Università di Pisa
Utilizzo dei microarray per lo studio
dell’espressione genica e della variabilità genetica
individuale
Silvia Pellegrini, Erika Melissari
Dipartimento di Patologia Sperimentale, BMIE
Laboratorio Microarray
Genoma
L’insieme di tutte le molecole di DNA
presenti nel nucleo di ogni cellula
Nell’uomo: 44 cromosomi autosomici
2 cromosomi sessuali
gene della beta-globina umana
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
//
ccctgtggag
ccagggctgg
aactgtgttc
tctgccgtta
ggcaggttgg
ggagacagag
ttttcccacc
tggggatctg
gaaagtgctc
tgccacactg
gagtctatgg
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agtgtggaag
cttttgttta
atgccttaac
aaaaaacttt
catattcata
catatttatg
taattttgca
cttatttcta
tgcctctttg
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gctaatagca
ggattattct
tcccacagct
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cccacaagta
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tactaaaaag
caaaccttgg
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tcagccttga
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tccactcctg
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gacccttgat
agaagtaaca
tctcaggatc
attcttgctt
attgtgtata
acacagtctg
atctccctac
ggttaaagtg
tttgtaattt
atactttccc
caccattcta
tataaatatt
gctacaatcc
gagtccaagc
cctgggcaac
agtgcaggct
tcactaagct
caactactaa
aaacatttat
ggaatgtggg
gaaaatacac
attggcaaca
ggcttgattt
tgtcctcatg
ct
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cagggcagag
tcaaacagac
gggcaaggtg
acaagacagg
ggtttctgat
tggtggtcta
atgctgttat
gtgatggcct
actgtgacaa
gttttctttc
gggtacagtt
gttttagttt
tctttttttt
acaaaaggaa
cctagtacat
tttattttct
taatgtttta
taaaaaatgc
taatctcttt
aagaataaca
tctgcatata
agctaccatt
taggcccttt
gtgctggtct
gcctatcaga
cgctttcttg
actgggggat
tttcattgca
aggtcagtgc
tatatcttaa
gcccctgatg
gcaggttaaa
aatgtctttt
atctactccc
ccatctattg
accatggtgc
aacgtggatg
tttaaggaga
aggcactgac
cccttggacc
gggcaaccct
ggctcacctg
gctgcacgtg
cccttctttt
tagaatggga
cttttatttg
tcttctccgc
atatctctga
tactatttgg
tttattttta
atatgtgtac
tttcttcttt
ctttcagggc
gtgataattt
aattgtaact
ctgcttttat
tgctaatcat
gtgtgctggc
aagtggtggc
ctgtccaatt
attatgaagg
atgatgtatt
atttaaaaca
actccatgaa
cctatgcctt
gttttgctat
cactacccat
aggagcaggg
cttacatttg
acctgactcc
aagttggtgg
ccaatagaaa
tctctctgcc
cagaggttct
aaggtgaagg
gacaacctca
gatcctgaga
ctatggttaa
aacagacgaa
ctgttcataa
aatttttact
gatacattaa
aatatatgtg
attgatacat
acatattgac
taatatactt
aataatgata
ctgggttaag
gatgtaagag
tttatggttg
gttcatacct
ccatcacttt
tggtgtggct
tctattaaag
gccttgagca
taaattattt
taaagaaatg
agaaggtgag
attcatccct
gctgtatttt
ttgcttatcc
agggcaggag
cttctgacac
tgaggagaag
tgaggccctg
ctgggcatgt
tattggtcta
ttgagtcctt
ctcatggcaa
agggcacctt
acttcagggt
gttcatgtca
tgattgcatc
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attatactta
gtaacttaaa
tgcttatttg
aatcattata
caaatcaggg
ttttgtttat
caatgtatca
gcaatagcaa
gtttcatatt
ggataaggct
cttatcttcc
ggcaaagaat
aatgccctgg
gttcctttgt
tctggattct
ctgaatattt
atgagctgtt
gctgcaacca
cagaaaagga
acattactta
tgcatctctc
Il contenuto di
informazioni del DNA
umano è dato
dall’alternanza di 4
lettere
A, G, T, C
DNA
RNA
Proteine
In ogni istante della propria vita ogni cellula umana contiene:
• 20.000 geni
• 10-15.000 mRNA diversi
• >100.000 proteine diverse
Il codice genetico
Trascrittoma
Insieme degli RNA messaggeri che
la cellula sta esprimendo
Proteoma
Collezione completa delle
proteine che la cellula sta
esprimendo
Analisi del trascrittoma
analisi dei profili globali di
espressione genica a livello di
mRNA
Espressione genica differenziale:
valuta le differenze
nell’espressione genica tra due
trascrittomi
cellule trattate con un composto
esogeno a confronto
con cellule non trattate
un tessuto tumorale
a confronto
con uno sano
Composto
esogeno
Tecnologia dei microarray
Sfrutta la capacità di una data
molecola di mRNA di ibridizzare
con il DNA stampo da cui è stata
generata
campione
controllo
RNA
Cy5
cDNA
Cy3
Acquisizione dell’immagine mediante scanner
Cy3
Cy5
Microarray ad oligonucleotidi
Agilent Whole Genome
Human
44k 60meri sintetizzati
sul vetrino mediante inkjetting
41000 trascritti
Rat
44k 60meri
41000 trascritti
Yeast (S. cerevisiae)
2x44k 60meri
6256 trascritti
L’intensità della fluorescenza è proporzionale alla
quantità di molecola target nella soluzione e, quindi,
costituisce una stima della quantità di RNA espresso
dalla cellula.
A caccia di geni nell’uomo
Ricerca di alleli di suscettibilità su geni candidati
T A TG A T T G C C G C T A G G
Non siamo tutti uguali…
Non esiste un’unica sequenza
del genoma umano, ma
più di 10 milioni dei 3 miliardi di
paia di basi
che compongono il genoma
umano variano da individuo a
individuo e costituiscono dei
polimorfismi genetici.
Polimorfismi genetici
Forme alleliche diverse di una stessa sequenza presenti in
più dell’1% degli individui di una popolazione
SNP
(Single Nucleotide Polymorphism)
Polimorfismi a singolo nucleotide
ovvero cambiamenti di una base
Variazioni di una base nella regione codificante di un gene portano
ad un’alterazione della sequenza aminoacidica della proteina
corrispondente con possibile cambiamento funzionale
I polimorfismi possono essere
responsabili di una diversa
suscettibilità alle malattie…
…come pure della variabilità
individuale nella risposta alla
terapia farmacologica
I polimorfismi rappresentano
fattori di suscettibilità, ciascuno
dei quali contribuisce in una certa
misura al fenotipo
Come si fa ad identificare gli
alleli di suscettibilità?
studi di associazione casi-controlli
Popolazione con malattia
A T TG C AT G C C A G T A G G
Genotipizzazione di
SNP in geni candidati
Popolazione senza malattia
SNP
T A TG AT T G C C G C T A G G
Molecular Inversion Probes (MIP) on tagged array-of arrays
metodica high-throughput
flessibile
aperta
Banèr et al., 2003; Hardenbol et al., 2003; Pastinen et al., 2000
Trattamento con antidepressivi
solo il 60-65% dei pazienti risponde al
trattamento con i farmaci antidepressivi
il 35-40% dei pazienti non risponde e in
alcuni casi si verificano reazioni
avverse anche gravi
STEP DEL PROGETTO
>> Individuare geni candidati ad essere associati al metabolismo o
al meccanismo di azione degli antidepressivi
PubMed
OMIM
>> Individuare polimorfismi su questi geni da utilizzare per lo
studio di associazione
PubMed
SNP database NCBI
HapMap
HapMap project
http://www.hapmap.org
Selezione dei geni candidati
Metabolismo epatico (4 geni)
Array farmacocinetico (42 SNP)
Trasporto (1 gene)
Interazione con molecole bersaglio (9 geni)
Regolazione della sopravvivenza
neuronale, neurogenesi e
arborizzazione dendritica (7 geni)
Array farmacodinamico (100 SNP)
Creazione di un test molecolare
