I marcatori genetici - Scuola di Specializzazione in Tecnologia e

IL MIGLIORAMENTO
GENETICO ANIMALE E
LA GENETICA
MOLECOLARE
Il miglioramento genetico delle produzioni animali,
realizzato sino ad ora, è frutto dell’elaborazione e
applicazioni della teoria della genetica quantitativa
alle popolazioni animali di interesse zootecnico.
¾ Schemi operativi di selezione basati sui L.G. e controlli
funzionali
¾ Diffusione I.S.
¾ Modelli statistici sofisticati
¾ 1900: con la riscoperta delle Leggi di Mendel si inizia a
comprendere la natura genetica della trasmissione dei
caratteri
¾ 1900: Galton introduce il procedimento statistico per lo
studio dell’eredità dei caratteri quantitativi
¾ 1918: Fisher attua il collegamento tra la genetica
mendeliana
e
l’approccio
statistico
della
scuola
biometrica ponendo le basi della moderna teoria della
genetica quantitativa
LA TEORIA DELLA GENETICA QUANTITATIVA
I caratteri quantitativi sono ad eredità poligenica e la
variazione continua è dovuta all’azione degli alleli di
numerosi loci distribuiti nel genoma degli animali e agli
effetti dei fattori ambientali.
I singoli geni e alleli esercitano su questi caratteri
effetti molto piccoli e di tipo additivo.
NON
è
possibile
conoscere
direttamente dal FENOTIPO.
Modelli matematico-statistici
genetico dei riproduttori.
per
il
GENOTIPO
stima
valore
Nell’allevamento animale il miglioramento genetico è
attuato con:
¾ selezione: sfrutta la variabilità genetica additiva e
consente di ottenere un miglioramento cumulativo
permanente e trasmissibile. Miglioramento razze
animali.
¾ incrocio: utilizza la variabilità non additiva che sta
alla base dell’eterosi e non è trasmissibile. Migliora
le produzioni.
La selezione fenotipica è efficace per caratteri produttivi:
- si manifestano precocemente
- facilmente misurabili
- si esprimono in entrambi i sessi
- non sono troppo influenzati da fattori ambientali
In tal caso:
- elevata intensità di selezione
- buona accuratezza stima valore genetico degli animali
- brevi intervalli di generazione
quindi rapido progresso genetico.
Pochi i caratteri produttivi con tali caratteristiche.
Frequenti i caratteri che:
- si esprimono in un solo sesso (uova, latte)
- si evidenziano tardi (problemi articolari)
- si evidenziano dopo macellazione (spessore lardo,
tagli magri, qualità della carne)
- sono difficili da misurare (resistenza alle malattie,
indice di conversione alimentare)
- sono particolarmente influenzati da fattori
ambientali (fertilità e resistenza alle malattie)
- ereditabilità molto bassa
La
GENETICA
problemi
perché
MOLECOLARE
fornisce
gli
supera
questi
strumenti
per
analizzare la variabilità genetica quantitativa
direttamente a livello del DNA.
A tal fine è necessario trovare marcatori del
DNA che siano associati a geni che codificano
caratteri di interesse selettivo.
I MARCATORI GENETICI
m1
m2
m1
m2
m3
m3
Sono porzioni di DNA:
non codificanti
distribuiti uniformemente sul genoma
ad eredità mendeliana semplice
TIPI di MARCATORI GENETICI
..rilevabili a vari livelli
MORFOLOGICO o SOMATICO:
colore del mantello
BIOCHIMICO:
gruppi sanguigni
proteine (del plasma, del latte etc.)
DNA:
SNP, RFLP, AFLP, RAPD, microsatelliti,……
MARCATORI BIOCHIMICI E IMMUNOLOGICI
1961: Neimann-Sorensen e Robertson studiarono
l’associazione
tra
gruppi
sanguigni
e
diversi
caratteri produttivi nei bovini da latte.
Questi studi non ebbero molto successo per il
limitato numero di marcatori disponibili e per
l’utilizzo
di
popolazioni
animali
appropriato disegno sperimentale.
senza
un
I MARCATORI del DNA
Caratteristiche favorevoli
Non influenzati dall’ambiente
Neutrali
Stabili
Numerosi
Polimorfici (sequenze non codificanti)
Campioni di qualsiasi tessuto
Analisi indipendenti da sesso ed età
Facili da monitorare
Analisi automatizzabili
RFLP
(Restriction Fragment Length Ploymorphism)
Sono stati i primi marcatori ad essere utilizzati
(1978). Molto frequenti e distribuiti su tutto il genoma
animale erano ideali per costruire mappe gentiche ed
identificare loci responsabili della variabilità genetica
quantitativa (Quantitative Trait Loci – QTL).
Non hanno trovato larga applicazione perché il metodo
di identificazione (Southerm Blotting) è lungo e
laborioso e
alleli.
perché, in genere, presentano solo due
VNTR o Minisatelliti
(Variable Number of Tandem Repeats)
Identificati nel 1987, presentano un alto numero
di alleli, però presentano le stesse difficoltà di
individuazione degli RFLP.
Insieme agli RFLP sono stati utilizzati nelle prime
fasi di costruzione delle mappe genetiche.
SSR o MICROSATELLITI
(Simple Sequence Repeats - 1989)
Ripetizioni in tandem di corte (1-5) sequenze di nucleotidi:
(AC)n o
di-
(GT)n o
di-
(CAC)n o
tri-
(GATA)n
tetra- nucleotidi
distribuite nel genoma animale in numero elevatissimo in
regioni anonime (non hanno funzione nota).
Il polimorfismo è molto elevato e deriva dal numero di
ripetizioni (n) del motivo di base del microsatellite.
Sono conservati entro specie e
risultano essere specie-specifici.
Microsatelliti o SSR
(Simple Sequence Repeats)
Visualizzazione microsatelliti
1) ESTRAZIONE DEL DNA
Sangue
Peli
Seme
DNA
2) PCR POLYMERASE CHAIN REACTION
Individuo A
3 paia di
cromosomi
omologhi
3) ELETTROFORESI
Individuo B
Individuo C
campione di controllo
ALTRI MARCATORI GENETICI
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA 1990) identificano marcatori per mezzo di corti
oligonucleotidi come inneschi nella PCR.
Sono marcatori dominanti, a differenza degli RFLP
e
dei
microsatelliti
codominanti,
e
non
che
sono
presentano
in
genere
un’altissima
riproducibilità perché influenzati dalle ondizioni di
analisi.
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphics 1995) combinano l’analisi di restrizione con la PCR
e permettono, utilizzando diverse combinazioni di
enzimi
e
primers,
di
analizzare
contemporaneamente un elevato numero di loci.
SNP
(Single Nucleotide Polymorphisms)
Variazioni di singole basi
GAT CAG TTC GAT GTC
GAT CAG TTA GAT GTC
Frequenza elevata (polimorfismi da mutazioni
puntiformi una ogni 500-3000 nucleotidi)
Distribuiti in modo casuale
APPLICAZIONI DEI MARCATORI
NEL SETTORE ZOOTECNICO
• Costruzione di mappe genetiche e fisiche
• Mappatura ed isolamento di geni utili
• Mappatura di QTL
• Diagnosi di anomalie genetiche
• Analisi di paternità
• Studi su filogenesi, variabilità genetica, struttura
e dinamica di specie e popolazioni
• Stima della consanguineità e ausilio ai piani di
accoppiamento
• Tracciabilità dei prodotti
MAPPE GENETICHE
Il genoma degli animali è costituito da un diverso numero di
paia di autosomi e da un paio di cromosomi sessuali con un
contenuto di DNA di circa 3 miliardi di nucleotidi nei
mammiferi e 1,2 miliardi per le specie avicole.
Il DNA codifica per circa 20.000-30.000 geni, i quali
rappresentano solo il 4% del DNA contenuto nel genoma.
Quindi i geni sono dispersi in regioni del DNA che non
hanno funzione codificante.
Numero di cromosomi e contenuto in DNA stimato per
alcune specie di interesse zootecnico
SPECIE
N. Cromosomi
2n
Bovino
Suino
Pecora
Capra
Cavallo
Coniglio
Pollo
Tacchino
60
38
54
60
64
44
78
80
Dimensione stimata del
genoma in nucleotidi
(paia di basi)
3.651.500.000
3.108.700.000
3.251.800.000
3.197.600.000
3.311.000.000
3.496.000.000
1.200.000.000
1.200.000.000
Durante la meiosi si
verifica lo scambio di
materiale genetico
fra cromosomi
omologhi.
Se due marcatori
sono lontani è più
probabile che un
evento di scambio li
separi.
Se sono vicini è più
facile che rimangano
assieme.
Andando a rilevare quante volte, dopo la meiosi, si ha o meno
separazione dei due marcatori si può stimare la loro distanza
reciproca e quindi costruire una mappa.
Esempio di mappa di linkage
Si può quindi definire un’unità di mappa
1% di ricombinazione genica=distanza di 1 centimorgan (cM).
BOVMAP
(Progetto per la mappatura del genoma bovino)
1) Vi partecipano 32 gruppi europei finanziati dalla UE
2) Obiettivo: definire una mappa di marcatori genetici
specifici per il bovino (utilizza tutti i tipi di
marcatori)
3) Scopo della mappa è studiare l’associazione tra
marcatori e caratteri QTL e/o ETL
BOVMAP (INRA)
(Progetto per la mappatura del genoma bovino)
Loci: 4357
Loci mappati: 4122
Geni: 1557
Geni mappati: 1506
Microsatelliti: 2402
Microsatelliti mappati: 2241
QTLs: 46
HORSEMAP (INRA)
(Progetto per la mappatura del genoma equino)
Loci: 2409
Loci mappati: 2134
Geni: 771
Geni mappati: 752
Microsatelliti: 1521
Microsatelliti mappati: 1269
SHEEPMAP
(Progetto per la mappatura del genoma ovino)
Loci: 2030
Geni: 543
Microsatelliti: 2257
PIGMAP
(Progetto per la mappatura del genoma suino)
Loci: 4081
Microsatelliti: 1673
Geni: 1588
PERCHÉ È IMPORTANTE
MAPPARE IL GENOMA?
1) Studio
dell’organizzazione,
regolazione
ed
espressione dell’insieme di geni nel genoma.
2) Selezione
Assisted
assistita
Selection
da
-
marcatori
MAS):
(Marker
identificazione
dell’associazione tra marcatori e QTL /o ETL
(Economic Trait Loci) per una selezione più
efficiente
3) Clonaggio di posizione: identificare e clonare un
gene responsabile per un ETL.
MAS
(Marker Assisted Selection)
I marcatori genetici possono essere usati per ricercare
associazioni con i singoli loci che contribuiscono ai
caratteri quantitativi di importanza economica (QTL e
ETL.)
L’individuazione di associazione di questo tipo permette di
frazionare un carattere quantitativo a variazione continua
in un certo numero di loci mendeliani a variazione
discontinua, chiaramente identificabili, e di attuare una
selezione assistita da marcatori.
Infatti se un allele di un locus ad effetto quantitativo e un
marcatore sono geneticamente associati, saranno trasmessi
dai genitori ai figli in modo congiunto.
Pertanto utilizzando gli alleli dei marcatori per il carattere
in selezione si potranno scegliere gli animali portatori delle
varianti più favorevoli.
La MAS può influire favorevolmente su tutti i fattori che
determinano il progresso genetico (accuratezza della
selezione,
intensità
generazione).
della
selezione
e
intervallo
di
La MAS può aumentare l’efficacia della seleziona attuata
solo sulla base delle performance, soprattutto per
caratteristiche che si esprimono in un solo sesso
(produzione latte, numero di nati) o difficilmente misurabili
su animali vivi (caratteristiche della carcassa e della
carne).
Esempio di MAS: gene Alotano nei suini è responsabile
della sindrome da stress (PSS) e del difetto PSE. Si è
scoperto la causa è una mutazione del gene CRC (Calcium
Release Channel).
La risposta alla selezione effettuata con i microsatelliti è
più elevata nelle prime generazioni di selezione. A seguito
dell’aumento delle frequenze alleliche fino alla fissazione
degli alleli favorevoli del QTL, la varianza genetica residua
della popolazione diminuisce e con questa la possibilità di
risposta nel lungo periodo.
L’impiego della MAS comporta un guadagno di tempo,
arrivando prima alla fissazione del QTL nella popolazione.
La riduzione della risposta alla MAS nel lungo periodo non
si ha se è applicata nelle fasi o in gruppi di animali in cui
non si applica selezione fenotipica (es. preselezione tori
destinati al progeny test).
ANALISI PATERNITÀ CON
MICROSATELLITI
In corrispondenza di ogni marcatore, con 4 alleli per locus, la
probabilità che due individui abbiano la stessa combinazione di
alleli nel medesimo locus sarà del 12,5%
Se aumentiamo il numero dei marcatori la probabilità che due
individui presentino la stessa combinazione di alleli per tutti i
loci diventa piccolissima.
Numero loci
(marcatori)
Probabilità di matching
(stesso profilo)
1
12.5 %
2
1.56 %
3
0.19 %
4
0.02 %
5
0.0030 %
10
0.00000005 %
DNA fingerprinting
Utilizzando contemporanemente più marcatori si
ottengono profili allelici in grado di identificare
in modo univoco gli individui
impronte digitali del DNA
Due alleli del microsatellite
PADRE
GENOTIPO: 263/263
GENOTIPO: 128/140
PADRE
128
263
GENOTIPO: 128/146
GENOTIPO: 263/277
MADRE
MADRE
128
263
146
277
FIGLIO
263
GENOTIPO: 128/128
128
GENOTIPO: 263/263
FIGLIO
140
FIGLIO
GENOTIPO: 124/128
124
128
GENOTIPO: 263/277
FIGLIO
263
277
FIGLIO
GENOTIPO: 128/128
128
DIAGNOSI POSITIVA
DIAGNOSI NEGATIVA