Utilizzo dei microarray per lo studio dell`espressione genica e della
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Università di Pisa Utilizzo dei microarray per lo studio dell’espressione genica e della variabilità genetica individuale Silvia Pellegrini, Erika Melissari Dipartimento di Patologia Sperimentale, BMIE Laboratorio Microarray Genoma L’insieme di tutte le molecole di DNA presenti nel nucleo di ogni cellula Nell’uomo: 44 cromosomi autosomici 2 cromosomi sessuali gene della beta-globina umana 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 // ccctgtggag ccagggctgg aactgtgttc tctgccgtta ggcaggttgg ggagacagag ttttcccacc tggggatctg gaaagtgctc tgccacactg gagtctatgg taggaagggg agtgtggaag cttttgttta atgccttaac aaaaaacttt catattcata catatttatg taattttgca cttatttcta tgcctctttg tatttctgca gctaatagca ggattattct tcccacagct tcaccccacc cccacaagta tccctaagtc gcctaataaa tactaaaaag caaaccttgg gctaatgcac ttcttgtaga ttgttttagc tcagccttga ccacacccta gcataaaagt actagcaacc ctgccctgtg tatcaaggtt aagactcttg cttaggctgc tccactcctg ggtgccttta agtgagctgc gacccttgat agaagtaaca tctcaggatc attcttgctt attgtgtata acacagtctg atctccctac ggttaaagtg tttgtaattt atactttccc caccattcta tataaatatt gctacaatcc gagtccaagc cctgggcaac agtgcaggct tcactaagct caactactaa aaacatttat ggaatgtggg gaaaatacac attggcaaca ggcttgattt tgtcctcatg ct gggttggcca cagggcagag tcaaacagac gggcaaggtg acaagacagg ggtttctgat tggtggtcta atgctgttat gtgatggcct actgtgacaa gttttctttc gggtacagtt gttttagttt tctttttttt acaaaaggaa cctagtacat tttattttct taatgtttta taaaaaatgc taatctcttt aagaataaca tctgcatata agctaccatt taggcccttt gtgctggtct gcctatcaga cgctttcttg actgggggat tttcattgca aggtcagtgc tatatcttaa gcccctgatg gcaggttaaa aatgtctttt atctactccc ccatctattg accatggtgc aacgtggatg tttaaggaga aggcactgac cccttggacc gggcaaccct ggctcacctg gctgcacgtg cccttctttt tagaatggga cttttatttg tcttctccgc atatctctga tactatttgg tttattttta atatgtgtac tttcttcttt ctttcagggc gtgataattt aattgtaact ctgcttttat tgctaatcat gtgtgctggc aagtggtggc ctgtccaatt attatgaagg atgatgtatt atttaaaaca actccatgaa cctatgcctt gttttgctat cactacccat aggagcaggg cttacatttg acctgactcc aagttggtgg ccaatagaaa tctctctgcc cagaggttct aaggtgaagg gacaacctca gatcctgaga ctatggttaa aacagacgaa ctgttcataa aatttttact gatacattaa aatatatgtg attgatacat acatattgac taatatactt aataatgata ctgggttaag gatgtaagag tttatggttg gttcatacct ccatcacttt tggtgtggct tctattaaag gccttgagca taaattattt taaagaaatg agaaggtgag attcatccct gctgtatttt ttgcttatcc agggcaggag cttctgacac tgaggagaag tgaggccctg ctgggcatgt tattggtcta ttgagtcctt ctcatggcaa agggcacctt acttcagggt gttcatgtca tgattgcatc caattgtttt attatactta gtaacttaaa tgcttatttg aatcattata caaatcaggg ttttgtttat caatgtatca gcaatagcaa gtttcatatt ggataaggct cttatcttcc ggcaaagaat aatgccctgg gttcctttgt tctggattct ctgaatattt atgagctgtt gctgcaacca cagaaaagga acattactta tgcatctctc Il contenuto di informazioni del DNA umano è dato dall’alternanza di 4 lettere A, G, T, C DNA RNA Proteine In ogni istante della propria vita ogni cellula umana contiene: • 20.000 geni • 10-15.000 mRNA diversi • >100.000 proteine diverse Il codice genetico Trascrittoma Insieme degli RNA messaggeri che la cellula sta esprimendo Proteoma Collezione completa delle proteine che la cellula sta esprimendo Analisi del trascrittoma analisi dei profili globali di espressione genica a livello di mRNA Espressione genica differenziale: valuta le differenze nell’espressione genica tra due trascrittomi cellule trattate con un composto esogeno a confronto con cellule non trattate un tessuto tumorale a confronto con uno sano Composto esogeno Tecnologia dei microarray Sfrutta la capacità di una data molecola di mRNA di ibridizzare con il DNA stampo da cui è stata generata campione controllo RNA Cy5 cDNA Cy3 Acquisizione dell’immagine mediante scanner Cy3 Cy5 Microarray ad oligonucleotidi Agilent Whole Genome Human 44k 60meri sintetizzati sul vetrino mediante inkjetting 41000 trascritti Rat 44k 60meri 41000 trascritti Yeast (S. cerevisiae) 2x44k 60meri 6256 trascritti L’intensità della fluorescenza è proporzionale alla quantità di molecola target nella soluzione e, quindi, costituisce una stima della quantità di RNA espresso dalla cellula. A caccia di geni nell’uomo Ricerca di alleli di suscettibilità su geni candidati T A TG A T T G C C G C T A G G Non siamo tutti uguali… Non esiste un’unica sequenza del genoma umano, ma più di 10 milioni dei 3 miliardi di paia di basi che compongono il genoma umano variano da individuo a individuo e costituiscono dei polimorfismi genetici. Polimorfismi genetici Forme alleliche diverse di una stessa sequenza presenti in più dell’1% degli individui di una popolazione SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Polimorfismi a singolo nucleotide ovvero cambiamenti di una base Variazioni di una base nella regione codificante di un gene portano ad un’alterazione della sequenza aminoacidica della proteina corrispondente con possibile cambiamento funzionale I polimorfismi possono essere responsabili di una diversa suscettibilità alle malattie… …come pure della variabilità individuale nella risposta alla terapia farmacologica I polimorfismi rappresentano fattori di suscettibilità, ciascuno dei quali contribuisce in una certa misura al fenotipo Come si fa ad identificare gli alleli di suscettibilità? studi di associazione casi-controlli Popolazione con malattia A T TG C AT G C C A G T A G G Genotipizzazione di SNP in geni candidati Popolazione senza malattia SNP T A TG AT T G C C G C T A G G Molecular Inversion Probes (MIP) on tagged array-of arrays metodica high-throughput flessibile aperta Banèr et al., 2003; Hardenbol et al., 2003; Pastinen et al., 2000 Trattamento con antidepressivi solo il 60-65% dei pazienti risponde al trattamento con i farmaci antidepressivi il 35-40% dei pazienti non risponde e in alcuni casi si verificano reazioni avverse anche gravi STEP DEL PROGETTO >> Individuare geni candidati ad essere associati al metabolismo o al meccanismo di azione degli antidepressivi PubMed OMIM >> Individuare polimorfismi su questi geni da utilizzare per lo studio di associazione PubMed SNP database NCBI HapMap HapMap project http://www.hapmap.org Selezione dei geni candidati Metabolismo epatico (4 geni) Array farmacocinetico (42 SNP) Trasporto (1 gene) Interazione con molecole bersaglio (9 geni) Regolazione della sopravvivenza neuronale, neurogenesi e arborizzazione dendritica (7 geni) Array farmacodinamico (100 SNP) Creazione di un test molecolare
