’analisi dei trascritti coinvolti nella struttura e funzionalità dei plastidi ha evidenziato importanti differenze fra melanzana da un lato e peperone e pomodoro dall’altro. Come prevedibile, trascritti coinvolti nella biosintesi e percezione dell’etilene sono prevalenti in pomodoro (frutto climaterico) rispetto ai due frutti di tipo non climaterico. Lo stesso microarray è stato impiegato per comparare profili trascrizionali di mela, uva e pesca (Ziliotto et al., 2004): tra i 22 geni appartenenti alla famiglia MADS-box presenti nel microarray TOM1, due possono essere considerati come fattori comuni di regolazione. Di questi, uno è associato positivamente mentre l’altro negativamente al processo di maturazione: il primo, che presenta una elevata omologia con il gene AGL62 di Arabidopsis, 25 Tonutti et al. aumenta la trascrizione durante la maturazione dei soli frutti climaterici (pomodoro, pesca e mela), mentre il secondo, omologo a FBP24 di petunia è represso sia nei frutti climaterici sia in quello non climaterico (uva). Ponce-Valadez et al. (2005) hanno effettuato specifiche ibridazioni del microarray TOM1 per studiare l’effetto di tecniche di conservazione postraccolta ed, in particolare, di elevate concentrazioni di CO 2, su cambiamenti del trascrittoma potenzialmente associabili all’evoluzione di sostanze volatili in due cultivar di fragola. I risultati ottenuti mettono in luce le profonde differenze esistenti fra le due cultivar in termini di profili di trascrizione in relazione al mantenimento in condizioni di elevata CO2: alcuni geni differenzialmente espressi sono stati identificati ed isolati per successive analisi funzionali. Considerando che un’ analisi incrociata tra ESTs indotte a maturazione in uva e pesca ha messo in luce la presenza di diversi geni espressi, in questa fase di sviluppo, in entrambi i frutti (Bonghi et al., 2005), è stata effettuata un’ibridazione del microarray µPEACH1.0 per studiare i cambiamenti del profilo trascrizionale che avvengono nelle bucce delle bacche d’uva da vino sottoposte a parziale disidratazione (circa il 15% di perdita peso fresco) in postraccolta. I geni che hanno evidenziato espressione differenziale in bucce di bacche disidratate e non disidratate sono stati raggruppati in categorie funzionali e riportati graficamente in figura 3. Alcuni di questi appartengono alle categorie funzionali dello stress/difesa e della trasduzione del segnale e ciò indicherebbe l’attivazione di specifiche vie metaboliche con possibili conseguenze sulla composizione della buccia. Di particolare interesse appaiono alcuni geni repressi durante il processo di disidratazione: tra questi, il gene denominato Snakin1 che codifica per una proteina che, in patata, è stata positivamente associata alla resistenza a diversi tipi di patogeni tra cui la Botrite (Segura et al., 1999). Se questo comportamento dovesse essere confermato anche nell’uva per la quale la Botrite, com’è noto, rappresenta una delle più importanti cause di Fig. 3 - Espressioni relative (calcolate come log del rapporto fra le intensità di espressione misurate in bacche d’uva disidratate e fresche) dei geni corrispondenti alle sonde depositate sul microarray µPEACH1.0 mostranti variazioni significative (log>1 e <1) durante il processo di appassimento (calo peso del 10% circa). I geni sono stati raggruppati sulla base della loro funzione putativa assegnata come indicato in figura 1. Fig. 3 - Relative expression (log of the ratio between transcript accumulation in dehydrated and freshly harvested grape berries) of genes corresponding to probes spotted on µPEACH1.0 microarray showing significant changes (log>1 or <1) during dehydration (weight loss about 10%). Genes have been grouped according to their putative function assigned as reported in figure 1. 26 Approccio genomico a maturazione e qualità frutti perdita di prodotto, l’espressione di questo gene potrebbe essere utilizzata come indicatore per stabilire il grado di resistenza/suscettibilità all’attacco del patogeno e l’attitudine delle diverse tipologie di uva all’appassimento. Prospettive future Oltre alla necessità di implementare le banche dati di sequenze (trascritte e non), l’impetuoso sviluppo delle tecniche di genomica e la loro sempre più ampia diffusione per lo studio dei meccanismi di regolazione che stanno alla base dei processi tipici della maturazione e dell’acquisizione dei tratti qualitativi rende necessario l’ampliamento delle conoscenze relative ai processi post-trascrizionali per una migliore comprensione e valutazione delle relazioni esistenti fra i livelli di mRNA e le corrispondenti proteine. In tale contesto, lo sviluppo della proteomica è complementare a quello della trascrittomica e risulterà di grande utilità per colmare le lacune conoscitive esistenti fra la sequenza del DNA genomico e lo stato biologico del sistema oggetto di studio (Rose et al., 2004). Lo studio della maturazione dei frutti si avvantaggerà dalla più ampia utilizzazione di tecniche quali elettroforesi bidimensionali e DIGE (2D Differential In-Gel Electrophoresis) nonché dallo sviluppo della metabolomica, disciplina ancora agli albori, ma che, presumibilmente potrà trovare un fertilissimo campo di applicazione nel settore delle scienze frutticole. Riassunto L’utilizzo di approcci e strumenti genomici applicati al settore vegetale si sta espandendo velocemente anche per lo studio della maturazione dei frutti carnosi e delle basi biologiche della qualità. In seguito all’isolamento di ESTs da diverse tipologie di frutto, sono state effettuate analisi di espressione digitale che, assieme alla tecnica del cDNA-AFLP, hanno consentito di individuare geni coinvolti nel processo di maturazione sia in frutti climaterici che non climaterici. Un importante contributo nel settore della genomica funzionale applicata al settore frutticolo sta giungendo dalla tecnica dei microarray: in numerose specie da frutto sono infatti disponibili questi supporti con un più o meno elevato numero di sonde corrispondenti a geni espressi nei diversi tessuti dei frutti e/o in diversi stadi di sviluppo. Parole chiave: espressione genica, trascrittoma, ESTs, microarray, profili di trascrizione. Bibliografia AHARONI A., K EIZER L.C., B OUWMEESTER H.J., S UN Z., A LVAREZHUERTA M., V ERHOEVEN H.A., B LAAS J., V AN HOUWELINGEN A.M., DE VOS R.C., VAN DER VOET H., J ANSEN R.C., GUIS M., M O L J., D A V I S R.W., S C H E N A M., V A N T U N E N A . J . , O’CONNELL A.P., 2000. Identification of the SAAT gene invol ved in strawberry flavour biogenesis by use of DNA microar rays. Plant Cell 5: 647-662. 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